專利名稱：聚合酶天然底物結(jié)合法測定單點(diǎn)dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定DNA序列中單個堿基的序列，特別是應(yīng)用于檢測與分析多態(tài)性(SNP)。
背景技術(shù)：
最近人類基因組測序的基本完成，以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的出現(xiàn)，被公認(rèn)將極大地加快確認(rèn)導(dǎo)致復(fù)雜疾病如糖尿病、癌癥和心血管疾病的遺傳變異的過程。結(jié)果之一就是將開發(fā)出更準(zhǔn)確全面的診斷和預(yù)測，以及對于疾病的更安全有效的治療。SNP指的是在同一物種不同個體之間，在同一DNA位點(diǎn)上的核苷酸的不同(多態(tài)性)。SNP是最常見的遺傳變異，在所有物種中都存在，目前在人類中的研究最為深入。在人類基因組中SNP的發(fā)生頻率大約為1/1300堿基對。SNP是能引發(fā)人類疾病的穩(wěn)定突變，與藥物的有效性和毒理性有關(guān)，而且不同族裔的SNP也不相同。另外最新的研究表明SNP可以作為遺傳標(biāo)記有效地發(fā)現(xiàn)疾病基因。具體來說，在有三十億個堿基對的人類基因組中掃描一個或一些與疾病易感性、藥物毒性、藥物有效性等有關(guān)的遺傳標(biāo)記，就象大海撈針一樣。目前公認(rèn)有效的是一個三階段使用SNP標(biāo)記逐步定位的方法。第一步是使用低分辨率連鎖圖譜確認(rèn)與目標(biāo)疾病有高連鎖的一個1至3分摩根長度的遺傳區(qū)間。第二步是利用高分辨率SNP通過疾病相關(guān)性研究在上述遺傳區(qū)間內(nèi)確認(rèn)與目標(biāo)疾病相關(guān)的基因。第三步則是對這些基因內(nèi)的SNP的超細(xì)定位，確定可以用于疾病診斷的SNP及以其為基礎(chǔ)的進(jìn)一步研發(fā)。
因?yàn)镾NP有廣泛的用途，它的發(fā)現(xiàn)(discovery)、鑒定(validation)和測定(detection)就成為一種普遍需要。由于有無數(shù)多的病人和樣品，對于多達(dá)幾萬個甚至幾十萬個SNP進(jìn)行測定，如何簡單、經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模、高通量地發(fā)現(xiàn)、鑒定和測定SNP就成為最近幾年研究者們努力解決的問題，關(guān)于這方面的新方法和專利也不斷涌現(xiàn)。下面我們對一些主要的方法做一個簡單介紹(參考了美國專利5,952,174的一些描述)。
1)DNA測序最明顯的方法莫過于對于包含SNP位點(diǎn)本身及其臨近區(qū)域的DNA序列直接進(jìn)行測序。這種測序可以通過兩種方法來實(shí)現(xiàn)，即“雙脫氧核苷酸鏈?zhǔn)街兄狗ā?，也稱作“山格Sanger法”(Sanger，F(xiàn).，et al.，J.Mol.Biol.94441(1875))，和“化學(xué)降解法”，也稱作“馬克西姆-基爾伯特Maxam-Gilbert法”(Maxam，A.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)74560(1977))。對于特定基因組序列的擴(kuò)增放大，例如多聚酶鏈合反應(yīng)，可以幫助對于目標(biāo)多聚核苷酸鏈的收集及其測序。不過這類方法相對來說費(fèi)用較高，通量較低。
2)核苷酸外切酶抗性法(Exonuclease Resistance)曼迪Mundy，C.R.(美國專利號4,656,127)的方法使用了對于核苷酸外切酶具有特別抗性的核苷酸衍生物。首先從一個特定動物、人類或其他個體獲得目標(biāo)DNA，然后一個與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，并且其3’端正好位于目標(biāo)SNP位點(diǎn)的前一個核苷酸的引物被使用與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交。如果目標(biāo)SNP點(diǎn)的核苷酸與某種特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物互補(bǔ)，那么這種核苷酸衍生物就會在多聚酶的作用下被接合在上述雜交上的引物末端。這種接合可以使得雜交上的引物對核苷酸外切酶具有抗性，從而被檢測到。由于具體使用的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物的種類已知，那么如果一個引物在某種核苷酸衍生物的作用下具有核苷酸外切酶抗性，那么就可以揭示目標(biāo)SNP點(diǎn)的核苷酸正好與使用的核苷酸衍生物具有互補(bǔ)關(guān)系。曼迪方法的優(yōu)點(diǎn)在于它不需要測定大量額外的序列。其缺點(diǎn)則在于擴(kuò)增的目標(biāo)DNA和未結(jié)合的引物都將被核苷酸外切酶所破壞，以及該方法對于特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物在多聚酶作用下的接合反應(yīng)的速率的極其敏感性。
3)微測序法(Microsequencing Methods)近年來，以引物來引導(dǎo)的核苷酸結(jié)合方式來分析DNA多態(tài)位點(diǎn)的幾種方法相繼出現(xiàn)(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids Res.177779-7784，(1989)；Sokolov，B.p.，Nucl.Acids Res.183671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 81143-1147(1991)；Prezant，T.R.，et al.，Hum.Mutat.1159-164(1992)；Ugozzoll，L.et al.，GATA 9107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208171-175(1993))。這些方法要么依賴于帶放射標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的結(jié)合以及特殊的磁珠，要么依賴于雙脫氧核苷酸的使用。其共同點(diǎn)是在一個末端正好位于測定位點(diǎn)前的引物上結(jié)合單個核苷酸，并測定該結(jié)合核苷酸的種類從而推斷出測定位點(diǎn)的核苷酸。
4)液相雙脫氧核苷酸延伸法科恩等人(Cohen，D.et al.)(法國專利號2,650,840；PCT申請?zhí)朩O91/02087)討論了一種液相測定一個多態(tài)位點(diǎn)堿基的方法。該方法與前述的曼迪方法(美國專利號4,656,127)非常類似，不過不是使用對于核苷酸外切酶具抗性的核苷酸衍生物，而是帶標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物。
科恩方法有一個顯著的缺陷在于它是一個使用帶標(biāo)記三磷酸雙脫氧核苷酸的液相延伸反應(yīng)。通常目標(biāo)DNA模版要經(jīng)過一步擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR，而這一過程要使用高濃度的DNA聚合酶天然底物即三磷酸脫氧核苷酸。這些單體將會在接下來的延伸反應(yīng)中和三磷酸雙脫氧核苷酸進(jìn)行競爭。因此，在PCR之后，需要一個額外的步驟來將目標(biāo)DNA模版與未結(jié)合的三磷酸脫氧核苷酸分開，亦即清除掉多余的三磷酸脫氧核苷酸單體，而這一步在液相中很難實(shí)現(xiàn)，也因此該方法不適用于大容量測試。
5)固相雙脫氧核苷酸延伸法另一種可選擇的方法，被稱為GBA法，是格列特等人(Goelet，P.et al.)所發(fā)明的(PCT申請?zhí)?2/15712)。在一個更可取的實(shí)施方案中，格列特等人的方法使用了帶標(biāo)記的終止物的混合體，以及一個與目標(biāo)DNA互補(bǔ)并且其3’端正好位于目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)的前一個核苷酸的引物。這樣能夠與引物結(jié)合的終止物就由被測定位點(diǎn)的核苷酸所決定，而且實(shí)際上是與其互補(bǔ)。與前述科恩方法(法國專利號2,650,840；PCT申請?zhí)朩O91/02087)相反，格列特等人的方法的更可取之處在于它是一種多相方法，其中引物或者目標(biāo)DNA是固定在一個固相上。因此該方法更容易操作，也比科恩方法更精確。
6)寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法另一種固相測定SNP的方法使用了不同的酶學(xué)方法，稱作“寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法”(Oligonucleotide Ligation Assay，簡稱OLA方法)(Landegren，U.et al.，Science241077-1080(1988))。OLA方法使用了與一個目標(biāo)DNA的單鏈上的兩個毗連序列可以雜交的兩個寡核苷酸鏈。其中一個寡核苷酸鏈經(jīng)過生物素處理，另一個則加有可檢測的標(biāo)記。如果在目標(biāo)DNA上有一個完全互補(bǔ)的序列，這兩個寡核苷酸鏈將與目標(biāo)DNA雜交，并且它們的末端將毗連從而形成一個連接反應(yīng)的底物。接下來的連接反應(yīng)就使得帶標(biāo)記的寡核苷酸鏈能被阿維丁(avidin)或者另一種生物素配體結(jié)合在另一個寡核苷酸鏈上，并從而被檢測到。尼科松等人(Nickerson，D.A.et al.)描述了一種結(jié)合PCR和OLA的檢測核苷酸的方法(Nickerson，D.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)878923-8927(1990))。在這個方法里，目標(biāo)DNA首先用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用OLA方法來檢測。這種分析要求對于目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)的每個dNTP都要用與其配套的一對寡核苷酸鏈來分開檢查。OLA方法的主要缺點(diǎn)在于連接反應(yīng)不是一個具有高識別率的過程，因而非特異性的信號是一個大問題。
值得肯定的是，絕大多數(shù)上述的方法都要求有聚合酶來將一個核苷酸衍生物結(jié)合到引物的末端。目前所需要的是開發(fā)一個更有選擇性的方式來分辨多態(tài)位點(diǎn)。我們這里報(bào)告的發(fā)明是為了滿足這方面的要求。
發(fā)明的描述本發(fā)明提供了一種通過將單鏈DNA分子與一個寡核苷酸引物雜交，再利用聚合酶分別將不同的帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)在上述引物上結(jié)合延伸的方法來測定上述DNA分子上單個預(yù)先選定位點(diǎn)的序列的方法，包括以下幾個步驟a)將一份或多份上述單鏈DNA分子與一份或多份上述寡核苷酸引物一起雜交，此處上述單鏈DNA分子包含有上述單個預(yù)先選定位點(diǎn)，并且在上述預(yù)先選定位點(diǎn)的3’端有18或以上個核苷酸；同時(shí)上述寡核苷酸引物長度為20個左右，與上述單鏈DNA互補(bǔ)，并且其3’端正好位于上述單個預(yù)先選定位點(diǎn)的前一個核苷酸；b)將上述雜交產(chǎn)物與一個核苷酸聚合酶一起培養(yǎng)，并加以一種帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸，這樣如果上述這種三磷酸脫氧核苷酸正好與上述單個預(yù)先選定位點(diǎn)的核苷酸互補(bǔ)，那么一個由聚合酶調(diào)節(jié)的結(jié)合延伸反應(yīng)將會發(fā)生，上述帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸將會被結(jié)合到上述雜交產(chǎn)物中的上述寡核苷酸引物上；c)測定帶有上述標(biāo)記的延伸反應(yīng)產(chǎn)物是否產(chǎn)生；d)以不同的帶標(biāo)記三磷酸脫氧核苷酸重復(fù)上述聚合酶調(diào)節(jié)的結(jié)合延伸反應(yīng)，如果所有四種三磷酸脫氧核苷酸都重復(fù)，就可以測定上述單個預(yù)先選定位點(diǎn)的序列和多態(tài)性。
本發(fā)明使用了一個與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，并且其3’端正好位于目標(biāo)SNP位點(diǎn)的前一個核苷酸的引物。在將目標(biāo)DNA擴(kuò)增，并用該引物與目標(biāo)DNA雜交后，用聚合酶來將一個或多個帶標(biāo)記的同一種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)試圖結(jié)合到引物的末端進(jìn)行延伸。如果檢測到延伸得到的這種核苷酸，即說明在多態(tài)位點(diǎn)的核苷酸與被結(jié)合的核苷酸互補(bǔ)。
不同種類的核苷酸是分開進(jìn)行這種結(jié)合反應(yīng)，即在每次延伸中只使用一種帶標(biāo)記的核苷酸。這樣對于每個延伸反應(yīng)只需關(guān)注是否可以檢測到標(biāo)記信號，從而使得檢測非常簡單和有針對性。
本發(fā)明用于延伸反應(yīng)的是聚合酶的天然底物三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)，而不是其他方法通常使用的衍生物如三磷酸雙脫氧核苷酸(ddNTP)。一般來說這些衍生物也是延伸反應(yīng)的終止物。例如，一旦一個三磷酸雙脫氧核苷酸(ddNTP)結(jié)合到引物上，其他的三磷酸雙脫氧核苷酸(ddNTP)或三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)就不能再結(jié)合上去。這種測定單個結(jié)合產(chǎn)物的方法被應(yīng)用在前面所述的微測序法上，來判定一個位點(diǎn)的序列。在本發(fā)明中，使用三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)并且不局限于單個結(jié)合延伸同樣可以達(dá)到目的，因?yàn)獒槍Σ煌塑账岬难由旆磻?yīng)是分開進(jìn)行的即每次只有一種底物(dNTP)，這樣如果發(fā)生單個延伸反應(yīng)后就只有兩種可能一是多態(tài)位點(diǎn)后面的核苷酸與位點(diǎn)本身不一樣，那么只有多態(tài)位點(diǎn)上會結(jié)合一個與其互補(bǔ)的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)，即延伸反應(yīng)將在一個dNTP后自然終止；另一種可能是多態(tài)位點(diǎn)后面好有一到多個核苷酸與位點(diǎn)本身一樣，那么除了在多態(tài)位點(diǎn)上會結(jié)合一個與其互補(bǔ)的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)外，同一種三磷酸脫氧核苷酸還能繼續(xù)結(jié)合直到下一個不一樣的目標(biāo)DNA鏈上的三磷酸脫氧核苷酸，而這并不影響檢測的結(jié)果。因此實(shí)際上如果一個結(jié)合延伸反應(yīng)能夠發(fā)生，那么在目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)上的核苷酸一定是與所加的帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸互補(bǔ)?？傊?，利用帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)來分別進(jìn)行延伸反應(yīng)，可以檢測到引物后面位點(diǎn)，即待測多態(tài)位點(diǎn)的核苷酸序列。
本發(fā)明可以用于液相檢測，而更優(yōu)選的實(shí)施方案是在固相中進(jìn)行。
本發(fā)明中對不同三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)的標(biāo)記可以是用相同的標(biāo)記，而更優(yōu)選的實(shí)施方案是加以不同的標(biāo)記，以增加檢測的方便。
對于絕大部分SNP檢測來說，只需要使用兩種不同的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)。顯然，如果使用所有四種dNTP，本發(fā)明的方法可以用來測定一個位點(diǎn)的核苷酸序列。因此，本發(fā)明并不局限于測定SNP。
在另一個實(shí)施方案中，可以使用任何不會導(dǎo)致延伸反應(yīng)終止的三磷酸脫氧核苷酸衍生物，而不是只限于三磷酸脫氧核苷酸本身。
在另一個實(shí)施方案中，對于三磷酸脫氧核苷酸的標(biāo)記不只是限于通常的熒光標(biāo)記，而可以是任何可檢測到的標(biāo)記如放射性標(biāo)記，生物發(fā)光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，核苷酸標(biāo)記，半抗原標(biāo)記和酶標(biāo)記。
本發(fā)明也可以用來檢測從多個個體中取得的混合樣品，而且這些樣品可以是來自于基因組DNA(genomic DNA)，環(huán)形DNA，cDNA，EST，或?qū)ζ溥M(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；或者是來自于對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的結(jié)果。
本發(fā)明可以大規(guī)模操作，如用來同步測定多達(dá)數(shù)千個甚至數(shù)十萬個位點(diǎn)的序列和SNP，并且可以實(shí)現(xiàn)高通量操作。一般來說這是通過生物芯片來實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種通過將單鏈DNA分子與一個寡核苷酸引物雜交，再利用聚合酶分別將不同的帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)在所述引物上結(jié)合延伸的方法來測定所述DNA分子上單個預(yù)先選定位點(diǎn)的序列的方法，包括以下幾個步驟e)將一份或多份所述單鏈DNA分子與一份或多份所述寡核苷酸引物一起雜交，此處所述單鏈DNA分子包含有所述單個預(yù)先選定位點(diǎn)，并且在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的3’端有18或以上個核苷酸；同時(shí)所述寡核苷酸引物長度為20個左右，與所述單鏈DNA互補(bǔ)，并且其3’端正好位于所述單個預(yù)先選定位點(diǎn)的前一個核苷酸；f)將所述雜交產(chǎn)物與一個核苷酸聚合酶一起培養(yǎng)，并加以一種帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸，這樣如果所述這種三磷酸脫氧核苷酸正好與所述單個預(yù)先選定位點(diǎn)的核苷酸互補(bǔ)，那么一個由聚合酶調(diào)節(jié)的結(jié)合延伸反應(yīng)將會發(fā)生，所述帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸將會被結(jié)合到所述雜交產(chǎn)物中的所述寡核苷酸引物上；g)測定帶有所述標(biāo)記的延伸反應(yīng)產(chǎn)物是否產(chǎn)生；h)以不同的帶標(biāo)記三磷酸脫氧核苷酸重復(fù)所述聚合酶調(diào)節(jié)的結(jié)合延伸反應(yīng)，如果所有四種三磷酸脫氧核苷酸都重復(fù)，就可以測定所述單個預(yù)先選定位點(diǎn)的序列和多態(tài)性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中對于確認(rèn)或檢測SNP來說，使用與該SNP兩至四種可能核苷酸互補(bǔ)的三磷酸脫氧核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中部分反應(yīng)是在固相中進(jìn)行。
4.權(quán)利要求3的方法，其中寡核苷酸引物是固定在一個固相上。
5.權(quán)利要求1的方法，其中用于標(biāo)記三磷酸脫氧核苷酸的標(biāo)記選自放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、核苷酸標(biāo)記、半抗原標(biāo)記或酶標(biāo)記。
6.權(quán)利要求1的方法，其中對于不同的三磷酸脫氧核苷酸用相同的標(biāo)記。
7.權(quán)利要求1的方法，其中對于不同的三磷酸脫氧核苷酸用不相同的標(biāo)記。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述單鏈DNA分子是來源于同一個體的不同染色體，或者是來源于不同個體的染色體。
9.權(quán)利要求1或8的方法，其中所述單鏈DNA分子是經(jīng)過了以另一個單鏈或雙鏈核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述單鏈DNA分子是使用一對PCR引物，dNTP混合物以及核苷酸聚合酶來對包含所述單個預(yù)先選定位點(diǎn)的核酸片斷進(jìn)行擴(kuò)增。
11.權(quán)利要求9的方法，其中擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過清洗以去除多余的dNTP混合物。
12.權(quán)利要求9的方法，其中用于擴(kuò)增的核酸模板選自基因組DNA(genomic DNA)、環(huán)形DNA、cDNA、EST。
13.權(quán)利要求9的方法，其中用于擴(kuò)增的核酸模板是RNA，使用的聚合酶是反轉(zhuǎn)錄酶。
14.權(quán)利要求9的方法，其中用于擴(kuò)增的DNA或RNA模板來自一個或多個個體。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定脫氧核糖核酸(DNA)序列中單個堿基的序列，特別是應(yīng)用于檢測與分析多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明公開了一種通過將單鏈DNA分子與一個寡核苷酸引物雜交，再利用聚合酶分別將不同的帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)在所述引物上結(jié)合延伸的方法來測定所述DNA分子上單個預(yù)先選定位點(diǎn)的序列的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1446927SQ0211633
公開日2003年10月8日 申請日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者劉湘軍 申請人:劉湘軍