專利名稱：一種檢測端粒酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測端粒酶的活性的方法，尤其是通過檢測人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(簡稱hTERT，即human Telomerase Reverse Transcriptase)中某段結(jié)構(gòu)域，來確定端粒酶的活性的方法，從而為端粒酶的活性檢測提供一個精確、簡便的方法，對臨床腫瘤診斷和預后評估，以及對細胞系的基礎(chǔ)研究，具有重要的意義。
人類端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，自身帶有模板，是一種核酸蛋白復合體，主要由RNA亞單位hTR(human Telomerase，人類端粒酶)和催化亞單位hTERT組成，其作用是hTERT以其自身的hTR為模板，合成端粒的重復序列，通過延長端粒來保持染色體的穩(wěn)定[The telomerasereverse transcriptasecomponents and regulation GENES &DEVELOPMENT，121073-1085(1998)]。端粒酶活性同細胞的增殖相關(guān)，而同細胞的表型(正?；蛘吣[瘤，良性或者惡性)無關(guān)，所以目前認為端粒酶活性是增殖細胞的標志物。
除造血干細胞、子宮內(nèi)膜細胞等外，人的正常體細胞是不具有端粒酶活性的，但85～95％的腫瘤細胞、人類胚胎干細胞和增殖中的成體干細胞具有端粒酶活性[Specific association of human telomerase activity withimmortal cells and cancer，Science 2662011-2015(1994)；Telomerase activityin human germline and embryonic tissues and cells.Dev-Genet.18173-179(1996)；Asurvey oftelomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，33787-791(1997)；Telomerase activity，cell proliferation，and cancer Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9590-92(1998)]，因而端粒酶活性已經(jīng)成為判斷增殖細胞存在的一種標志物，例如腫瘤細胞和干細胞。所以端粒酶活性檢測在腫瘤的診斷、治療和預后的評估等方面顯示出極大的應用價值。隨著干細胞研究的深入，人們越來越希望通過轉(zhuǎn)染得到永生化的干細胞系。無論在建立相應細胞系還是檢測干細胞，同端粒酶的聯(lián)系越來越緊密了。因而如何對端粒酶活性的準確判斷也越來越重要了。
只有hTR和hTERT共同存在時，細胞才具有端粒酶的活性。在進一步的研究中，人們發(fā)現(xiàn)，hTR并不是端粒酶陽性細胞所特有的，而是廣泛存在于各種類型的細胞中，而hTERT只存在于端粒酶陽性的細胞中。研究證明，hTERT是端粒酶活性的限定性部分，即只有hTERT的表達，細胞才能具有端粒酶的活性[Catalytic subunit of telomerase expression isrelated to RNA component expression.FEBS Letters，460285-288(1999)]。所以，近年來的研究主要是集中于對hTERT的研究。
在對hTERT的研究中，確認細胞具有端粒酶的活性是研究的首要工作。因為只有確認有端粒酶的活性，才能確定有hTERT的存在。目前檢測端粒酶活性的方法，主要有三種TRF、RT-PCR和TRAP。1、TRF(Terminal restriction fragment length-measurement，即染色體末端內(nèi)切酶片段長度測量法)[參見Clonal Heterogeneity in Telomerase Activity and TelomereLength in Tumor-Derived Cell Lines，Proceedings of the Society forExperimental Biology and Medicine 223379-388(2000)]原理通過測量端粒重復序列的長度，間接測定端粒酶的活性。
方法1)提取DNA；2)酶切(HinfI等)；3)0.8％瓊脂糖電泳；4)TTAGGG探針雜交；5)計算機程序處理。
缺點過程復雜，成本高，不準確，需要連續(xù)的觀察。不適用于臨床檢測。目前這種方法僅局限在實驗室使用，而且已經(jīng)很少應用了。2、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR方法)是一種半定量方法。(參見文獻同上)方法1)提取總RNA；2)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；3)利用特定引物對hTR和hTERT的cDNA進行PCR，并設立內(nèi)參對照；4)PAGE電泳，EB染色。
缺點PCR盡管比較靈敏，但是反應條件不易控制，重復性差，容易出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果。并且涉及到要提取RNA，實驗條件要求嚴格。3、TRAP(Telomeric repeat amplification protocol，即端粒重復序列擴增法)，是1994年Kim等基于PCR原理建立的。目前國內(nèi)外檢測端粒酶所采用的主要手段，是對端粒酶活性的直接檢測。[參見Kim-NW等，Specific association of human telomerase activitywith immortal cells and cancer，Science，1994 Dec 23；266(5193)2011-5]原理端粒酶在體外可以其自身RNA的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿基的重復序列，用PAGE凝膠電泳可顯示6個堿基的差異梯帶。
TRAP方法的進展(1)同位素法采用放射性核素(如P)標記的dGTP/dCTP摻入；(Kim)(2)染色法電泳后，用EB染色，在紫外透射儀下觀察；(3)熒光法將熒光素標記到引物上，擴增后，PAGE電泳，利用計算機軟件進行分析；(4)ELISA法引物TS 5’端標記生物素，PCR后，利用地高辛標記的探針雜交擴增產(chǎn)物，顯色后，利用酶標儀進行測定。
TRAP的不足(1)利用細胞提取液，不能進行組織定位，不利于臨床病理檢測，也不適用于對成體干細胞的研究；(2)由于采用PCR為實驗的基礎(chǔ)，易出現(xiàn)假陰性和假陽性率；(3)對于大量樣品來說，其重復性差，成本高。
原位雜交是經(jīng)典的實驗方法。原來主要是應用于基因的染色體定位，現(xiàn)在越來越多的應用在對細胞內(nèi)的mRNA表達的檢測，從而判斷其編碼的目的蛋白是否在該細胞或組織中表達。這種方法能更快、更準確的檢測出所要研究的目的蛋白的表達情況，而且實驗周期短(從發(fā)現(xiàn)其mRNA到制作出探針)。但是，這種方法僅限于對mRNA的檢測，目前還沒有人利用該方法檢測hTERT mRNA表達來判斷端粒酶活性，同時也未見到有人選擇motif-T相對應的cDNA做探針，用其來檢測端粒酶活性及其拼接變異的相關(guān)報道。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，從已知具有端粒酶活性的人類細胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR技術(shù)，用合成的特異性PCR引物，特異的擴增含motif-T編碼序列的cDNA片段，經(jīng)純化后，重組到T-easy質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化、篩選、酶切鑒定、測序確認為是目的序列后，(測序部分結(jié)果見附

圖1)，純化質(zhì)粒。
用內(nèi)切酶從質(zhì)粒上切下片段作為模板，標記序列，合成雙鏈的cDNA探針。鑒定、純化和測定滴度。
探針與已知的端粒酶陽性和陰性細胞或組織進行原位雜交呈色，在熒光顯微鏡下觀察，檢測是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而通過確定是否具有端粒酶的活性，來檢驗該探針的有效性。
在此基礎(chǔ)上，使用該探針對其他大量的臨床腫瘤樣品和實驗室的永生化細胞系進行檢測，評價其是否存在端粒酶的活性。
由于對motif-T的檢測是結(jié)構(gòu)性檢測，測量結(jié)果的靈敏度和特異性強，從而為細胞的端粒酶的活性檢測提供一個精確、簡便的方法，因而本發(fā)明在腫瘤的診斷、治療和預后的評估等方面，以及對細胞系的基礎(chǔ)研究，都具有十分重要的應用價值。
上述技術(shù)方案中，PCR引物的設計是保證探針制備的關(guān)鍵，其PCR產(chǎn)物motif-T片斷是探針的主體。也可通過其它分子生物學技術(shù)獲得。
含motif-T的重組T-easy質(zhì)粒可通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)氨卞青霉素篩選、酶切鑒定和測序確認為是目的序列后(測序結(jié)果見附圖1)，使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒，成批制備探針。
motif-T探針的標記，可以采用缺口平移、同位素標記、末端標記等分子生物學技術(shù)進行。本發(fā)明選用缺口平移的方法制備。
本發(fā)明中的已知具有端粒酶活性的細胞可以是人類細胞，本發(fā)明優(yōu)選人類胚胎腎細胞293細胞(human embryonic kidney cell line 293，HEK-293)。因為293細胞為端粒酶陽性的細胞系，而且hTERT mRNA的豐度很高(即表達量很高)，并且沒有報導在轉(zhuǎn)錄水平上有拼接變異的報道(目前認為只有在腫瘤細胞中檢測到了拼接變異，文獻參考說明書中相應的部分)，因而模板mRNA正常且穩(wěn)定，可保證擴增出來的片段序列正確。
本發(fā)明中可以使用M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney murineleukemin virus)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
本發(fā)明標記序列時，可以將帶有地高辛的核苷酸(DIG-11-dUTP)標記到序列中。并且在檢測時，通過標有熒光素的抗地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-Fluorescein Fab Fragments，來自于羊)來顯色。
本發(fā)明的原理在于hTERT是端粒酶活性的限定部分，與酶的活性呈線形相關(guān)，[Catalytic subunit of telomerase expression is related to RNAcomponent expression.FEBS Letters，460285-288(1999)]，通過對hTERT基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的檢測，確定細胞或組織是否具有端粒酶的活性。
hTERT是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其蛋白一級結(jié)構(gòu)含有8個結(jié)構(gòu)域，即motif-1、2、A、B’、C、D、E和T，其中motif-T為端粒酶所特有的，其他的為逆轉(zhuǎn)錄酶所共有的motif數(shù)目。motif-A、B’、和C中的一部分組成了端粒酶的活性中心(三聯(lián)天冬氨酸)，而motif-T的作用是連接RNA亞單位[The telomerase reverse transcriptasecomponents and regulationGENES&DEVELOPMENT，121073-1085(1998)；Telomerases.CurrentOpinion in Structural Biology，956-65(1999)]。
對hTERT轉(zhuǎn)錄水平進行研究時發(fā)現(xiàn)，在具有端粒酶活性的腫瘤細胞中，其轉(zhuǎn)錄子中存在著大量的拼接變異，主分為兩類，即插入和缺失，并且主要集中于mRNA的3’端，而5’端，即motif-T及相臨區(qū)域?qū)膍RNA穩(wěn)定。這些變異將導致翻譯出來的蛋白無酶活性，是端粒酶活性調(diào)節(jié)的一個重要方面。但是，這種拼接變異只存在于hTERT表達的腫瘤細胞或者組織中[Isolation of a candidate human telomerase catalyticsubunit gene，which reveals complex splicing pattems in different cell types.Human Molecular Genetics，62011-2019(1997)；Telomerase activity inhuman development is regulated by human telomerase reverse transcriptase(hTERT)transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts.CancerRes.，584168-4172(1998)；Genomic organization and promotercharacterization of the gene encoding the human telomerase reversetranscriptase(hTERT)Gene，23297-106(1999)]。
hTERT中motif-T為端粒酶所特有的結(jié)構(gòu)域，是與RNA亞單位相結(jié)合的位點，與motif-A、B’、C同樣為端粒酶活性表達的重要位點，選擇motif-T相對應的cDNA做探針，可以充分反映端粒酶的活性。
采用本發(fā)明提供的方法檢測端粒酶活性的優(yōu)點在于1、本發(fā)明中所選取的motif-T序列，在研究中沒有發(fā)現(xiàn)缺失或者插入等變異現(xiàn)象，motif-T相對應的cDNA做成的探針，結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定，所得到的信號會比其他結(jié)構(gòu)域的探針要穩(wěn)定，而現(xiàn)有實驗中經(jīng)常采用的檢測序列，檢測結(jié)果并不十分穩(wěn)定，所以本發(fā)明在端粒酶活性判斷上具有較高的準確性。
2、檢測方法操作簡便，穩(wěn)定性好，并且可以對大量樣品同時進行可重復性的操作。
3、采用本發(fā)明方法測量的結(jié)果，靈敏度和特異性強，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果，克服了現(xiàn)有檢測方法的缺點。
4、由于對motif-T的檢測是結(jié)構(gòu)性檢測，因而可以在樣品中進行定位，明確哪些結(jié)構(gòu)和細胞中存在hTERT的轉(zhuǎn)錄，即具有端粒酶活性，具有一定的精確性，十分方便于臨床檢測和干細胞研究。
5、本發(fā)明選用熒光素檢測，可節(jié)約時間，操作簡便，便于臨床對腫瘤的篩查、治療效果的檢測和基礎(chǔ)研究中的應用。
具體實施例方式在本實驗中所使用的，取總RNA利用Trizol試劑(Promega公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(GiBco公司)，PCR產(chǎn)物及探針純化試劑盒ConcertTMRepid PCR Purification System(Bochinger Mannheim公司)，T-easy質(zhì)粒(Promega公司)，質(zhì)粒的純化試劑盒為High Pure PlasmidIsolation Kit For mini preparations(GiBco公司)，所用的內(nèi)切酶均來自于Promega公司，酶切片段的回收試劑盒(CONCERTTMGel ExtractionSystems)(GiBco公司)，缺口平移標記試劑盒(DIG-Nick TranslationMix)，和標有熒光素的抗地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-Fluorescein FabFragments來自于羊)等均為Roch公司產(chǎn)品。實施例1motif-T探針的制備制備過程(1)從人類胚胎腎細胞293細胞(human embryonic kidney cell line 293，HEK-293)中提取總RNA，用M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney murine leukemin virus)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR技術(shù)，用合成的特異性引物，特異的擴增含motif-T編碼序列的151bp的cDNA片段，經(jīng)純化后，重組到T-easyvector中，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，經(jīng)氨卞青霉素篩選、酶切鑒定和測序確認為是目的序列后，使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒。(2)用PvuII內(nèi)切酶從質(zhì)粒上切下約600bp的片段作為模板，利用缺口平移方法將帶有地高辛的UTP(DIG-11-dUTP)標記到序列中，合成雙鏈的cDNA探針。(3)在進一步的電泳鑒定、探針純化和滴度測定后，對已知的端粒酶陽性和陰性細胞或者組織進行原位雜交，通過標有熒光素的抗地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-Fluorescein Fab Fragments，來自于羊)顯色。(4)在熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長為494nm，發(fā)射波長為523nm)，細胞核為藍色，胞漿中含有大量的綠色熒光顆粒，且熒光強度高。
實驗結(jié)論說明使用已知具有端粒酶活性的HEK293細胞所制備的探針具有端粒酶活性，并且活性較高?？梢杂脕頇z測其他未知細胞是否具有端粒酶活性。實施例2HEK293細胞的端粒酶活性檢測實驗細胞HEK293細胞一、細胞準備、固定和通透(注意所有的溶液應該用Rnase抑制因子處理)1、用37℃的PBS細胞，在室溫下，固定細胞；其中固定液的組成4％多聚甲醛、5％醋酸、0.9％NaCl2.在室溫下用PBS洗細胞30分鐘；3.在雜交前按如下的方法處理細胞(1)脫水70％、90％和100％乙醇；(2)脫脂100％二甲苯(3)水化100％、90％、70％(4)用PBS沖洗；4.增加通透性37℃使用通透液，處理增加通透性；其中通透液的組成0.1％胃蛋白酶、0.1NHCl5.后固定(1)用PBS洗滌5分鐘；(2)使用1％多聚甲醛后固定10分鐘；(3)再用PBS洗滌。二、原位雜交1.在80℃將實施例1中的探針變性，后將探針加入到雜交液中，終濃度為5ng/ul；雜交液組成60％去離子甲酰胺、300mMNaCl、30mM檸檬酸鈉、10mMEDTA、25mMNaH2PO4(pH＝7.4)、5％硫酸葡聚糖、250ng/ul鮭魚精子DNA)2.向固定細胞樣品上加10ul帶有探針的雜交液，覆蓋18*18mm蓋玻片。3.37℃在濕盒中進行雜交16小時。三、洗滌1.雜交后，除去蓋玻片，在室溫下將載玻片放到溶液中搖床上搖；洗滌溶液組成60％甲酰胺、300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉2.重復步驟1在室溫下洗三次；在37℃洗一次。3.最后，PBS洗5分鐘。四、免疫熒光顯色1.封閉向每一張載玻片上加100ul阻止液，并蓋上蓋玻片；并放在濕盒中。
封閉液組成100Mm Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.5％(w/v)封閉劑2.去除蓋玻片，簡單用溶液洗滌；3.加上含有抗體的阻止液，放到濕盒中，45分鐘；4.洗滌；溶液組成100Mm Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.05％Tween205.脫水脫水70％、90％和100％乙醇；每個濃度5分鐘；6.空氣干燥；7.用帶有抗褪色劑溶液包埋樣片；比例為甘油∶抗褪色劑＝1∶9抗褪色溶液1M Tris-HCl(pH＝7.5)、2％DABCO、DAPI(75ng/ul)8.在熒光顯微鏡下面觀察(激發(fā)波長為494nm，發(fā)射波長為523nm)，細胞核為藍色，胞漿中含有大量的綠色熒光顆粒，且熒光強度高。實驗結(jié)論說明HEK293細胞具有端粒酶活性，并且活性較高。實施例3神經(jīng)干細胞的端粒酶活性檢測實驗細胞神經(jīng)干細胞G3一、細胞準備、固定和通透(注意所有的溶液應該用Rnase抑制因子處理)1.用37℃的PBS細胞，在室溫下，固定細胞；固定液的組成4％多聚甲醛、5％醋酸、0.9％NaCl2.在室溫下用PBS洗細胞30分鐘；3.在雜交前按如下的方法處理細胞1)脫水70％、90％和100％乙醇；2)脫脂100％二甲苯3)水化100％、90％、70％4)用PBS沖洗；4.增加通透性37℃使用通透液，處理增加通透性；通透液的組成0.1％胃蛋白酶、0.1N HCl5.后固定4)用PBS洗滌5分鐘；5)使用1％多聚甲醛后固定10分鐘；6)再用PBS洗滌。二、原位雜交。1.在80℃將實施例1中的探針變性，后將探針加入到雜交液中，終濃度為5ng/ul；雜交液組成60％去離子甲酰胺、300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉、10mM EDTA、25mM NaH2PO4(pH＝7.4)、5％硫酸葡聚糖，250ng/ul鮭魚精子DNA)2.向固定細胞樣品上加10ul帶有探針的雜交液，覆蓋18*18mm蓋玻片。3.37℃在濕盒中進行雜交16小時。三、洗滌1.雜交后，除去蓋玻片，在室溫下將載玻片放到溶液中搖床上搖；2.重復步驟1在室溫下洗三次；在37℃洗一次。3.最后，PBS洗5分鐘。四、免疫熒光顯色1.封閉向每一張載玻片上加100ul阻止液，并蓋上蓋玻片；并放在濕盒中。
封閉液組成100mM Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、0.5％(w/v)封閉劑2.去除蓋玻片，簡單用溶液洗滌；3.加上含有抗體的阻止液，放到濕盒中，45分鐘；4.洗滌；5.脫水70％、90％和100％乙醇；每個濃度脫水5分鐘；6.空氣干燥。7.用帶有抗褪色劑溶液包埋樣片；比例為甘油∶抗褪色劑＝1∶99.在熒光顯微鏡下面觀察(激發(fā)波長為494nm，發(fā)射波長為523nm)，細胞核為藍色，胞漿中含有綠色熒光顆粒，且熒光強度高。結(jié)論說明神經(jīng)干細胞具有端粒酶活性，并且活性較高。實施例4子宮頸癌組織的端粒酶活性檢測實驗組織子宮頸癌組織(北京大學腫瘤所提供)(方法一)冰凍切片(方法二)石蠟切片雜交過程同上。結(jié)果在腫瘤組織部位的細胞中，胞漿中有彌漫的綠色熒光顆粒，熒光強度較高；而周圍的癌旁組織中沒有綠色熒光。結(jié)論子宮頸癌組織細胞具有端粒酶活性，而癌旁的正常組織細胞不具有端粒酶的活性。實施例5陰性對照實驗實驗細胞人類成纖維細胞實驗過程同上。結(jié)果細胞中沒有檢測到綠色熒光。結(jié)論該細胞中不具有端粒酶的活性。
權(quán)利要求
1.一種檢測端粒酶活性的方法，包括以下步驟(1)從已知具有端粒酶活性的人類細胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR技術(shù)，用合成的特異性PCR引物，特異的擴增含motif-T編碼序列的cDNA片段，經(jīng)純化后，重組到質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定、測序，確認為是目的序列后，純化質(zhì)粒；然后(2)用內(nèi)切酶從質(zhì)粒上切下片段作為模板，標記序列，合成雙鏈的cDNA探針，鑒定、純化和測定探針滴度；然后(3)探針與已知的端粒酶陽性和陰性細胞或組織進行原位雜交呈色，在熒光顯微鏡下觀察，檢測是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而通過確定是否具有端粒酶的活性，來檢驗該探針的有效性；然后(4)使用該探針對其他大量的臨床腫瘤樣品和實驗室的永生化細胞系進行檢測，評價其是否存在端粒酶的活性。
2.權(quán)利要求1所述的一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于所述的PCR引物所生成的PCR產(chǎn)物motif-T片斷是探針的主體，也可通過其它分子生物學技術(shù)獲得。
3.權(quán)利要求1所述的一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于所述的含motif-T的重組質(zhì)粒可通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)氨卞青霉素篩選、酶切鑒定和測序確認為是目的序列后，使用試劑盒提取并純化質(zhì)粒，成批制備探針。
4.權(quán)利要求1所述的一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于所述的標記序列，可以采用缺口平移、同位素標記、末端標記等分子生物學技術(shù)進行。
5.權(quán)利要求1所述的一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于所述的標記序列，可以將帶有地高辛的核苷酸標記到序列中。
6.權(quán)利要求1所述的一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于所述的檢測是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄時，可以通過標有熒光素的抗地高辛抗體顯色。
7.權(quán)利要求1所述的一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于所述的人類細胞為人類胚胎腎細胞293細胞。
8.權(quán)利要求1所述的一種檢測端粒酶活性的方法，其特征在于所述的反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測端粒酶活性的方法，通過提取細胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆含有motif－T的cDNA序列的目的片段，合成特異探針，進行原位雜交，然后檢測是否有hTERT mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而確定是否具有端粒酶的活性。由于對motif－T的檢測是結(jié)構(gòu)性檢測，測量結(jié)果的靈敏度和特異性強，從而為端粒酶的活性檢測提供一個精確、簡便的方法，因而本發(fā)明在腫瘤的診斷、治療和預后的評估等方面，以及對細胞系的基礎(chǔ)研究，都具有十分重要的應用價值。
文檔編號C12Q1/25GK1450170SQ0211646
公開日2003年10月22日 申請日期2002年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月5日
發(fā)明者王亞軍, 沈麗 申請人:北京科宇聯(lián)合干細胞生物技術(shù)有限公司