專利名稱：一種眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白的融合可溶表達(dá)、重組毒素的酸解釋放及其純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白的融合可溶表達(dá)、重組神經(jīng)毒素蛋白的酸解釋放及其純化方法，屬生化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛇毒神經(jīng)毒素依它們與神經(jīng)肌肉接頭關(guān)系的不同分為突觸前神經(jīng)毒素和突觸后神經(jīng)毒素。突觸后神經(jīng)毒素是被研究的最多的一種神經(jīng)毒素。眼鏡蛇突觸后神經(jīng)毒素為一類煙堿樣受體的蛋白阻斷劑，主要作用于尼克酰胺乙酰膽堿受體(外周N受體)和神經(jīng)元α7受體。近年來(lái)，純化的眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白在臨床上用于鎮(zhèn)痛取得良好的效果，在戒毒治療方面也展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。因此克隆得到眼鏡蛇突觸后神經(jīng)毒素基因，研究重組神經(jīng)毒素的表達(dá)有重要的意義。
突觸后神經(jīng)毒素有許多共同點(diǎn)1)在結(jié)構(gòu)上十分相似，都具有“三指結(jié)構(gòu)”，二硫鍵含量高；2)理化性質(zhì)相近，全是堿性蛋白，性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)熱及許多化學(xué)試劑有抗性，沒有酶活性；3)與受體結(jié)合方式相似，專一性強(qiáng)，只能特異結(jié)合于尼克酰胺乙酰膽堿受體。
突觸后神經(jīng)毒素根據(jù)它們的氨基酸序列和與受體的結(jié)合特點(diǎn)可以分為長(zhǎng)鏈和短鏈神經(jīng)毒素二種類型。短鏈神經(jīng)毒素含有60--62個(gè)氨基酸和4對(duì)二硫鍵，它僅與肌型尼克酰胺乙酰膽堿受體有較強(qiáng)的結(jié)合力(圖1a)。長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素含有71--74個(gè)氨基酸和5對(duì)二硫鍵，它與肌型和α7神經(jīng)元尼克酰胺乙酰膽堿受體都有很高的結(jié)合力(圖1b)。長(zhǎng)鏈和短鏈神經(jīng)毒素中有4對(duì)二硫鍵的配對(duì)是相似的，長(zhǎng)鏈毒素中的第5對(duì)二硫鍵在29--33位氨基酸之間。
突觸后神經(jīng)毒素一級(jí)結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是分子由60--75個(gè)氨基酸組成，含有4--5對(duì)二硫鍵(圖1)。一級(jí)結(jié)構(gòu)中有一些高度保守的氨基酸，在短鏈神經(jīng)毒素中，除8個(gè)Cys的位置不變外，Ser-8，Lys-27，Trp-29，Arg-33，Arg-36在大部分毒素中也是保守的。而在長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素中，除10個(gè)Cys外，Lys-23，Trp-25，Asp-27，Arg-33也都是保守氨基酸。
神經(jīng)毒素的二級(jí)結(jié)構(gòu)中不含α螺旋，主要由5條反平行的β-折疊構(gòu)成，β折疊通過大量的氫鍵維系在一起，含量達(dá)到40％(圖3)。
X射線和NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定的研究結(jié)果表明，在晶體和溶液狀態(tài)的許多神經(jīng)毒素都具有相似的結(jié)構(gòu)，都是由4個(gè)二硫鍵形成一個(gè)疏水核心，從此核心伸出3個(gè)由二硫鍵限定的環(huán)(圖2，黃色表示Cys及二硫鍵)，這種結(jié)構(gòu)形象地被稱之為“三指結(jié)構(gòu)”(threefingers)，與其他一些具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白一起被稱為“三指蛋白”。長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素在中間環(huán)的尖端還有一個(gè)由第五對(duì)二硫鍵構(gòu)成的小環(huán)(圖2b)。它們構(gòu)象的最主要特點(diǎn)為整個(gè)分子是由中間環(huán)II的兩條片斷和環(huán)III的片斷形成的三鏈β折疊片層結(jié)構(gòu)(圖3)。長(zhǎng)鏈和短鏈神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)的最大差別在于長(zhǎng)鏈毒素的環(huán)II的環(huán)中間有一對(duì)額外二硫鍵，在頂部形成一個(gè)小環(huán)。
最近的研究表明這對(duì)二硫鍵形成的小環(huán)對(duì)于長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素與α7神經(jīng)元受體的結(jié)合是必需的(Servent，D.，et al.2000)。
基因工程技術(shù)的發(fā)展使得通過培養(yǎng)細(xì)菌或者真細(xì)胞的方法大量生產(chǎn)稀有蛋白成為可能，用基因工程的方法表達(dá)生產(chǎn)重組神經(jīng)毒有兩個(gè)目的1)對(duì)神經(jīng)毒素進(jìn)行定點(diǎn)突變，研究尼克酰胺乙酰膽堿受體與激活劑和拮抗劑的作用方式，作用位點(diǎn)；同時(shí)對(duì)長(zhǎng)鏈和短鏈神經(jīng)毒素的功能位點(diǎn)與受體結(jié)合的功能位點(diǎn)進(jìn)行研究。
2)獲得大量可用于臨床的重組神經(jīng)毒素，可以使毒素的來(lái)源不受自然條件的制約。
對(duì)蛇類神經(jīng)毒素的表達(dá)主要有兩種方式分泌表達(dá)和形成包涵體融合蛋白。分泌表達(dá)得率較低，純化過程復(fù)雜，并且一些突變體不能分泌表達(dá)；而包涵體表達(dá)需進(jìn)行復(fù)性，而后BrCN除去N端融合部分。
Erabutoxina(Ea)的分泌型融合載體表達(dá)融合蛋白ZZ--Ea分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，離心去除菌體，上清0.2μm濾膜過濾，10,000Dalton膜超濾，IgG-Sepharose親和純化，融合蛋白凍干溶于0.1N鹽酸中，500倍過量BrCN裂解后，依次反向柱純化，離子交換純化。最終重組蛋白得率為每升培養(yǎng)液為0.025～0.5mg。用該方法生產(chǎn)Erabutoxin的系列突變體，詳盡研究短鏈神經(jīng)毒素與nAChR受體結(jié)合的功能位點(diǎn)(Trē meau，o.，et al.，1995)。
對(duì)a-cobratoxin的表達(dá)是將基因克隆入pCP載體中，由E.coli菌株BL(DE3)融合表達(dá)，融合蛋白由IgG-Sepharose親和純化，BrCN裂解，復(fù)性，反向C4柱純化。重組蛋白得率為每升培養(yǎng)液為0.5～1.2mg。生產(chǎn)表達(dá)的重組α-cobratoxin和它的突變體，用以研究長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素的功能位點(diǎn)(Antil，S.，et al.1999；Servent，D.，et al.，2000)。
Cobrotoxin用pET20b(+)表達(dá)后，形成包涵體，用變性劑溶解，復(fù)性，高效液相純化，但于BrCN同時(shí)裂解融合肽，導(dǎo)致重組的神經(jīng)N端不均一，用帶的N端融合肽的重組神經(jīng)毒素研究Cobrotoxin的異構(gòu)化(Chang，L-S.，et al.，1999)。
三種同源的眼鏡蛇神經(jīng)毒素用pET28b+進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白形成包涵體，用鹽酸胍溶解，經(jīng)兩步透析復(fù)性，將帶有融合肽的重組蛋白凍干濃縮，用于測(cè)定毒素的小鼠的致死毒性(Zhong，X-Y.，et al.，2000)。
為了具體進(jìn)行本發(fā)明的后續(xù)工作，研究人員首先對(duì)本發(fā)明涉及的天然眼鏡蛇神經(jīng)毒素的理化性質(zhì)及序列進(jìn)行測(cè)定。
在上述測(cè)定中，眼鏡蛇神經(jīng)毒素凍干粉由濟(jì)南軍區(qū)藥品生物制品研究提供。乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2MΩ)。毛細(xì)管電泳柱75μm×57cmFS為Supleco公司產(chǎn)品。福氏佐劑(Freund`s Adjuvant)為Gibcol公司產(chǎn)品。TFA，TEMED，過硫酸銨，丙烯酰胺和N，N′-甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自Sigma公司。SDS-PAGE低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司。
所使用的電泳儀為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品，Mini proteinII型電泳槽及制膠模具為Bio-Rad產(chǎn)品。蛋白測(cè)序儀為PE公司ABI 337 Sequencing，質(zhì)譜儀為英國(guó)Autospec-UltimaETOF。毛細(xì)管電泳儀為Beckman P/ACE System 5000。高效液相色譜HPLC為Shimazu公司產(chǎn)品。反向色譜柱為ZORBAX 300 SB-C8。GDS-8000凝膠圖像處理系統(tǒng)為UVP公司產(chǎn)品。
具體的實(shí)驗(yàn)方法如下SDS-PAGE電泳溶液配制丙烯酰胺溶液(30％)取丙烯酰胺60g與N，N′-甲叉雙丙烯酰胺1.6g，加水溶解，定容至200ml，濾紙過濾，棕色瓶中避光保存。
分離膠緩沖液取Tris 36.3g，加水70ml溶解，鹽酸調(diào)pH至8.8，定容至100ml。
濃縮膠緩沖液取Tris 6.0g，加水70ml溶解，鹽酸調(diào)pH至6.8，定容至100ml。
電極緩沖液取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1.0g，加水800ml溶解后，定容至1000ml。
SDS溶液(20％)取SDS 20g，加水70ml溶解，定容至100ml。
過硫酸銨液(10％)取過硫酸銨1g，加水8ml溶解，定容至10ml。
溴酚藍(lán)溶液(0.1％)取0.1g溴酚藍(lán)100ml容量瓶中，加水溶解，定容至刻度。
2X樣品緩沖液取濃縮膠緩沖液2.5ml，20％SDS溶液2.5ml，0.1％溴酚藍(lán)溶液1.0ml，甘油3ml，巰基乙醇1.0ml，混勻，密閉，4℃保存。
固定液取冰乙酸400ml，甲醇100ml，加水500ml混勻。
脫色液取冰乙酸100ml，加水900ml，混勻。
染色液取考馬斯亮藍(lán)G-250 0.1g，溶于500ml脫色液中，充分溶解后，過濾除去不溶物，密閉保存。
凝膠制備16％分離膠制備安裝垂直板制膠模具，將分離膠液(丙烯酰胺溶液∶分離膠緩沖液∶SDS溶液∶過硫酸銨溶液∶水∶TEMED＝5.0∶1.52∶0.08∶0.1∶5.3∶0.01)灌入模具內(nèi)，至玻璃頂部約3cm處。用水封頂，聚合完畢，傾去水層。
濃縮膠的制備在分離膠上灌入濃縮膠液(丙烯酰胺溶液∶濃縮膠緩沖液∶SDS溶液∶過硫酸銨溶液∶TEMED∶水＝0.83∶1.25∶0.025∶0.05∶0.005∶2.37)，插入樣品梳，聚合完畢，小心取出樣品梳。
樣品制備取樣品溶液適量，加入等體積的2X樣品緩沖液，95℃水浴5分鐘，冷卻后，離心，備用。
上樣及電泳上下電泳槽加入電極緩沖液，每個(gè)樣品分別加入20μl樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，設(shè)起始電壓為80V，待溴酚藍(lán)帶出濃縮膠后，調(diào)電壓至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)距玻璃板邊緣為1cm時(shí)，停止電泳。
固定，染色及脫色電泳結(jié)束后，取下玻璃板，凝膠加入適量固定液，室溫固定30分鐘。倒掉固定液，加入適量染色液，染色1小時(shí)后，倒掉染色液，用脫色液脫色至背景透明。換水浸泡，停止脫色。
圖象處理用圖象處理系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行成像，蛋白純度分析和定量。
反向液相色譜流動(dòng)相A0.1％TFA有水溶液；B含0.1％TFA，80％乙腈的水溶液色譜柱ZORBAX 300 SB-C8柱溫36℃流速1.0ml/min進(jìn)樣體積50μl洗脫方式起始用100％A平衡色譜柱15分鐘后，以1％B/min增加B至60％，維持10分鐘，然后100％B洗柱10分鐘后。恢復(fù)初始狀態(tài)，二級(jí)管陣列全波長(zhǎng)檢測(cè)。
毛細(xì)管自由區(qū)帶電泳以0.1mol/L的pH2.5磷酸鹽緩沖液為電極液，毛細(xì)管為75μm×57cmFS，柱溫設(shè)為25℃，運(yùn)行電壓為1.4kV，進(jìn)樣壓力0.5psi，5秒，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為210nm。
N端氨基酸序列測(cè)定對(duì)蛋白中的Cys進(jìn)行衍生化處理后，依儀器標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，采用PVDF膜固相Edman測(cè)序法。
質(zhì)譜經(jīng)脫鹽的樣品溶于含50％甲醇，0.1％的乙酸的水溶液中，依儀器標(biāo)準(zhǔn)程序電噴霧進(jìn)樣，正離子檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)所得到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素分子量，純度及紫外光譜特征如下
SDS-PAGE電泳測(cè)定的神經(jīng)毒素表觀分子量為16,500daltons，其純度大于95％(圖4)。而電噴霧質(zhì)譜測(cè)定其分子量為6946daltons(圖5)。Chang，L.S.，等(1996)認(rèn)為cobrotoxin的23-28位氨基酸之間的片斷與其他殘基的相互作用導(dǎo)致這類神經(jīng)毒素電泳的異常。
自由區(qū)帶毛細(xì)管電泳純度大于98％(圖6)。反向高效液相色譜測(cè)定純度大于98％(圖7a)，主峰保留時(shí)間在24.3min，主峰的全波長(zhǎng)掃描(190-800nm)特征吸收在202nm和276nm(圖7b)。
眼鏡蛇神經(jīng)毒素的N端序列測(cè)定的神經(jīng)毒素N端15個(gè)氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Glu-Cys-His-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Thr-Pro-Thr-Thr-Thr(序列1)。
本發(fā)明所采用的天然眼鏡蛇神經(jīng)毒素為從湖南產(chǎn)中華眼鏡蛇蛇毒中提取純化的，為白色無(wú)定形凍干粉末，易吸濕潮解，在-20℃密閉保存。
對(duì)它從三方面進(jìn)行純度及性質(zhì)分析SDS-PAGE，RP-HPLC和毛細(xì)管自由區(qū)帶電泳。用不同方法測(cè)定的純度均大于95％，蛋白序列測(cè)定要求純度大于95％，符合蛋白序列測(cè)定的要求。同時(shí)獲得了在C8柱的色譜保留特征和毛細(xì)管區(qū)帶電泳的遷移特征。在276nm有特征吸收，說(shuō)明蛋白有芳香族氨基酸。由于神經(jīng)毒素異常的電泳行為，進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜測(cè)定其確切分子量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白的融合表達(dá)、重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白的酸解釋放及其生產(chǎn)純化方法。
以下是本發(fā)明所述方法的詳細(xì)內(nèi)容，通過以下內(nèi)容并結(jié)合圖及其說(shuō)明，可以清楚地了解本發(fā)明。一、一種眼鏡蛇神經(jīng)毒素基因的克隆及其在三種不同E.coli載體中的表達(dá)研究基于蛋白質(zhì)個(gè)性的豐富多樣，沒有一種載體對(duì)所有蛋白的表達(dá)是通用的，適用于表達(dá)某種蛋白的載體對(duì)另一種蛋白則未必適合，所以本發(fā)明通過以下實(shí)驗(yàn)尋找適合本發(fā)明所述目的蛋白的表達(dá)載體。1、材料及儀器1.1試劑及耗材總RNA(核糖核酸)提取試劑盒RNeasy Mini Kit為德國(guó)QIAgen公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄PCR(聚合酶鏈反應(yīng))試劑盒SUPERSCRIPTMONE-STEPTMRT-PCR System購(gòu)自Gibcol公司。小量及大量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程公司。DNA PCR System和AP偶聯(lián)羊抗兔抗體為華美生物工程公司的產(chǎn)品。引物由上海生工生物工程公司合成。內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)New England Biolab公司。T4 DNA連接酶購(gòu)自德國(guó)Boehringer Mannheim公司。pGEM-T Easy Vector System為Promega公司產(chǎn)品。PVDF膜購(gòu)自Gelman公司。酶標(biāo)板為Nunc 96孔平底板。
1.2菌株及質(zhì)粒E.coli BL21購(gòu)自Amersham Pharmacia公司。E.coli菌株TOP10，pBAD/gIII載體為Invitrogen公司產(chǎn)品。融合表達(dá)載體pThioHis C由本所疫苗二室提供，載體pBV220和E.coli菌株DH5α，HB101由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院八所提供。
1.3儀器PCR儀為英國(guó)Techne公司Cyclogene Thermal Cycler，Multiphor II電轉(zhuǎn)裝置為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1眼鏡蛇毒腺總RNA(核糖核酸)提取蛇毒腺提取湖南產(chǎn)中華眼鏡蛇平皿法采蛇毒液后，斷頭法處死，迅速摘取兩側(cè)毒腺，去掉附帶肌肉后投入液氮中，速凍。液氮中保存。
總RNA(核糖核酸)提取依RNeasyMini Handbook進(jìn)行。
2.2 PCR(聚合酶鏈反應(yīng))引物設(shè)計(jì)根據(jù)測(cè)定的神經(jīng)毒素N端15個(gè)氨基酸的序列，用Blast Search檢索同源蛋白。分析同源蛋白序列，找出保守氨基酸及相應(yīng)核苷酸序列，由同源蛋白cDNA兩側(cè)保守區(qū)，設(shè)計(jì)RT-PCR引物，應(yīng)用Primer Calculator軟件對(duì)引物進(jìn)行評(píng)估。選取最佳的一對(duì)引物進(jìn)行合成。
引物15’ ATG CTG GAA TGT CAC AAC CAA C(序列2)引物25’ CTA ATT GTT GCA TCT GTC TGT T(序列3)根據(jù)評(píng)估結(jié)果設(shè)定PCR(聚合酶鏈反應(yīng))反應(yīng)常數(shù)。
2.3 RT-PCR按試劑盒說(shuō)明依次加入25μl反應(yīng)緩沖液，正向及反向引物各1μl，1-5μl總RNA(核糖核酸)，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶和Tap酶混合物，加水至總體積為50μl。50℃溫育35分鐘，94℃熱變性2分鐘，完成反轉(zhuǎn)錄；以94℃變性30秒，41℃退火30秒，72℃延伸26秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間為7分鐘。電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。
2.4 T-A載體克隆及測(cè)定分別取RT-PCR產(chǎn)物0.2，1.0μl，加5μl 2x連接緩沖液，1.0μl pGEM-T Easy載體，1.0μl T4-DNA連接酶，加水至總體積為10μl。室溫連接3.5小時(shí)。取連接產(chǎn)物2-8μl轉(zhuǎn)化感受態(tài)的JM109 E.coli細(xì)胞，以質(zhì)粒pGEM-5f轉(zhuǎn)化受體菌為陰性對(duì)照，涂布IPTG/X-Gal平板，37℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，進(jìn)行藍(lán)白篩選。挑選白色菌落，提取質(zhì)粒，Ecorl酶切初步鑒定。測(cè)定插入片斷全序列。
2.5克隆入融合表達(dá)載體pThioHis C及融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)2.5.1神經(jīng)毒素基因兩端分別加Kpn I和Sal I位點(diǎn)(陰影中的堿基序列) 以含神經(jīng)毒素基因的T載體為模板進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸26秒，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。Kpn I和Sal I酶切PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物，回收DNA，作為插入片斷。
2.5.2載體雙酶切及連接轉(zhuǎn)化pThioHis C載體提取，Kpn I和Sal I雙酶切，載體膠回收等，依常規(guī)程序進(jìn)行。電泳估計(jì)酶切載體及插入片斷的濃度，以不同量的載體與等量的插入片斷進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10 E.coli，37℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑選幾個(gè)單菌落測(cè)序，確定插入片斷正確連入載體中。
2.5.3神經(jīng)毒素融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)接種單菌落至50mlLB液體培養(yǎng)基(100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶50接種至新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體OD600約為0.5。加入IPTC至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)四個(gè)小時(shí)。在加入IPTC前和加入后每隔1小時(shí)取0.1ml菌液，離心，棄去上清，菌體分別標(biāo)記為0，1，2，3，4，5小時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。加入2x SDS-PAGE上樣緩沖液0.1ml，充分混勻，95℃水浴加熱10分鐘。20μl上樣，電泳檢查。
2.5.4融合蛋白的滲透休克釋放接種單菌落至50mlLB液體培養(yǎng)基(100μg/ml氨芐青霉素)中，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶50接種至新鮮LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至菌體OD600約為0.5。加入IPTG至濃度為1mmol/L。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。測(cè)定菌體OD600值，4℃ 6,000rpm離心收集菌體，棄上清，將菌體懸浮于適量冷滲透休克1#溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA，20％蔗糖)，使菌體密度OD600約為5.0，冰水浴，10分鐘。離心，棄去上清，菌體懸浮于等量的冷滲透休克2#溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA)，冰水浴，10分鐘。4℃ 10,000rpm離心15分鐘，取上清，-20℃凍存。蛋白電泳檢查。
2.5.5不同宿主菌對(duì)融合表達(dá)的影響得取含神經(jīng)毒素基因的pThioHis C載體，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21，誘導(dǎo)表達(dá)，滲透休克按2.5.4節(jié)所述。比較 E.coli菌株TOP10和BL21對(duì)融合蛋白表達(dá)的差異。
2.6分泌型載體pBAD/gIII表達(dá)神經(jīng)毒素2.6.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)pBAD/gIII載體插入?yún)^(qū)域?yàn)?-BamHI--信號(hào)肽-NdoI-Ecl136I-XhoI-XbaI，設(shè)計(jì)引物a1，a2擴(kuò)增出片斷aBamHI--信號(hào)肽-XboI神經(jīng)毒素基因5’端密碼子轉(zhuǎn)換，不改變編碼氨基酸，增加XhoI位點(diǎn)，3’端增加XbaI位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物b1，b2擴(kuò)增出片斷bXhoI---神經(jīng)毒素基因--XbaI 將擴(kuò)增出片斷a和b通過Xho I連接，形成片斷cBamHI---信號(hào)肽-神經(jīng)毒素基因-XbaI，以此片斷為模板，以a1，b2為引物大量擴(kuò)增片斷c。BamHI和XhoI雙酶切片斷c和載體質(zhì)粒pBAD/gIII，連接，將神經(jīng)毒素基因恰好插入信號(hào)肽之后，構(gòu)建完成分泌型表達(dá)質(zhì)粒。
2.6.2表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建合成引物a15’CGCGGA TCCTAC CTG ACG CTT(序列8)a25’CCGCTC GAGGCT ATG GCT AT(序列9)b15’CCGCTC GAGTGT CAC AAC CAA C(序列10)b25’GCTCT AGATTA ATT GTT GCA TCT GT(序列11)引物溶于無(wú)菌純水濃度為50pmol/L.
擴(kuò)增片斷a0.5μl模板pBAD/gIII，引物a1，a2各0.5μl，PCR(聚合酶鏈反應(yīng))緩沖液5μl，dNTP 4μl，加上50μl，混勻。94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸26秒，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
擴(kuò)增片斷b0.5μ模板含神經(jīng)毒素基因的pGEM-T載體，退火溫度為58℃，其它條件同擴(kuò)增片斷a。
片斷a和b連接依常規(guī)操作進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物純化，XhoI酶切。電泳估測(cè)a和b的濃度，以1∶1設(shè)置連接反應(yīng)，4℃，T4DNA連接酶連接過夜。
a和b連接片斷擴(kuò)增取連接產(chǎn)物1.0μl模板，引物a1和b2各0.5μl，退火溫度為55℃，其它條件同擴(kuò)增片斷a。片斷a和b連接產(chǎn)物為c。
載體與插入片斷的連接，轉(zhuǎn)化及篩選片斷c用BamHI和XhoI雙酶切，純化后作為插入片斷。pBAD/gIII用BamHI和XhoI雙酶切，凝膠電泳分離回收大片斷。分別插入片斷0.1，1.0μl，與5μl載體混勻，加1.0U T4DNA連接酶，4℃，連接過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10受體菌，涂布平板，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，挑選單菌落，酶切鑒別插入子，測(cè)序。
2.6.3神經(jīng)毒素的誘導(dǎo)表達(dá)接種單菌落至10mlLB液體培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。次日1∶50轉(zhuǎn)接至新鮮的6支4ml LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體密度OD600約為0.5。分別加入阿拉伯糖至濃度為0.2％，0.02％，0.002％，0.0002％，0.00002％，另一個(gè)為空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，4℃高速離心收集菌體。1)SDS-PAGE電泳檢查表達(dá)情況。2)全菌超聲凍融法破碎，檢查表達(dá)蛋白是否可溶。3)滲透休克法檢查表達(dá)蛋白是否可以周質(zhì)腔釋放。
2.7溫度誘導(dǎo)型裝載體pBV220對(duì)神經(jīng)毒素的表達(dá)2.7.1神經(jīng)毒素基因兩端加EcoR I和sal I位點(diǎn)及起始密碼ATG合成引物5’CGG GAA TTC GAT TAT GCT GGA ATG(序列12)5’GGC GAC GAC TTA ATT GTT GCA TCT(序列13)攜帶神經(jīng)毒素基因的T載體為模板1.0μl，退火溫度為50℃，其他條件同2.6.2節(jié)所述。電泳檢查，純化PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物。
2.7.2表達(dá)載體的構(gòu)建PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物及質(zhì)粒pBV220用EcoR I和sal I雙酶切，純化，連接，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α如2.5.2所述進(jìn)行。
2.7.3神經(jīng)毒素基因的熱誘導(dǎo)表達(dá)接種單菌落至10mlLB液體培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。次日1∶50轉(zhuǎn)化至新鮮LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體密度OD600約為0.5。升高溫度至42℃，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，每隔1小時(shí)1ml菌液，離心收集菌體。1)SDS-PAGE檢查神經(jīng)毒素表達(dá)情況。2)超聲凍融法檢查表達(dá)蛋白是否可溶。
2.8免疫印跡(western blot)檢查鑒定表達(dá)的重組神經(jīng)毒素2.8.1天然眼鏡蛇神經(jīng)毒素兔抗血清制備取神經(jīng)毒素適量，配成1.0mg/ml的濃度，甲醛減毒處理后，與適量完全佐劑混勻乳化，皮下注射免疫新西蘭種白兔，適時(shí)強(qiáng)化免疫。心臟取血，離心分離抗血清。
2.8.2間接ELISA檢查抗血清中神經(jīng)毒素抗體神經(jīng)毒素溶于PBSN溶液中(含0.5％NaN3PBS)中，制成1μg/ml和2μg/ml的溶液，以50μl/孔點(diǎn)酶標(biāo)板，輕彈使抗原均勻分布，保鮮膜封好，室溫溫育過夜。純水洗板3次后，加封阻液(含0.05％Tween 20，1mmol/L EDTA，0.25％BSA，0.05％NaN3的PBS)室溫放置1小時(shí)。純水洗板3次后，將抗血清及對(duì)照血清分別用PBSN溶液4倍比系列稀釋，取50μl加到每個(gè)包被孔中。保鮮膜封好，室溫溫育過夜。純水洗板3次。加用PBSN以1∶200稀釋的AP偶聯(lián)羊抗兔抗體50μl/孔，室溫溫育2小時(shí)后，洗板3次。每孔加顯色液(66μl 5％NBT溶于70％二甲基甲酰胺，33μl 5％BCIP溶于100％二甲基甲酰胺，在10ml封阻液中混勻)50μl顯色。酶標(biāo)儀在550nm測(cè)定每孔的吸收值。
2.8.3免疫印跡按標(biāo)準(zhǔn)程序(奧斯伯等，1998)進(jìn)行作如下修改用PVDF膜，以0.8mA/cm2的電流轉(zhuǎn)移1.5小時(shí)，抗血清以1∶200稀釋，酶標(biāo)抗體為AP偶聯(lián)羊抗兔抗體，以1∶500稀釋。顯色時(shí)間為30分鐘。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1天然毒素蛋白的同源性檢索及引物設(shè)計(jì)根據(jù)神經(jīng)毒素N端15個(gè)氨基酸的序列，Blast Search檢索同源蛋白結(jié)果如下，共檢索到22個(gè)蛋白序列。Databasent807,597sequences；2,863,827,885total lettersRID983778928-6701-21870Score ESequences producing significant alignments(bits)Valuegi/4867885/emb/AJ239050.1/NNA239050 Naja naja atra mRNA for...36 0.32gi/1326084/gb/U42582.1/NAU42582 Naja atra cobrotoxin mRNA，...36 0.32gi/12002777/gb/AF161797.1/AF161797 Naja atra short chain ne...36 0.32gi/6650220/gb/AF068052.1/AF068052 Naja naja neurotoxin prep...36 0.32gi/1399223/gb/U58519.1/NAU58519 Naja atra cobrotoxin`mRNA，...36 0.32gi/5524749/emb/Y12492.2/NACOBROTX Naja atra gene encoding c...36 0.32gi/1688230/gb/U77492.1/NAU77492 Naja atra cobrotoxin```mRN... 36 0.32gi/1399225/gb/U58520.1/NAU58520 Naja atra cobrotoxin``mRNA... 36 0.32gi/1688228/gb/U77491.1/NAU77491 Naja atra cobrotoxin``mRNA... 36 0.32gi/1399227/gb/U58521.1/NAU58521 Naja atra cobrotoxin```mRN... 36 0.32gi/1688226/gb/U77490.1/NAU77490 Naja atra cobrotoxin`mRNA... 36 0.32gi/4185751/gb/AF088998.1/AF088998 Naja atra cobrotoxin III... 35 0.55gi/2688935/gb/AF023271.1/AF023271 Naja sputatrix post synap...35 0.72gi/3860082/gb/AF096999.1/AF096999 Naja sputatrix post synap...35 0.72gi/3860086/gb/AF097001.1/AF097001 Naja sputatrix post synap...34 1.2gi/3860084/gb/AF097000.1/AF097000 Naja sputatrix post synap...34 1.2gi/2688937/gb/AF023272.1/AF023272 Naja sputatrix post synap...34 1.2gi/5419941/emb/Y13399.2/NAY13399 Naja atra gene encoding co...34 1.2gi/2625123/gb/AF031472.1/Naja atra cobrotoxin mRNA，comple... 34 1.2gi/804789/gb/L42002.1/NAJNEUR Naja naja(clone NTX1)neurot... 33 2.7gi/804791/gb/L42003.1/NAJNEURA Naja naja(clone NTX2)neuro... 32 4.7gi/4185749/gb/AF088997.1/AF088997 Naja atra cobrotoxinIV m... 32 8.0其中10種神經(jīng)毒素的氨基酸序列為(序列14-序列23) 成熟毒素蛋白的N端和C端用陰影框出。這10種蛋白分別來(lái)源于1 AJ239050 Naja naja atra mRNAfor cobrotoxin homolog2 U42582Naja atra cobrotoxin mRNA，complete cds3 AF161797 Naja atra short chain neurotoxin precursor，gene，complete cds4 AF068052 Najaj naja neurotoxin preprotein precursor，mRNA，complete cds5 U77492Naja atra cobrotoxin```mRNA，complete cds6 AF088998 Naja atra cobrotoxinIII mRNA，partial cds7 AF023271 Naja sputatrix post synaptic alpha neurotoxin precursor(ntx)mRNA，ntx-3 allele，complete cds8 AF031472 Naja atra cobrotoxin mRNA，complete cds9 AF088997 Naja atra cobrotoxinIV mRNA，partial cds10 AF096999 Naja sputatrix post synaptic alpha neurotoxin precursor(ntx)gene，ntx-1 allele，complete cds這些神經(jīng)毒素屬于眼鏡蛇科(Elapidae)的眼鏡蛇屬(Naja)的眼鏡蛇舟山亞種(Najanaja atra Cantor)和Naja sputatrix，都具有較高的同源性，它們的N端和C端保守性都很強(qiáng)。根據(jù)它們N端和C端的堿基序列設(shè)計(jì)合成引物，由Primer Calculator評(píng)估，挑選最佳的一對(duì)引物，結(jié)果如下Forward Primer Reverse PrimerATGCTGGAATGTCACAACCAAC TTGTCTGTCTACGTTGTTAATCA-8(36.36％) C-6(27.27％)A-3(13.64％)C-4(18.18％)G-4(18.18％) T-4(18.18％)G-6(18.18％)T-9(50.00％)Length-22 bases MW-6709 daltons(g/M) Length-22 bases MW-6694 daltons(g/M)TmTmNearest Neighber Tm62.12Nearest Neighber Tm52.23％GC method Tm52.97％GC method Tm49.252(A+T)+4(G+C)Tm64.002(A+T)+4(G+C)Tm60.00Forward Primer Reverse PrimerPrimers may fold and anneal against themselyes.A likely folding scenario is displayed below.
5`-ATGCTGGAATGT3` 5`-TTGTCTGTCTAC3`| ||| |3`CAAC-CAA CAC 5` 3`CTAATTGTTGPrimers may anneal with other copies of themselves.Below is a candidate alignment.5`ATGCTGGAATG TCACAACCAAAC3`5`TT G TCTGTCTA CGTTGTTAATC3`| ||| | ||| | || | | | ||| | | |3`--CAACCAAC--ACTGTAAGGTCGTA 3`--CTAATTGTTGCATCTGTCTGTT 5`Forward primers may anneal with reverse primers.A likely alignment is shown below.
5`--ATGCTGGA ATGTCACAACCAAAC3`| | || |||| |3`TTGTCTGTCT-A-CGTTGTTAATC5`3.2神經(jīng)毒素基因的克隆及全序列提取的蛇毒腺總RNA(圖8)及RT-PCR結(jié)果(圖9)，擴(kuò)增的主帶大小約為200bp。裝入pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化丁M109感受態(tài)細(xì)胞，攜帶插入片斷的重組質(zhì)粒呈白色，而空白質(zhì)粒呈藍(lán)色或淺藍(lán)色。平板上白色菌落約占98％。由于pGEM-T Easy載體插入點(diǎn)兩邊各有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。挑選8個(gè)白色菌落快速提取質(zhì)粒，EcoRI酶切鑒定都含有插入片斷(圖10)。
克隆的PCR產(chǎn)物片段及相鄰pGEN-T Easy載體序列如下(序列24) CCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGC虛線加框區(qū)為載體的EcoRI位點(diǎn)，加黑堿基為反轉(zhuǎn)錄引物。插入片斷編碼區(qū)為(序列25，其中的純氨基酸序列為序列26)ATG CTG GAA TGT CAC AAC CAA CAA TCA TCG CAA ACT CCA ACC ACTL E C H N Q Q S S Q T P T TACA GGT TGT TCA GGT GGG GAG ACC AAT TGC TAT AAA AAG CGT TGGT GC S G G E T N C Y K K R WCGT GAT CAC CGT GGA TAT AGA ACC GAG AGG GGA TGT GGT TGC CCTR DH R G Y R T E R G C G C PTCA GTG AAG AAC GGC ATT GAA ATT AAC TGT TGC ACA ACA GAC AGAS V K N G I E I N C C T T D RTGC AAC AAT TAGC NN stop克隆的PCR產(chǎn)物5’端編碼氨基酸序列與神經(jīng)毒素N端15個(gè)氨基酸序列相同，將堿基全序列轉(zhuǎn)譯為氨基酸序列，全序列與基因庫(kù)中cobrotoxin序列相同，含有該序列的p-GEM-T Easy載體命名為pGEM-NT。
3.3神經(jīng)毒素在pThioHisC中的融合表達(dá)3.3.1融合表達(dá)載體的構(gòu)建通過PCR反應(yīng)在神經(jīng)毒素蛋白基因兩端增加兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，從而將毒素蛋白基因連入載體中，序列測(cè)定證明神經(jīng)毒素基因正確連入載體中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTN314如圖11A。表達(dá)的融合蛋白由硫氧還蛋白，腸激酶識(shí)別位點(diǎn)，神經(jīng)毒素蛋白3部分組成。神經(jīng)毒素蛋白N端有兩個(gè)冗余的氨基酸Val和Pro。
3.3.2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pTN314有強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc，可由IPTG誘導(dǎo)融合蛋白。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期，OD600約為0.5時(shí)，加入IPTG至終濃為1mmol/L。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，融合蛋白的表達(dá)量也增加，培養(yǎng)5個(gè)小時(shí)后，融合蛋白表達(dá)量最大，約占菌體總蛋白的28％(圖12)，誘導(dǎo)時(shí)間與菌體生長(zhǎng)密度，融合蛋白表達(dá)量和融合蛋白占菌體中總蛋白的相對(duì)量的關(guān)系見圖13。在誘導(dǎo)后1小時(shí)內(nèi)和第2-3個(gè)小時(shí)內(nèi)，為融合蛋白表達(dá)量急劇增長(zhǎng)期，而在誘導(dǎo)3小時(shí)后，表達(dá)量趨于穩(wěn)定。菌體密度在誘導(dǎo)3小時(shí)后也基本穩(wěn)定，但表達(dá)蛋白量繼續(xù)增加。因此選擇誘導(dǎo)后培養(yǎng)4小時(shí)收集菌體。
3.3.3融合蛋白的滲透休克純化及不同菌株的表達(dá)差異收獲的菌體經(jīng)兩次滲透休克釋放融合蛋白，第一次約釋放總?cè)诤系鞍琢康?5.7％，第二次約釋放7.5％，約有16.8％的融合蛋白殘留在細(xì)胞中未被釋放。在第一次的滲透休克液體中，融合蛋白約占總蛋白的65％。
為了研究在不同菌株中該質(zhì)粒的表達(dá)，選擇轉(zhuǎn)化蛋白酶缺陷的E.coliBL(21)株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株也能高效表達(dá)融合蛋白，用滲透休克純化，釋放的融合蛋白量小于15％，80％的融合蛋白保留在細(xì)胞中(圖14，lane 1-3)。
滲透休克是一種簡(jiǎn)潔而高效的純化融合蛋白的方法，經(jīng)過一步純化，將蛋白釋放到低離子強(qiáng)度的緩沖液中，易于進(jìn)行下一步純化。
3.4神經(jīng)毒素在分泌型載體中的表達(dá)3.4.1分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建以pBAD/gIII載體為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出的信號(hào)肽片斷5’端有BamHI，緊接著信號(hào)肽后面為XhoI位點(diǎn)，該酶切位點(diǎn)同時(shí)編碼神經(jīng)毒素蛋白的N端前兩個(gè)氨基酸。而以pGEM-NT為模板，設(shè)計(jì)引物將神經(jīng)毒素基因5’端置換為XhoI位點(diǎn)，但不改變毒素蛋白的序列，3’端緊接終止密碼TAA后增加XbaI位點(diǎn)，將這兩個(gè)序列通過XhoI位點(diǎn)連接后，第二次PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增出大量的N端含信號(hào)肽的毒素基因的片斷。通過BamHI和XbaI位點(diǎn)將N端含有信號(hào)肽的神經(jīng)毒素基因單向連入載體。序列測(cè)定證明神經(jīng)毒素基因正確連入載體，重組質(zhì)粒pBAD-NT如圖16。
3.4.2神經(jīng)毒素的誘導(dǎo)表達(dá)pBAD/gIII質(zhì)粒是可調(diào)節(jié)的E.coli分泌型表達(dá)載體，gene III編碼絲狀噬菌體fd的一種小外殼蛋白，為長(zhǎng)18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，它可以穿過內(nèi)膜，將重組蛋白導(dǎo)入E.coli周質(zhì)腔中(Rfapoza&Webster，1993)。該質(zhì)粒由araC調(diào)節(jié)蛋白和阿拉伯糖啟動(dòng)子(PBAD)調(diào)控表達(dá)。當(dāng)存在阿拉伯糖時(shí)，PBAD激活轉(zhuǎn)錄，基因開始表達(dá)，而沒有阿拉伯糖時(shí)PBAD僅有非常低的轉(zhuǎn)錄水平(Lee，et al.，1987)。蛋白表達(dá)水平可以通過誘導(dǎo)物阿拉伯糖的濃度來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)(Guzman，L.M.，et al.1995)神經(jīng)毒素由阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)4小時(shí)后，收集菌體，菌體全蛋白電泳(圖17)，同時(shí)western blot檢測(cè)，結(jié)果表明，阿拉伯糖濃度為0.0002％(3.9，lane 4)時(shí)，可由免疫印跡檢測(cè)神經(jīng)毒素的表達(dá)，而濃度為0.02％時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最大。
超聲凍融法破碎菌體，以未誘導(dǎo)工程菌為對(duì)照，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)被誘導(dǎo)菌表達(dá)的蛋白集中于沉淀部分(圖18，A和B，Lane4)，上清中僅有微量的表達(dá)蛋白(A和B，Lane2)。對(duì)菌體進(jìn)行兩次滲透休克檢查，誘導(dǎo)菌表達(dá)的神經(jīng)毒素在第二次誘導(dǎo)后，僅有微量從周質(zhì)腔釋放(A和B，Lane8)。
3.5神經(jīng)毒素在pBV220中的溫度誘導(dǎo)表達(dá)3.5.1pBV220表達(dá)載體的構(gòu)建該載體含有PRPL高效串聯(lián)啟動(dòng)子，CIts857基因可以通過溫度變化，誘導(dǎo)PL啟動(dòng)子表達(dá)，可以轉(zhuǎn)化任何常用工程菌菌株(張智清等)，構(gòu)建的質(zhì)粒圖19。升高溫度后，在不同的誘導(dǎo)時(shí)間SDS-PAGE沒有檢測(cè)到神經(jīng)毒素的明顯表達(dá)(圖20)，更換宿主菌為蛋白酶缺陷的菌株BL(21)，仍然不能表達(dá)神經(jīng)毒素。將培養(yǎng)溫度降至30℃，28℃，25℃，最終仍未能檢測(cè)到神經(jīng)毒素的表達(dá)(data not shown)。
3.6天然神經(jīng)毒素兔血清抗體滴度的測(cè)定使用神經(jīng)毒素濃度為1μg/ml和2μg/ml時(shí)，抗血清以1/4系列稀釋(1/4，1/16，1/64，1/256，1/1024，1/4096)，間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果如圖21，當(dāng)抗血清稀釋倍數(shù)為256時(shí)(0.0039)，與空白血清差異最大，檢測(cè)特異性最高。因此在進(jìn)行western blot采用1∶250稀釋抗血清。
4小結(jié)表1三種載體對(duì)神經(jīng)毒素表達(dá)的比較

將神經(jīng)毒素基因裝入三種不同類型的表達(dá)載體中，比較它們的表達(dá)情況。融合表達(dá)顯著優(yōu)于其他兩種表達(dá)方式。因此選擇融合表達(dá)載體pTN314作為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。
由于載體類型不同，其表達(dá)方式也多種多樣，本發(fā)明所述的采用pTN314載體進(jìn)行融合表達(dá)的神經(jīng)毒素具有較高的表達(dá)量和可溶的表達(dá)形式，有利于富含二硫鍵的重組神經(jīng)毒素保持天然構(gòu)象。二、本發(fā)明所述的重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素融合蛋白融合位點(diǎn)的改造及重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素的酸解釋放本發(fā)明所述重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白從融合蛋白中釋放，要求在載體蛋白與目的蛋白之間有一個(gè)裂解位點(diǎn)。
在大部分融合表達(dá)載體中，該位點(diǎn)是一個(gè)特異的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，通常為凝血酶，腸激酶，因子Xa等蛋白酶的位點(diǎn)。pThioHis載體中在硫氧還蛋白的C端連接有腸激酶的識(shí)別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，切割裂解位點(diǎn)在Lys的C端。
酸解方法用于裂解融合蛋白，對(duì)重組目標(biāo)蛋白有兩個(gè)基本要求1)目標(biāo)蛋白應(yīng)耐酸，不應(yīng)含有酸敏感位點(diǎn)。2)耐熱，在溫度較高時(shí)蛋白能保持穩(wěn)定，或者溫度降低時(shí)，變性蛋白能恢復(fù)天然構(gòu)象。
重組牛腸激酶(EKMaxTM)是由醇母表達(dá)的牛腸激酶的催化亞基，一種具有高度專一性的絲氨酸蛋白酶，SDS-PAGE4表觀分子量為43,000Dalton，理論分子量為26,000Dalton，含有3個(gè)Asn基化位點(diǎn)。通常情況下對(duì)識(shí)別位點(diǎn)具有很高的特異性。
本發(fā)明對(duì)融合位點(diǎn)進(jìn)行改造是將融合蛋白插入突變，在目標(biāo)蛋白的前面加兩個(gè)氨基酸殘基(DP)，而它們之間的肽鍵對(duì)酸敏感，在低pH時(shí)，可自發(fā)斷裂，從而將N端冗余一個(gè)Pro的重組神經(jīng)毒素釋放出來(lái)。
1.試劑及材料重組牛腸激酶(EKMaxTM，EnterkinaseMaxTM)購(gòu)自Invitrogen公司。質(zhì)粒及PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物純化試劑盒QIAGE公司的QIAquickTMSpin，SSCS轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自上海生物工程公司。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1重組神經(jīng)毒素酶解法從融合蛋白釋放從6支0.5ml離心管中，各取純化的融合蛋白26μl(約20μg，融合蛋白生產(chǎn)純化方法見本發(fā)明說(shuō)明書的第三部分)，加3μl 10x酶解緩沖液，分別加EK酶1.0，0.5，0.3，0.2，0.1unit，留作為不加酶對(duì)照，加水使總體積為30μl。以每6支管為一組，分別4℃，16℃，25℃恒溫水解，每隔12或24小時(shí)采樣5μl，SDS-PAGE檢查重給神經(jīng)毒素的釋放，水解時(shí)間至72小時(shí)。
2.1.2融合蛋白的固相酶解在每6支0.5ml的離心管中，各取純化的融合蛋白26μl(約20μg)，按下表加樣品，單位μl。
表2固相酶解組成

25℃酶解72小時(shí)，每隔24小時(shí)取5μl，離心，取出上清加等量電泳樣品緩沖液；沉淀加5μl 0.1N鹽酸溶解，加等量電泳樣品緩沖液，混勻后，滴加1.0M Tris堿，直至溶液顏色由黃變藍(lán)。上清及沉淀電泳，檢查重組神經(jīng)毒素釋放情況。
2.1.3固相酶解的放大，重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素的酸洗脫及免疫印跡取純化的融合蛋白溶液0.5ml，加酶解緩沖液60μl，加0.5MK3PO4和1.0M CaCL2各6.0μl，混勻，加EKMax 8.0 units，25℃溫育72小時(shí)。離心，沉淀依次用10mM，100mM鹽酸振蕩懸浮溶解，8000rpm，4℃離心15分鐘，取上清，5μl電泳檢查及western blot，其余-20℃凍存。
2.2融合蛋白位點(diǎn)的酸敏感位點(diǎn)(DP)的引入2.2.1引物的設(shè)計(jì)及PCR(聚合酶鏈反應(yīng)) 如上所示，該圖為設(shè)計(jì)的插入D-P的融合位點(diǎn)序列圖，pTN314的質(zhì)粒神經(jīng)毒素基因的5’端和3’端終止密碼子后，有Kpn I和Pst I位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物將編碼酸敏感位點(diǎn)DP的堿基序列 加到神經(jīng)毒素基因5’端。引物由上海生工生物工程公司合成，框內(nèi)為酶切位點(diǎn)，陰影部分為編碼D-P的堿基序列。 PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增；以0.5μl p TN314為模板，正向和反向引物各0.5μl，PCR(聚合酶鏈反應(yīng))緩沖液5μl，dNTP 4μl，加水至50μl，混勻。94℃變性1.0分鐘，65℃復(fù)性45秒，72℃延伸1.0秒，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸5分鐘。
2.2.2插入DP片段的表達(dá)載體的構(gòu)建雙酶切質(zhì)粒提取及PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物純化按試劑盒手冊(cè)進(jìn)行。1)取pTN314質(zhì)粒40μl，加10xbufferl 8μl，BSA 0.8μl，Kpnl 50 units和Pstl 30 units，加水至總體積為80μl，充分混勻，37℃保溫12小時(shí)。2)取純化的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物60μl，加10xbufferl 15μl，BSA 1.5μl，Kpnl 100 units和Pstl 50 units，加水至體積為150μl，充分混勻37℃保溫12小時(shí)。電泳檢查并回收載體大片斷，酶切的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物再次純化，回收大片斷。
連接設(shè)置系列連接反應(yīng)，取回收載體片斷6μl，分別加純化的雙酶切PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物0.4，0.2，0.1μl，加1.0μl連接緩沖液，加T4 DNA連接酶1.0 unit，加水至總體積為10μl。分別設(shè)載體(6.0μl)及插入片斷(0.4μl)對(duì)照。16℃，連接過夜。
轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞的制備按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，在1.5ml離心管中，取連接產(chǎn)物及其對(duì)照各5μl，加新鮮制備的感受細(xì)胞100μl，輕輕混勻，冰水浴溫育10分鐘，40℃熱休克90秒，置冰水浴5分鐘，加0.9ml新鮮的LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。取150μl涂布LB培養(yǎng)基平板(100μg/ml)，37℃培養(yǎng)至單菌落長(zhǎng)出。
挑選單菌落，質(zhì)粒提取酶切鑒定及序列測(cè)定。
2.3重組神經(jīng)毒素的酸解釋放2.3.1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化制備含有DP插入片斷融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及滲透休克釋放見本發(fā)明說(shuō)明書的第一部分，2.5.3-4節(jié)。融合蛋白的純化制備見第三部分。
2.3.2融合蛋白裂解條件的優(yōu)化在0.5ml離心管中，取純化的融合蛋白40μl，分別加入冰乙酸6.5μl或13μl，甲酸134μl或者67μl，充分混勻，在另外2支0.5ml離心管中，各取天然神經(jīng)毒素40μl(1mg/ml)，加入等量的甲酸和乙酸?；靹?，以4支或6支反應(yīng)管為一組，分別在37℃，85℃保溫。48小時(shí)和3小時(shí)，每隔20小時(shí)或1小時(shí)取5μl凍干，電泳檢查重組神經(jīng)毒素的釋放。
在5支0.5ml離心管中，各取純化的融合蛋白43.5μl，分別加入1.0N的鹽酸5，2.5，1.25，0.5μl，留一支為不加酸對(duì)照。另取2支離心管，各加入天然神經(jīng)毒素20μl(1mg/ml)分別加入1.0N的鹽酸5，2.5μl。這7支管加水至總體積為50μl，混勻，分別在以這7支管為一組，在65℃，85℃保溫3小時(shí)，每隔一小時(shí)取樣5μl，電泳檢查重組神經(jīng)毒素的釋放。Western biot檢查重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素的抗原性。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 EKMaxTM對(duì)融合蛋白的酶解作用3.1.1在溶液中EKMaxTM非特異降解融合蛋白基于融合蛋白重組神經(jīng)毒素與硫氧還蛋白之間通過一個(gè)牛腸激酶的識(shí)別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)相連，而牛腸激酶是一種高度專一性的絲氨酸蛋白酶，它通過切割Lys的C端將目標(biāo)蛋白從融合蛋白中釋放出來(lái)(Light&Janska，1989，EKMaxTMInstruction Manual)。
但對(duì)于神經(jīng)毒素融合蛋白而言，在4℃，16℃，作用72小時(shí)EKMaxTM均檢測(cè)不到釋放的重組神經(jīng)毒素蛋白(datd not shown)。在25℃酶解24小時(shí)后，檢測(cè)到重組神經(jīng)毒素最大釋放出約10％(圖22 A)，而作用36小時(shí)后，重組神經(jīng)毒素釋出約25％，但同時(shí)出現(xiàn)兩條低分子量的蛋白帶約占10％(圖22B，non specific)。腸激酶裂解神經(jīng)毒素融合蛋白效率低，并且隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，副反應(yīng)嚴(yán)重。
在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Ca2+與PO43-離子形成的沉淀能吸附重組神經(jīng)毒素，提高裂解反應(yīng)，因此，進(jìn)一步探索了不同濃度的Ca2+與PO43-離子對(duì)酶切反應(yīng)的影響，稱之為“固相酶解”。
3.1.2固相酶解提高重組神經(jīng)毒素的得率，但導(dǎo)致毒素抗原性喪失不同濃度比例的K3PO4與CaCl2在酶切反應(yīng)緩沖液中能形成不同量的白色絮狀沉淀，當(dāng)反應(yīng)體系中CaCl2濃度為10mM時(shí)，逐漸提高K3PO4濃度，被沉淀吸附的融合蛋白，重組神經(jīng)毒素和載體蛋白也逐漸增多。吸附機(jī)理未作深入探討，但可能類似于“羥基磷灰石”吸附純化蛋白的原理。離心分離沉淀和上清(圖23)。當(dāng)K3PO4濃度為5Mm時(shí)，沉淀幾乎吸附了所有的融合蛋白和生組神經(jīng)毒素(lane 8)。
按此比例加入K3PO4與CaCl2，將反應(yīng)體積提高到0.5ml，酶解完成后，用10mM鹽酸溶解，可洗脫98％的硫氧還蛋白和45％的重組神經(jīng)毒素(圖24A，lane3)，沉淀繼續(xù)用100mM鹽酸溶解，洗脫出55％的重組神經(jīng)毒素，洗脫液中，毒素占總蛋白的95％以上(圖24A，lane4)。SDS-PAGE結(jié)果說(shuō)明天然和重組的神經(jīng)毒素蛋白分子量基本一致，但western blot結(jié)果卻顯示，純化的重組神經(jīng)毒素的主帶與兔血清抗體的免疫反應(yīng)幾乎完全消失(圖24，B)。
分析其原因可能有2個(gè)1)純化的融合蛋白溶液中，存在有微量的蛋白酶，而這些蛋白酶水破壞了神經(jīng)毒素的抗原決定簇。2)EKMax對(duì)神經(jīng)毒素蛋白的非特異降解。神經(jīng)毒素序列中不含有腸激酶的識(shí)別位點(diǎn)(DDDDK)，但有可能含有電荷特性與識(shí)別位點(diǎn)相似的序列，而被腸激酶降解(Light & Janska，1989)。實(shí)驗(yàn)表明在含有神經(jīng)毒素20μg，反應(yīng)體積為30μl體系中，加入不同量的EKMax，37℃溫育16.5小時(shí)。腸激酶用量為0.5μ時(shí)，天然神經(jīng)毒素被降解(圖25，Lane 4)；當(dāng)腸激4.0μ時(shí)，約45％的神經(jīng)毒素被降解為分子量較小的兩條帶(圖25，Lane 2)。
3.1.3小結(jié)腸激酶是裂解融合蛋白常用的一種專一性較強(qiáng)蛋白酶，但在本實(shí)驗(yàn)中卻不適合用于生產(chǎn)神經(jīng)毒素融合蛋白。1)對(duì)該融合蛋白專一性差，重組蛋白得率低，或者切出的重組神經(jīng)毒素發(fā)生改變。2)EKMax價(jià)格昂貴，不適用于大量生產(chǎn)重組蛋白。
因此，設(shè)計(jì)改變重組蛋白的融合位點(diǎn)，將酸敏點(diǎn)位點(diǎn)(DP)引入神經(jīng)毒素基因的5’端，希望通過酸解方法將重組神經(jīng)毒素從融合蛋白中分離出來(lái)。
3.2 DP插入表達(dá)載體的構(gòu)建擴(kuò)增的DNA片斷如圖26，長(zhǎng)約200bp。擴(kuò)增片斷與質(zhì)粒pTN314被KpnI和Pst I雙酶切，結(jié)果如圖27?？梢钥吹矫盖泻蟮臄U(kuò)增片斷比酶切之前略小，但大于pTN314切出的小片斷，與實(shí)際相符。轉(zhuǎn)化后的挑選單菌落，測(cè)序按常規(guī)方法進(jìn)行。重組質(zhì)粒如圖28，命名為pTNP314。
3.3融合蛋白的酸解釋放構(gòu)建的載體pTNP314的IPTG透導(dǎo)表達(dá)，滲透休克檢查，基本與pTNP314相同，證實(shí)插入的DP序列不影響融合蛋白的表達(dá)。
13％和26％的乙酸，35％和70％的甲酸在37℃酸解融合蛋白48小時(shí)，融合蛋白僅部分裂解，且觀察不到重組神經(jīng)毒素(圖29A和B)。而在85℃酸解1小時(shí)后，融合蛋白降解嚴(yán)重(圖29C)。
不同濃度的稀鹽酸在85℃，作用2小時(shí)，融合蛋白被高效裂解(圖30A)，Western blot結(jié)果說(shuō)明重組神經(jīng)毒素與天然神經(jīng)毒素兔抗血清有強(qiáng)反應(yīng)性(圖30，B and C)。
當(dāng)加入稀鹽酸的終濃度分別為5，10，25，50，100mM時(shí)，融合蛋白逐漸減少，重組蛋白在裂解液中占總蛋白的比例也逐漸增大，但重組神經(jīng)毒素得率并不總是隨融合蛋白減少而增加，當(dāng)酸終濃度為25mM時(shí)，重組蛋白得率最高為63％，占酸解液中總蛋白含量為28％(圖31)，此時(shí)裂解溶液pH約為2.2。
4、討論4.1、Aspartyl-Prolyl肽鍵的酸解斷裂機(jī)制及影響因素天門冬氨酸—脯氨酸肽鍵在酸性環(huán)鏡中，非常不穩(wěn)定，天門冬氨酸的C端發(fā)生裂解，反應(yīng)機(jī)制如下(Walker，J.M.，1996)。
一些反應(yīng)條件可以促進(jìn)Asp-Pro肽鍵的裂解(landon，M.1977)；1)蛋白溶解在7.0M鹽酸胍中，加10％7酸，砒啶調(diào)pH至2.5。2)在37℃長(zhǎng)時(shí)間溫育(至24小時(shí))。3)凍干終止反應(yīng)。
4.2酸解的副反應(yīng)及其對(duì)重組神經(jīng)毒素的影響低pH和高溫條件下，蛋白可能發(fā)生的主要副反應(yīng)為天門冬酰氨和谷氨酰氨脫氨，但把反應(yīng)時(shí)間控制在2小時(shí)之內(nèi)，能將副反應(yīng)降低到最低程度(walker，J.M.1996，Wright，H.T.，1991)。脫氨將導(dǎo)致蛋白帶負(fù)電增多，而自由區(qū)帶毛細(xì)管電泳能檢測(cè)到蛋白荷質(zhì)比的變化，因此可以通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)得重組神經(jīng)毒素電荷的均一性。重組神經(jīng)毒素的毛細(xì)管電泳呈單條帶，與天然神經(jīng)毒素遷移時(shí)間僅有0.10min差異(圖33，天然神經(jīng)毒素見圖6)。因此重組神經(jīng)毒素在酸解液中發(fā)生的脫氨反應(yīng)是可以忽略的。
其他可能發(fā)生的一些次要反應(yīng)包括(Walker，J.M.1996)；1)Asp-X，X-Asp肽鍵的斷裂當(dāng)X為除Pro外的基他氨基酸時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率很低。2)在Glu殘基斷裂；3)色氨酸殘基部分被破壞；4)N端Glu殘基的環(huán)化等。但這些反應(yīng)都可以通過縮短反應(yīng)時(shí)間來(lái)避免。
4.3酸解方法在重組蛋白生產(chǎn)上的應(yīng)用潛力目前，應(yīng)用這一策略，通過在融合蛋白中導(dǎo)入Asp-Pro位點(diǎn)，酸解融合蛋白將重組的人旁甲狀腺素片段(hPTH38)和一種抗菌肽釋放出來(lái)而得以大量生產(chǎn)(Gavit.&Better.2000，Gram，H..，et al.，1994)。但這兩種多肽都小于40個(gè)氨基酸，并且不含半胱氨酸，即不含有二硫鍵。
本發(fā)明所述的重組短鏈眼鏡蛇神經(jīng)毒素含有62個(gè)氨基酸，由4對(duì)二硫鍵形成具有緊密結(jié)構(gòu)的蛋白分子，因而完全不同于上述兩種小肽。
本發(fā)明所述的酸解方法用于重組蛋白的生產(chǎn)具有如下優(yōu)點(diǎn)1)鹽酸無(wú)毒，無(wú)危險(xiǎn)性。與其他化學(xué)裂解方法比較，鹽酸在裂解完成后，通過調(diào)節(jié)溶液pH就可以輕易除去。而其他化學(xué)裂解劑必須小心使用。溴化氰(Br-CN)為劇毒物質(zhì)，羥胺是易爆物質(zhì)。2)鹽酸成本低，裂解反應(yīng)易于放大。而用特異蛋白酶裂解成本高，不易放大，用于生產(chǎn)必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，并且不同批次的酶對(duì)融合蛋白的裂解會(huì)有差異。3)鹽酸解效率高，在本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)條件下，最終對(duì)融合蛋白的裂解率大于90％，而重組神經(jīng)毒素的得率也大于60％。相信該酸解條件還可以進(jìn)一步優(yōu)化，得率還能大幅度提高。
三、本發(fā)明所述的重組神經(jīng)毒素生產(chǎn)純化工藝用于蛋白分離純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括離子交換、凝膠過濾層析、反向色譜、金屬敖合層析等。
在重組蛋白的分離工藝中最常用的分離技術(shù)為離子交換和凝膠過濾層析。離子交換方法的批次處理量大，不同的離子交換劑適用于重組蛋白分離純化的各個(gè)階段。凝膠過濾是基于蛋白分子量的不同而分離目的蛋白和雜蛋白的方法，適用于分離純化的后期。
前述神經(jīng)毒素蛋白經(jīng)滲透休克釋放至低鹽溶液中后，融合蛋白含量約為溶液總蛋白含量的65％，蛋白后續(xù)純化首先適用離子交換技術(shù)。
就離子交換而言，Q和SP Sepharose，QAE和Sephadex系列應(yīng)用于初期從稀溶液中俘獲目的蛋白，適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。Source系列離子交換介質(zhì)適用于樣品的精細(xì)純化，耐壓好，流速高。
由于本發(fā)明所述的重組融合蛋白的分離純化需要綜合考慮生產(chǎn)規(guī)模和樣品的批處理，分離速度，介質(zhì)的結(jié)合力，分辨率和回收率等方面的因素，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，要求離子交換劑既有高分辨率，又要有高載量，因此，本發(fā)明采用Source系列進(jìn)行離子交換。
另一方面，由于本發(fā)明所述的融合蛋白酸解后，溶液中主要存在重組神經(jīng)毒素蛋白和載體蛋白，二者分子量之差約為6,000 Dalton，所以，本發(fā)明采用分辨率較高的凝膠-Superdex 75 Prep對(duì)融合蛋白進(jìn)行后續(xù)純化分離。1、實(shí)驗(yàn)材料1.1試劑，培養(yǎng)基及溶液蛋白純化介質(zhì)Source 15Q，Superdex 75 prep，Superdex G-15，和色譜柱K26/20，XK16/70，HR10/10均購(gòu)自Amersham Pharmacia公司。超純級(jí)Tris購(gòu)自Sigma公司。NaCl及其他化學(xué)試劑均為分析純。培養(yǎng)介質(zhì)Tryptone，Yeast Extract為Oxoid公司產(chǎn)品。
LB液體培養(yǎng)基每升含10g Tryptone，5g yeast Extract，5g NaCl，pH值用NaOH調(diào)為7.0，高壓滅菌。接種前加入氨芐青霉素至終濃度為100μg/ml。
氨芐青霉素溶液取50mg，溶于1ml純水中，0.2μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。
IPTG溶液(100mM)取238.3mg IPTG溶于10ml純水中，0.2μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。
滲透休克1#溶液20mM Tris，pH 7.0，5mM EDTA，20％蔗糖，過濾除菌，4℃保存。
滲透休克2#溶液20mM Tris，pH 7.0，5mM EDTA，高壓滅菌，4℃保存。
1.2儀器中低壓層析系統(tǒng)KTA Purifier 100為Amersham Pharmacia公司贈(zèng)送，大容量高速冷凍離心機(jī)20PR-52D型購(gòu)自為Hitachi公司。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 工程菌的培養(yǎng)，菌體收集和融合蛋白的滲透休克釋放接種活化的工程菌TOP 10(pTNP 314)單菌落于15ml LB液體培養(yǎng)基中，在37℃以220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接3ml培養(yǎng)物至150ml LB培養(yǎng)基，在30℃以220rpm振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。然后以1∶40轉(zhuǎn)接至2.7L培養(yǎng)基中，在37℃220rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，菌體密度OD600約0.5。加入TPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
測(cè)定菌液OD600，在預(yù)冷至4℃的高速冷凍離心機(jī)中以8,000xg，離心30分鐘，收集菌體。傾去上清，在離心管中直接加入適量冰冷的滲透休克1#溶液，使菌懸液的OD600為5.0。充分懸浮后，冰水浴放置10分鐘。在4℃高速冷凍離心機(jī)以10,000xg，離心30分鐘，倒掉上清，菌體懸浮在與1#溶液體積相同的滲透休克2#溶液中，充分混勻后，冰水浴放置10分鐘。再次高速離心30分鐘。取出上清置清潔的離心瓶中，在-25℃凍存，取少量電泳檢查融合蛋白釋放。
2.2融合蛋白的純化2.2.1離子交換色譜條件優(yōu)化色譜柱HR 10/10填料Source 15Q，8ml上樣體積滲透休克釋放的融合蛋白溶液10ml基本流動(dòng)相A 20mM Tris，pH 8.0B 20mM Tris，pH 8.0，1.0 M NaCl洗脫條件色譜柱平衡100％A2CV上樣 10ml穿透組分洗脫 100％A2CV梯度洗脫 0-20％B 20CV20-60％B 5CV60-100％B 0CV100％B2CV100-0％B 0CV100％A4CV檢測(cè)方式紫外(280，260，214nm)，電導(dǎo)檢測(cè)器，壓力檢測(cè)器流動(dòng)相優(yōu)化因子a，b，c，優(yōu)化方法在樣品及流動(dòng)相中，1)添加1％的a；2)加10％的b；3)將樣品濃度稀釋一倍；4)在樣品及流動(dòng)相中，加入不同濃度的c，即c1，c2，c3，c4，c5。
依次改變流動(dòng)相及樣品溶液組成，每種流動(dòng)相重復(fù)一次。每次改變流動(dòng)相后，需再次平衡色譜柱。計(jì)算每次分離融合蛋白的得率(mAU*m1)和峰面積占總峰面積之比。
2.2.2融合蛋白的制備色譜柱XK26/20填料Source 15Q，37ml上樣體積滲透休克釋放的融合蛋白溶液250ml。
優(yōu)化的流動(dòng)相A 20mM Tris，pH 8.0+c2B 20mM Tris，pH 8.0，1.0 M NaCl+c2流速23ml/min洗脫條件同2.2.1節(jié)收集方式分部收集器等組分收集上樣方式樣品泵上樣融合蛋白溶液置37℃水浴，輕輕旋轉(zhuǎn)快速解凍，加入c至c2濃度，在4℃高速冷凍離心機(jī)中以10,000xg，離心20分鐘，取上清測(cè)定其體積，設(shè)定上樣體積，以11.5ml/min的流速成上樣。以10ml/管分部收集穿透組分及洗脫出的各組分，電泳檢查。洗脫的融合蛋白在-25℃凍存。
2.3重組神經(jīng)毒素的制備2.3.1重組蛋白的酸解釋放取純化的融合蛋白溶液10ml，加入1N的鹽酸至終濃度為25mM，輕搖混勻，置85℃水浴保溫反應(yīng)2小時(shí)。取出自然冷卻至室溫，電泳檢查重組神經(jīng)毒素的釋放情況。加入1.0M的Tris堿至Tris終濃度為50mM，混勻后，-25℃凍存。
2.3.2重組神經(jīng)毒素蛋白的凝膠純化(1)凝膠柱的裝填及柱效測(cè)定材料裝柱器RK16，色譜柱XK16/70，凝膠介質(zhì)Superdex 75 prep，HiTrap DesaltingSuperdex G-25均為Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品。
溶液去離子水，20％的乙醇水溶液，Tween-20，丙酮將裝柱器安裝在XK柱體頂部，純水清洗，將濾膜裝在柱底部，加入20％乙醇溶液，洗柱。將色譜柱垂直裝在KTA Purifier 100柱架上，加入純水，清洗色譜柱后，柱底部加約2cm高的純水，堵頭封閉柱下部出口。取138ml自然沉淀的Superdex 75 prep凝膠，加入純水懸浮至總體積475ml，加入0.25ml Tween-20，一次性勻速倒入色譜柱及裝柱器中，加水添滿裝柱器，將裝柱器入口連接KTA，打開色譜柱出口，以純水為流動(dòng)相，設(shè)流速為1.0ml/min，開泵，3小時(shí)后，凝膠柱床體積穩(wěn)定，關(guān)泵。小心卸調(diào)裝柱器，裝色譜柱入口適配器，以6ml/min的流速成1小時(shí)。調(diào)節(jié)適配器至凝膠柱床表面下壓5mm，旋緊。
將填好的色譜柱連接KAT Purifier 100，以純水為流動(dòng)相，檢測(cè)器設(shè)置波長(zhǎng)為280nm。流速為2.0ml/min，以丙酮為樣品，進(jìn)樣0.2ml。記錄色譜圖，計(jì)算丙酮峰的理論塔板數(shù)。(2)重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白與載體蛋白的分離色譜柱XK16/60裝填Superdex 75 prep介質(zhì)流動(dòng)相50mM Tris，pH8.0，0.15 M NaCl以1.0ml/min的流速，用兩個(gè)柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱，取酸解后Tris中和的融合蛋白溶液5ml，上樣。峰收集組分，-25℃凍存。(3)重組蛋白的濃縮與脫鹽流動(dòng)相5mM NEPES，pH7.0，25mM NaCl凝膠分離的重組神經(jīng)毒素凍干，測(cè)定重組蛋白含量，將重組蛋白以1mg/ml溶于純水中，每次上樣1.0ml，紫外及電導(dǎo)檢測(cè)，HiTrap Desalting Superdex G-25柱脫鹽。收集蛋白組分，BCA法測(cè)定蛋白含量，-25℃凍存。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論3.1 工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)及滲透休克在實(shí)驗(yàn)室條件下，工程菌搖瓶培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)后，達(dá)到穩(wěn)定的菌體密度，OD600約為2.0-2.2。20PR-52D型離心機(jī)每次可處理2.0L菌液，新鮮培養(yǎng)的菌體沉淀在500ml的離心瓶中進(jìn)行滲透休克，加入1#溶液后，必須將沉淀的菌體充分懸浮均勻，不能有絮狀或片狀菌體。2.7L菌液約懸浮在1.08L溶液中，在冰水浴放置10分鐘以上，充分滲透平衡。由于含1#溶液20％蔗糖，離心時(shí)需用較高的離心機(jī)。倒掉1#溶液后，要使離心瓶口朝下，放置幾分鐘，然后用吸水紙去掉管口的液滴。
2.7L培養(yǎng)液最終可能得約1.0L的滲透休克溶液，用4個(gè)離心瓶分裝，于-70℃速凍后，在-25℃保存。3.2融合蛋白的分離純化3.2.1離子交換色譜條件的優(yōu)化(1)離子交換介質(zhì)及實(shí)驗(yàn)條件選擇離子交換是純化基因工程重組蛋白質(zhì)最有用的方法之一，交換介質(zhì)結(jié)合容量大，可以一次處理大量樣品。融合蛋白釋放到滲透休克2#溶液中，離子強(qiáng)度低，適合用離子交換法進(jìn)行下一步處理(孫志賢等，1995)。該溶液pH值為8.0，將融合蛋白氨基酸全序列用ProtParam tool軟件分析其生化性質(zhì)得出等電點(diǎn)pI為5.50，因此在該溶液中，融合蛋白帶強(qiáng)負(fù)電，選擇陰離子交換劑Source 15Q。該離子交換介質(zhì)具有以下特點(diǎn)1)介質(zhì)為耐壓的剛性小球，具有均勻的15μm直徑，分辨率高，可以在高流速下純化蛋白；2)使用pH范圍寬，結(jié)合容量大；3)化學(xué)穩(wěn)定性好，在pH 2.0-12的范圍內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定(Handbook of Ion Chromatography，1991)。
選擇好離子交換介質(zhì)后，依次選擇實(shí)驗(yàn)的分離條件起始流動(dòng)相pH值及離子強(qiáng)度，洗脫鹽種類，流速，洗脫方式。1)起始流動(dòng)相的pH最好與融合蛋白溶液的pH值相同，因此選擇流動(dòng)的pH值為8.0。2)洗脫鹽采用1.0M的NaCl溶液。3)Source 15Q耐壓好，生產(chǎn)廠家推薦線性流速為30-600cm/h，選擇流速為23ml/min。4)選擇線性梯度分離，第一次分離采用寬范圍梯度，在20個(gè)柱體積內(nèi)，NaCl濃度由0增加到100％。發(fā)現(xiàn)融合蛋白在NaCl為0.13M(13％NaCl)時(shí)被洗脫，因此在設(shè)置洗脫梯度在20個(gè)柱體積內(nèi)，NaCl濃度由0增加到20％。(2)流動(dòng)相組分的優(yōu)化融合蛋白與分離介質(zhì)結(jié)合及解離受多方面因素所影響，而流動(dòng)相的組成及離子強(qiáng)度是其中一個(gè)重要的因素。因此重點(diǎn)研究改變流動(dòng)相的組成，盡可能降低融合蛋白與交換介質(zhì)的非特異吸附作用，保持融合蛋白具有均一而穩(wěn)定的構(gòu)象。
在相同的上樣量和其他色譜條件相同的情況下，僅僅改變流動(dòng)相的組成，由色譜圖計(jì)算分離所得融合蛋白的量和所占百分比(圖34)。在流動(dòng)相中加入C至濃度為C2時(shí)，融合蛋白的得率最高，因此選擇C2為融合蛋白作為分離純化的流動(dòng)相組成。3.2.2離子交換法純化融合蛋白冰凍的融合蛋白溶液快速解凍，防止蛋白被降解，高速離心去除解凍過程中可能產(chǎn)生的沉淀。上樣時(shí)降低流速防止由于樣品溶液粘度增加而導(dǎo)致的柱壓升高。分離過程如圖(圖35A)。穿透及各個(gè)主峰電泳圖(圖35B)，融合蛋白純度大于95％(lane 6)，分部收集的融合蛋白主峰。3.3重組神經(jīng)毒素的制備3.3.1重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素的酸解釋放酸解反應(yīng)完成后，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，加入Tris堿至50mM，酸解液pH被調(diào)節(jié)至7.0左右。其作用有兩方面1)升高pH，中和鹽酸，終止反應(yīng)；2)調(diào)節(jié)酸解液Tris至50mM，與下一步凝膠純化流動(dòng)相組成相近。
酸解液經(jīng)電泳檢查，酸解完全后，進(jìn)行凝膠柱純化。3.3.2凝膠柱的柱膠檢測(cè)自行裝填的凝膠色譜柱必須檢測(cè)其柱效，每米理論塔板數(shù)(N/m)應(yīng)大于10,000。柱效測(cè)定色譜圖(圖36)，柱效每米理論塔板數(shù)(N/m)為14,500。說(shuō)明色譜柱達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。3.3.3重組神經(jīng)毒素的凝膠色譜分離與在SDS-PAGE的異常電泳行為不同，在凝膠柱上，神經(jīng)毒素滯后于硫氧還蛋白(MW13，068 Dalton)，分子量表面正常(圖37)。重組蛋白主峰收集，真空冷凍濃縮，脫鹽(圖38)，收集蛋白峰，測(cè)定重組蛋白濃度約為0.5mg/ml。4.小結(jié)綜合整個(gè)生產(chǎn)工藝過程，每步純化產(chǎn)物電泳純度分析(圖39，A)及相應(yīng)的免疫印跡結(jié)果(圖39，B)。
重組神經(jīng)毒素的最終得率為35.3％(以滲透休克獲得量為1)(表3)。每升發(fā)酵菌液最終可得純度大于95％的重組神經(jīng)毒素約12mg。在實(shí)驗(yàn)室500ml搖瓶培養(yǎng)條件下，菌體最高生長(zhǎng)密度到OD600為2.0-2.2。若使用發(fā)酵罐培養(yǎng)，菌體生長(zhǎng)密度可大大提高，因此改變培養(yǎng)條件，重組蛋白產(chǎn)量可得到很大的提高。
離子交換介質(zhì)Source 15Q是一種分辯率很高，同時(shí)適用于實(shí)驗(yàn)室精細(xì)純化和重組蛋白的工業(yè)生產(chǎn)的填料，但價(jià)格較高，在今后放大工藝中，可考慮更換其他更適合與工業(yè)生產(chǎn)的介質(zhì)，在適當(dāng)犧牲分辯率的前提下，顯著降低成本，提高批次處理量。酸解條件的控制是生產(chǎn)過程中非常關(guān)鍵的一步，重組蛋白的得率并不總是隨融合蛋白的酸解率的提高而增大(圖31)。下一步的放大將使用具有加熱套和攪拌器的耐酸小型罐。凝膠純化在生產(chǎn)過程中是非常有效的一個(gè)步驟，若將柱徑和柱長(zhǎng)大大提高，能提高每批處理量和分辯率。
凝膠收集的組分體積將增大一倍以上，因此必須進(jìn)行濃縮和脫鹽。對(duì)于重組神經(jīng)毒素而言，曾使用1000Dalton分子量的透析和超濾裝置對(duì)重組蛋白進(jìn)行濃縮和脫鹽，但蛋白得率很低，這或許是由于重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素致密而緊湊的結(jié)構(gòu)造成的。所以采用凍干濃縮樣品，凝膠柱脫鹽。
重組蛋白的生產(chǎn)工藝是一個(gè)系統(tǒng)工程，分離介質(zhì)的選擇，分離步驟的銜接和優(yōu)化不是一個(gè)個(gè)孤立的過程，要根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模，運(yùn)行成本綜合考慮，進(jìn)行優(yōu)化配置。表3重組神經(jīng)毒素的綜合得率

四、重組神經(jīng)毒素的理化性質(zhì)及毒性測(cè)定對(duì)重組眼鏡蛇毒素進(jìn)行理化性質(zhì)分析，從分子量，N端氨基酸序列，對(duì)小鼠靜脈注射的半數(shù)致死量等方面，與天然毒素進(jìn)行比較。1、實(shí)驗(yàn)材料昆明種小鼠，由中國(guó)藥物生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素的理化性質(zhì)SDS-PAGE電泳，反向液相色譜，毛細(xì)管區(qū)帶電泳，N端氨基酸序列測(cè)定，質(zhì)譜等方法與天然神經(jīng)毒素測(cè)定相同。2.2重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素的毒性測(cè)定(Meier&Theakston，1986)取18-20g昆明種小白鼠10只，分別通過尾靜脈注射0.5ml不同濃度的重組神經(jīng)毒素溶液，使小鼠的注射后存活時(shí)間在1分鐘到30分鐘之間。記錄小鼠的存活時(shí)間。以每kg體重的劑量/存活時(shí)間(D/T)為橫坐標(biāo)，以小鼠的每kg體重的注射劑量為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸，曲線與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)為在無(wú)限時(shí)間內(nèi)殺死50％的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量，即LD50。
天然神經(jīng)毒素按相同方法測(cè)定。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1重組神經(jīng)毒素分子量測(cè)定及純度SDS-PAGE電泳測(cè)定的重組神經(jīng)毒素表觀分子量為16,500dalton(圖39A，Lane3)，與天然神經(jīng)毒素基本相同。電噴霧質(zhì)譜測(cè)定其分子量為7046dalton(圖40)。反向高效液相色譜測(cè)定純度大于98％(圖41)，二級(jí)管全波長(zhǎng)掃描(190-800nm)特征吸收在205nm和276nm(圖42)，自由區(qū)帶毛細(xì)管電泳純度大于95％(圖43)。3.2重組神經(jīng)毒素的N端序列由Edman固相測(cè)序測(cè)定重組神經(jīng)毒素N端序列為Pro-Leu-Glu-Cys-His-Asn-Gln-Gln-Ser-Gln-Thr-Pro-Thr-Thr與在載體pTNP314上攜帶神經(jīng)毒素基因5`端編碼氨基酸序列一致。3.3重組神經(jīng)毒素的毒性小鼠每kg體重的劑量/存活時(shí)間(D/T)與每kg體重的注射劑量的對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖44，重組及天然神經(jīng)毒對(duì)小鼠的LD50值分別為0.556mg/kg和0.369mg/kg。4.討論表4重組和天然神經(jīng)毒素理化性質(zhì)及毒性比較

天然神經(jīng)毒素電噴霧質(zhì)譜實(shí)際測(cè)定的分子量為6946Daltons，而重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素測(cè)定的分子量為7046Daltons分子量相差100Daltons；而序列測(cè)定結(jié)果表明重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素比天然毒素N端多一個(gè)Pro，殘基分子量為97.1Daltons，相差約3個(gè)質(zhì)量數(shù)，實(shí)驗(yàn)誤差在系統(tǒng)誤差之內(nèi)。
本發(fā)明所述的重組神經(jīng)毒素在C8反相柱的保留時(shí)間稍大于天然神經(jīng)毒素，這與重組神經(jīng)毒素在N端多一個(gè)Pro，疏水性增加有關(guān)。
本發(fā)明所述的重組神經(jīng)毒素的小鼠尾靜脈注射半數(shù)致死量略小于天然毒素，說(shuō)明重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素的毒性接近天然毒素。
五、本發(fā)明所述的重組神經(jīng)毒素與肌型尼克酰胺膽堿受體結(jié)合能力的測(cè)定----對(duì)培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞煙堿誘導(dǎo)電流的抑制作用眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素與肌型尼克酰胺乙酰膽堿受體有很高的特異親和力，它與受體的結(jié)合是一個(gè)可逆的過程。短鏈神經(jīng)毒素是該類受體的激活劑乙酰膽堿，煙堿等的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑。在培養(yǎng)的單個(gè)骨骼細(xì)胞上，采用膜片鉗全細(xì)胞鉗制電壓在-70mV，加入一定量的激活劑如煙堿，可以記錄到受體通道開放產(chǎn)生的內(nèi)向電流。當(dāng)激活劑存在時(shí)，加入重組神經(jīng)毒素后，可以記錄到由于部分受體通道與神經(jīng)毒素結(jié)合而導(dǎo)致的內(nèi)向電流的減少。該電流的減少量與加入量組神經(jīng)毒素的濃度呈正相關(guān)。
1實(shí)驗(yàn)材料1.1試劑及儀器煙堿(草酸鹽)DMEM培養(yǎng)基，阿糖胞苷和秋水仙堿為Sigma公司產(chǎn)品，馬血清，牛血清和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉復(fù)合物(ITS)為Gibcol公司產(chǎn)品。PC-84型電極拉制儀為Sutter公司產(chǎn)品；AxonPatch-ID放大器，TL-1AD轉(zhuǎn)換板，Clampex 7.0版，Clampfit 6.0版采樣和分析軟件均為Axon Instrument公司產(chǎn)品；PPS-2空氣壓力給藥5系統(tǒng)為Medical System公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)箱為Baxer公司產(chǎn)品。相差顯微鏡Olympus公司產(chǎn)品。
1.2溶液細(xì)胞種植液含80％的DMEM，10％的馬血清，10％的胎牛血清；細(xì)胞飼養(yǎng)液含90％的DMEM，10％的馬血清和1％的ITS；細(xì)胞外液含0.82％的Nacl，0.04％的KCl，0.02％的MgCl2，0.24％的HEPES，0.20％的葡萄糖，最后加0.03％CaCl2，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.3。
細(xì)胞內(nèi)液含2.36％的CaCl2，0.24％4的HEPES，0.38％的EGTA，0.11％的ATP，調(diào)節(jié)pH為7.3。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)取當(dāng)天新生的Wistar大鼠，75％乙醇消毒后處死，在無(wú)菌條件下取其后肢骨肌，在0℃的pH 7.3的磷酸鹽緩沖液中剪碎，在含有0.25％胰酶的緩沖液中于37℃通氧消化60分鐘，離心，棄去消化液，加入種植液，吹打，200目篩過濾，濾液在37℃，10％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后換飼養(yǎng)液，適時(shí)換液和加入阿糖胞苷和秋水仙堿，5-8天有肌球形成后用于實(shí)驗(yàn)。
2.2玻璃微電極的拉制取直徑1.4mm的軟質(zhì)玻璃毛坯，在800℃以上拉制玻璃微電極，經(jīng)拋光后測(cè)其尖端直徑應(yīng)為1μm。
2.3全細(xì)胞記錄膜片鉗記錄裝置由相差顯微鏡，記錄電極，微操縱器，前置放大器，示波器，AD轉(zhuǎn)換板和工作站控制分析系統(tǒng)組成。將培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞浸于2ml細(xì)胞外液中。在倒置相差顯微鏡下，通過微操縱儀將充滿細(xì)胞內(nèi)液的玻璃微電極壓向肌球表面，并通過示波器顯示封接測(cè)試脈沖，觀察電極電阻變化。當(dāng)脈沖所代表的電流值突然下降時(shí)，表面電極已經(jīng)接觸細(xì)胞，這時(shí)立即給玻璃微電極施以負(fù)壓，使細(xì)胞與玻璃電極形成貼附式封接，從示波器讀取的電流計(jì)算封接電阻約為1-3GΩ。繼續(xù)施加負(fù)壓或加電壓1.5V 10ms，電擊打破細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與電極相通，形成全細(xì)胞記錄并施加鉗制電壓。
2.4給藥方式給藥裝置由氮?dú)?，氣體壓力系統(tǒng)，微操縱器和給藥電極組成。將充滿藥液的給藥電極置于與記錄細(xì)胞同一平面，距離1～2個(gè)肌球的位置上，調(diào)節(jié)給藥壓力使噴出的藥液覆蓋記錄細(xì)胞。將三根給藥電極毛坯捆綁在一起，并拉制成型，電極內(nèi)充滿不同藥物或同種藥物不同劑量的溶液，用于觀察不同藥物或不同劑量對(duì)同一細(xì)胞的作用。以天然毒素為對(duì)照，重組和天然毒素用含80mM煙堿的細(xì)胞外液稀釋，觀察它們對(duì)煙堿誘導(dǎo)電流的抑制作用。
2.5數(shù)據(jù)采集及處理去極化電流及煙堿誘發(fā)電流經(jīng)AD轉(zhuǎn)換板和放大器Clampex7版工作站采集記錄，用Clampfit 6.0版測(cè)量電流幅度。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的電流幅度取平均值用X±s表示，用單因素單方差分析比較不同藥物，不同劑量在-70mV鉗制電壓下毒素對(duì)煙堿電流抑制率的影響。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1培養(yǎng)的骨骼細(xì)胞經(jīng)5～8天培養(yǎng)后，骨骼肌細(xì)胞有肌球形成(圖47)，肌細(xì)胞生長(zhǎng)正常。
3.2骨骼肌誘發(fā)細(xì)胞的煙堿電流將形成全細(xì)胞記錄的細(xì)胞鉗制在-70mV，給予一系列刺激的同時(shí)記錄誘發(fā)電流(圖48)，可見明顯的鈉，鉀離子電流，說(shuō)明培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞功能正常。向同一細(xì)胞按順序噴射40，80，120μM煙堿1秒，間隔3分鐘，可見煙堿誘發(fā)電流不斷增大(表5)，說(shuō)明煙堿誘發(fā)電流有量效關(guān)系。
表5煙堿誘發(fā)電流的濃度依賴性(n＝9)煙堿濃度(μM)電流幅度(nA)F檢驗(yàn)400.90±0.22 --801.75±0.42*P＜0.05160 2.23±0.65*P＜0.05取80μM煙堿作為誘發(fā)濃度，向細(xì)胞噴射煙堿1秒，能誘發(fā)1～4nA的內(nèi)向電流。以給藥間隔2～3分鐘，同一細(xì)胞反復(fù)數(shù)次給予80μM煙堿1秒，可見誘發(fā)電流基本一致，表面細(xì)胞的反應(yīng)性前后一致(圖49)。
3.3重組和天然神經(jīng)毒素神經(jīng)毒素對(duì)煙堿誘發(fā)電流的抑制作用向細(xì)胞噴射80μM煙堿1秒，每間隔3分鐘向同一細(xì)胞依次噴射含2.3，11.5，23μM重組或天然神經(jīng)毒素的80μM煙堿1秒，可見煙堿誘發(fā)電流逐步減小(圖50，圖51，圖46)，表明重組和天然毒素抑制煙堿誘發(fā)電流有濃度依賴性，抑制效應(yīng)曲線(圖15)，由此而得重組和天然神經(jīng)毒素對(duì)骨骼肌細(xì)胞煙堿誘發(fā)電流的IC50分別為26.2×10-6mol/L和7.5×10-6mol/L。
表6重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素或天然毒素抑制80μM煙堿電流的濃度依賴性(n＝6)重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素 天然毒素濃度/μM 電流/nA抑制率/％ 濃度/μM 電流/nA 抑制率/％0 1.70±0.39-- 01.52±0.33 --2.31.55±0.41 9±42.3 1.04±0.4232±911.5 1.19±0.25 30±9 11.5 0.46±0.30* 70±16*23 0.97±0.32 43±11* 23 0.29±0.15* 81±23*F檢驗(yàn)，*P＜0.05，vs小劑量組4 討論4.1膜片鉗技術(shù)的測(cè)定原理膜片鉗(patch-clamp)全細(xì)胞記錄方法是在玻璃微電極與細(xì)胞膜之間形成高阻抗封接后，用負(fù)壓或加電脈沖的方法造成電極尖端內(nèi)的膜片破裂，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，這樣可記錄一個(gè)完整細(xì)胞產(chǎn)生的電活動(dòng)。在電壓鉗制的條件下，可記錄通過細(xì)胞膜的所有離子的總和。若有目的地將電位鉗制在某一程度，可做到選擇性地抑制某些通道的活性，而只記錄某總通道電流的總和(張均田，1996)。
按藥物對(duì)膽堿能受體的作用，受體分為煙堿受體(N受體)和毒蕈堿樣受體(M受體)，在電器官和肌肉組織，N受體是一個(gè)約290kD的跨膜糖蛋白，由4種不同亞基組成的五聚體α2βγδ，呈玫瑰花瓣?duì)睢ｋx子通道被這5個(gè)亞基包圍在中間，每個(gè)亞基的M2片段構(gòu)成了離子通道的外側(cè)壁并控制著離子通道的關(guān)啟，神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)主要是由存在于α亞基上的親水區(qū)里的氨基酸組成，當(dāng)激動(dòng)劑與這些位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，可使N受體的5個(gè)亞基發(fā)生扭曲或開花狀變構(gòu)，從而引起離子通道的開放。
短鏈眼鏡蛇神經(jīng)毒素對(duì)肌型尼克酰膽堿受體(N受體)有很高的親和力，是煙堿的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，毒素與煙堿受體結(jié)合，能阻斷神經(jīng)一肌肉的信號(hào)傳導(dǎo)(Servant，D.，etal.2000)。用相同濃度的煙堿激發(fā)細(xì)胞，隨著毒素濃度的增大煙堿誘導(dǎo)的電流將逐步降低。通過全細(xì)胞記錄方式，將細(xì)胞膜電位鉗制在-70mV(接近細(xì)胞的靜息電位)，記錄到逐步降低的煙堿電流，表明神經(jīng)毒素對(duì)與煙堿受體結(jié)合作用的逐漸增強(qiáng)，以天然毒素為對(duì)照，檢測(cè)了重組神經(jīng)毒素與受體結(jié)合能力的強(qiáng)弱。
4.2重組神經(jīng)毒素的毒性測(cè)定方法衡量或比較本發(fā)明所述的重組神經(jīng)毒素與天然毒素毒性的差別通常有3種方法1)小鼠半數(shù)致死量測(cè)定這是傳統(tǒng)測(cè)定蛇毒毒性和其他毒素最常用的方法，方法簡(jiǎn)便易行。2)與純化或半純化的電魚尼克酰膽堿受體放免競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)，該方法為一種間接的體外生化測(cè)定方法。尤其適用于測(cè)定突變表達(dá)的神經(jīng)毒素與受體結(jié)合能力的變化，從而了解與受體結(jié)合的神經(jīng)毒素的功能位點(diǎn)，以[3H]標(biāo)記的天然毒素為示蹤元素，觀察其他毒素對(duì)它與受體結(jié)合的神經(jīng)毒素的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，得出它們的IC50。3)神經(jīng)毒素對(duì)由乙酰膽堿誘發(fā)離體的蛙腹直肌收縮的抑制作用通過檢測(cè)離體肌肉組織張力的變化而比較重組和天然毒素對(duì)乙酰膽堿的頡抗作用。
單電極鉗制技術(shù)也曾經(jīng)用于測(cè)定純化的眼鏡蛇毒蛋白對(duì)乙酰膽堿受體的阻斷作用，電極尖端吸取乙酰膽堿溶液，后部充灌含有不同濃度的毒蛋白，選擇培養(yǎng)的肌細(xì)胞，作成胞上膜片鉗，電壓鉗制在+20mV，可記錄到受體的開放活動(dòng)。當(dāng)電極后部的毒蛋白逐漸擴(kuò)散到電極尖端時(shí)，通道即被阻斷。改變電極后部充灌的毒蛋白的濃度，以毒蛋白作用前后乙酰膽堿受體的平均開放時(shí)間的比值對(duì)毒蛋白的濃度，以毒蛋白作用前后乙酰膽堿受體的平均開放時(shí)間的比值對(duì)毒蛋白的作用濃度作出反應(yīng)劑量曲線，并以此計(jì)算對(duì)受體的半阻斷量。
本發(fā)明采用雙電極全細(xì)胞記錄方式，即采用一個(gè)微電極鉗制細(xì)胞，電極與細(xì)胞內(nèi)液相通，并鉗制電位在-70mV，另一個(gè)電極為給藥電極，不同濃度的毒素蛋白溶解在同一濃度的受體激動(dòng)劑中，通過壓力給藥系統(tǒng)給藥1秒，使噴出的藥液均勻覆蓋在細(xì)胞膜表面，細(xì)胞膜上的受體經(jīng)歷離子通道開放，產(chǎn)生瞬間電流，關(guān)閉的過程，產(chǎn)生的電流通過記錄電極被工作站采集，處理。對(duì)受體的抑制率與受體濃度的作效應(yīng)曲線，計(jì)算IC50。
本發(fā)明采用該方法測(cè)定重組神經(jīng)毒素與膽堿受體的親和力，本發(fā)明的研究人員認(rèn)為，該方法也可用于測(cè)定不同位點(diǎn)突變的神經(jīng)毒素與受體結(jié)合的差異。


圖1是本發(fā)明所述的短鏈神經(jīng)毒素(A)和長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素(B)的一級(jí)結(jié)構(gòu)；圖2是本發(fā)明所述的短鏈神經(jīng)毒素(1NOR)和長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素(1CTX)空間結(jié)構(gòu)圖；圖3是本發(fā)明所述的短鏈神經(jīng)毒素(A)和長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素(B)的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；圖4是本發(fā)明所述的神經(jīng)毒素SDS-PAGE電泳圖；其中Lane 1protein molecular weight marker，Lane 2～3cobra neurotoxin，5ug，10ug圖5是電噴霧質(zhì)譜測(cè)定本發(fā)明所述的神經(jīng)毒素的分子量；圖6是本發(fā)明所述的眼鏡蛇神經(jīng)毒素毛細(xì)管電泳圖；圖7是所述的神經(jīng)毒素純度測(cè)定HPLC圖(a)及主峰的全波長(zhǎng)(190-800nm)掃描圖(b)；圖8是提取的蛇毒腺總DNA；其中Lane 1～3total RNALane 41 kbp DNA ladderLane 5100 bp DNA ladder；圖9是RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中Lane 1～4PCR products at different concentrations of RNA templateLane 5100bp ladder；圖10是提取重組質(zhì)粒EcoRI酶切鑒定電泳圖，其中，箭頭指示酶切出的插入片段；其中Lane 11kbp ladderLane 2～9recombinant plasmids cleaved by EcoRI
Lane 10100bp ladder；圖11是構(gòu)建的融合表達(dá)質(zhì)粒pTN314(a)，蛋白融合區(qū)域(b)；圖12是IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間表達(dá)融合蛋白的全菌體蛋白電泳圖；其中Lane 1Low molecular weight protein markerLane 2the whole cell lysate before inductionLane 3～7the whole cell lysate induction at 1，2，3，4，5 hours；圖13是誘導(dǎo)時(shí)間與菌體生長(zhǎng)密度OD600，融合蛋白表達(dá)量及在菌體中相對(duì)含量的關(guān)系圖；圖14是在E.coil菌株TOP10和BL(21)中，pTN314表達(dá)融合蛋白及滲透休克釋放的比較；其中Lane 1the first osmotic shock fluid of E.coli BL(21).
Lane 2the second osmotic shock fluid of E.coli BL(21).
Lane 3cell pellet after second osmotic shock of E.coli BL(21).
Lane 4Low molecular weight protein markerLane 5the first osmotic shock fluid of E.coli TOP10.
Lane 6the second osmotic shock fluid of E.coli TOP10.
Lane 7cell pellet after second osmotic shock of E.coli TOP10；圖15是重組(a)和天然神經(jīng)毒素(b)對(duì)煙堿誘發(fā)電流的抑制效應(yīng)曲線；圖16是構(gòu)建的分泌表達(dá)質(zhì)粒pBAD-NT(a)及分泌區(qū)域毒素基因插入位置(b)；圖17是pBAD-NT的阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE(a)和免疫印跡(b)；其中Lane1～50.2％，0.02％，0.002％，0.0002％，0.00002％of ArabinoseLane 6the control without inductionLane 7Protein molecular weight marker；圖18是菌體超聲裂解上清及沉淀，滲透休克，SDS-PAGE(a)和免疫印跡(b)；其中Lane 1protein markerLane 2the supernatant by inductionLane 3the supernatant without inductionLane 4the precipitate by inductionLane 5the precipitate without inductionLane 6the first osmotic shock fluid by inductionLane 7the first osmotic shock fluid without inductionLane 8the second osmotic shock fluid by inductionLane 9the second osmotic shock fluid without induction圖19是溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體pBV-NT；圖20是表達(dá)載體pBV-NT的溫度誘導(dǎo)表達(dá)；其中Lane 1low molecular weight of protein markerLane 2before inductionLane 3～6induction time at 1，2，3，4 hours.
Lane 7native cobra neurotoxin；圖21是間接ELISA法檢查兔血清抗體效價(jià)，箭頭所指稀釋倍數(shù)為256，其中，Neurotoxin 1μg/ml(a)，2μg/ml(b)；圖22是EKMaxTM在溶液中25℃對(duì)融合蛋白的裂解作用，酶解時(shí)間為24小時(shí)(a)，36小時(shí)(b)，其中
Lane 1Protein molecular weight markerLane 2～6addition of 0.1，0.2，0.3，0.5，1.0uEKMaxTMLane 7control without EKMaxTMLane 8native neurotoxin；圖23是不同濃度比例的K3PO4、CaCl2對(duì)融合蛋白酶的影響，沉淀部分(a)和上清部分(b)；其中Lane 1Protein molecular weight markerLane 2control without EKMaxLane 3～8the addition of K3PO41.0，2.0，3.0，4.0，5.0mM respectively.
Lane 9native neurotoxin；圖24是固相酶解產(chǎn)物的純化(a)，和免疫印跡(b)；其中Lane 1protein markerLane 2precipate from EXMax digestionLane 3the elute from 10mM HCLLane 4the elute from 100mM HCLLane 5native neurotoxin；圖25是EKMax對(duì)天然神經(jīng)毒素的非特異酶切，其中Lane 1polypaptide markerLane 2～6addition of EKMax 4.0，1.0，5.0，0.2，0.1 unitLane 7control without EKMax；圖26是DP插入片段PCR擴(kuò)增，其中Lane 1100bp DNA markerLane 2～4Amplified the DNA fragmentsLane 5100bp ladder；圖27是DP插入片段及載體雙酶切，其中Lane 1double-digested pTN314Lane 2control of pTN314Lane 3double-digested DP insertLane 4control of DP insertLane 5100bp ladder；圖28是帶有酸解位點(diǎn)的表達(dá)質(zhì)粒pTN314(a)，和融合表達(dá)區(qū)域(b)；圖29是用甲酸和乙酸解融合蛋白，在37℃，保溫24小時(shí)(a)和48小時(shí)(b)，在85℃保溫1小時(shí)(c)，其中ALane 1protein molecular weight markerLane 2control without acidLane 3～4addition of 13％and 26％ of acetic acid respectivelyLane 5～6addition of 35％and 70％of formic acid respectivelyBLane 1～2addition of 13％and 26％of acetic acid respectivelyLane 3～4addition of 35％and 70％ of formic acid respectivelyLane 5control without acidLane 6protein molecular weight markerLane 7native neurotoxin in 13％ of acetic acidLane 8native neurotoxin in 70％ of formic acidCLane 1control without acid
Lane 2protein molecular weight markerLane 3～4addition of 13％and 26％of acetic acid respectivelyLane 5～6addition of 35％and 70％of formic acid respectivelyLane 7native neurotoxinLane 8native neurotoxin in 13％ of formic acid；圖30是不同濃度稀鹽酸在85℃保溫2小時(shí)酸融合蛋白(a)，免疫印跡對(duì)照(b)，和免疫印跡(c)，b和c上樣量為a的1/4，其中A Lane 1native neurotoxinLane 2protein molecular weight markerLane 3～7addition of 100，50，25，10，5mM of HCl respectivelyLane 8fusion protein control without acidB and CWestern blot.The loading sample of B and C were as much as about1/4 of the sample in A.
Lane 1protein molecular weight markerLane 2～5addition of 100，50，25，10，5mM of HCl respectivelyLane 6fusion protein control without acidLane 7native neurotoxin in 100mM of HClLane 8native neurotoxin；圖31是酸解液中未水解融合蛋白和釋放的重組神經(jīng)毒素分別所占比例，重組神經(jīng)毒素的得率；圖32是天門冬氨酸C端肽鍵裂解反應(yīng)機(jī)制；圖33是重組神經(jīng)毒素的毛細(xì)管電泳，遷移時(shí)間為14.09min；圖34是色譜流動(dòng)相組成的優(yōu)化，dil指將樣品濃度稀釋一倍，control為以基本流動(dòng)相進(jìn)行分離的對(duì)照，a，b，c為不同添加劑，c1-c5指添加c的不同濃度；圖35是離子交換法純化融合蛋白色譜圖(a)和相應(yīng)組分電泳圖(b)；其中Lane 1flow-throughLane 2protein molecular weight markerLane 3～4.8～9impurities in the osmotic shock fluid.
Lane 5～7the fractions of fusion protein；圖36是XK16/60 Superdex 75 prep的柱效測(cè)定；圖37是凝膠層析分離重組神經(jīng)毒素；圖38是重組神經(jīng)毒素脫鹽，(1)重組神經(jīng)毒素峰，紫外280nm，(2)鹽峰，電導(dǎo)檢測(cè)；圖39是每步純化產(chǎn)物電泳純度分析(a)及其免疫印跡檢測(cè)(b)；其中ALane 1，6fusion proteins from ion exchange colum.
Lane 2acedic lysateLane 3recombinant neurotoxinLane 4protein molecular weight markerLane 5native neurotoxinBLane 1osmotic shock fluidLane 2fusion protein from ion exchange column.
Lane 3acetic lysateLane 4recombinant neurotoxinLane 5native neurotoxin；
圖40是重組神經(jīng)毒素的電噴霧質(zhì)譜；圖41是反向高效液相色譜測(cè)定重組神經(jīng)毒素純度(1)和溶劑空白(2)；圖42是重組神經(jīng)毒素主峰()的全波長(zhǎng)掃描圖；圖43是重組神經(jīng)毒素的毛細(xì)管自由區(qū)帶電泳圖；圖44是重組(a)及天然神經(jīng)毒素(b)的LD50測(cè)定；圖45是膜片鉗實(shí)驗(yàn)裝置示意圖；圖46是全細(xì)胞膜片鉗給藥方式示意圖；圖47是培養(yǎng)的新生大鼠骨骼肌細(xì)胞；圖48是培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞的電壓門控通道電流，電壓去極化刺激從-70mV到40mV，步階10mV，共12次，可見外向鉀電流和內(nèi)向鈉電流；圖49是80mmol/L誘發(fā)骨骼肌煙堿電流的可重復(fù)性；圖50是天然神經(jīng)毒素對(duì)煙堿電流的抑制作用；其中Lane 1control，80mM nicotine-evoked currents by recombinant neurotoxinLane 2 and 380mM nicotine+2.3uM native neurotoxinLane 480mM nicotine+11.5uM native neurotoxinLane 5 and 680mM nicotine+23uM native neurotoxin；圖51是重組神經(jīng)毒素對(duì)煙堿電流的抑制作用；其中Lane 1control，80mM nicotine-evoked currentsLane 280mM nicotine+11.5uM native neurotoxinLane 3 and 480mM nicotine+23uM native neurotoxin圖52是重組(a)和天然神經(jīng)毒素(b)對(duì)煙堿誘發(fā)電流的抑制效應(yīng)曲線。
權(quán)利要求
1.一種融和方式可溶表達(dá)眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白、酸解釋放及其純化方法，其特征在于所述的方法包括(1)神經(jīng)毒素基因的克?。?2)可溶融合表達(dá)；(3)酸解；(4)酸解反應(yīng)完成后，加入Tris堿至50mM，酸解液pH被調(diào)節(jié)至7.0左右，經(jīng)電泳檢查酸解完全后，進(jìn)行凝膠柱純化；(5)重組蛋白主峰收集，真空冷凍濃縮，脫鹽，收集蛋白峰，測(cè)定重組蛋白濃度約為0.5mg/ml，重組神經(jīng)毒素的最終得率為35.3％(以滲透休克獲得量為1)；(6)重組神經(jīng)毒素的綜合得率純化步驟 得率純度滲透休克 100％ 65％離子交換 82％90％酸解 63％28％凝膠過濾 76％脫鹽純品 91％＞95％最終得率 35.3％
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的可溶融合表達(dá)方法包括(1)在神經(jīng)毒素基因兩端分別加Kpn I和Sal I位點(diǎn)(陰影中的堿基序列)正向引物5’ CGG GTA CCG CTG GAA TGT CAC反向引物5’ GGC GTC GAC TTA ATT GTT GCA TCT以含神經(jīng)毒素基因的T載體為模板進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸26秒，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；Kpn I和Sal I酶切PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物，回收DNA，作為插入片斷；(2)載體雙酶切及連接轉(zhuǎn)化pThioHis C載體提取，Kpn I和Sal I雙酶切，載體膠回收等，依常規(guī)程序進(jìn)行；電泳估計(jì)酶切載體及插入片斷的濃度，以不同量的載體與等量的插入片斷進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP 10 E.coli，37℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑選幾個(gè)單菌落測(cè)序，確定插入片斷正確連入載體中；(3)神經(jīng)毒素融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)接種單菌落至50mlLB液體培養(yǎng)基(100μg/ml氨芐青霉素)中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1∶50接種至新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體OD600約為0.5；加入IPTC至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)四個(gè)小時(shí)；在加入IPTC前和加入后每隔1小時(shí)取0.1ml菌液，離心，棄去上清，菌體分別標(biāo)記為0，1，2，3，4，5小時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；加入2x SDS-PAGE上樣緩沖液0.1ml，充分混勻，95℃水浴加熱10分鐘；20μl上樣，電泳檢查；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的融合蛋白的滲透休克釋放包括接種單菌落至50mlLB液體培養(yǎng)基(100μg/ml氨芐青霉素)中，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1∶50接種至新鮮LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至菌體OD600約為0.5；加入IPTG至濃度為1mmol/L；繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5小時(shí)；測(cè)定菌體OD600值，4℃ 6,000rpm離心收集菌體，棄上清，將菌體懸浮于適量冷滲透休克1#溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA，20％蔗糖)，使菌體密度OD600約為5.0，冰水浴，10分鐘；離心，棄去上清，菌體懸浮于等量的冷滲透休克2#溶液中(20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA)，冰水浴，10分鐘；4℃ 10,000rpm離心15分鐘，取上清，-20℃凍存；蛋白電泳檢查；pTN314表達(dá)載體的可溶表達(dá)量為為28％，其純化方式為滲透休克并且復(fù)性情況為不需；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的酸解包括(1)在融合蛋白位點(diǎn)的酸敏感位點(diǎn)(DP)的引入 如上所示，該圖為設(shè)計(jì)的插入D-P的融合位點(diǎn)序列圖，pTN314的質(zhì)粒神經(jīng)毒素基因的5’端和3’端終止密碼子后，有Kpn I和pst I位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物將編碼酸敏感位點(diǎn)DP的堿基序列GAT CCG加到神經(jīng)毒素基因5’端，框內(nèi)為酶切位點(diǎn)，陰影部分為編碼D-P的堿基序列； (2)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增；以0.5μl p TN314為模板，正向和反向引物各0.5μl，PCR緩沖液5μl，dNTP 4μl，加水至50μl，混勻；94℃變性1.0分鐘，65℃復(fù)性45秒，72℃延伸1.0秒，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸5分鐘；(3)DP插入表達(dá)載體的構(gòu)建擴(kuò)增的DNA片斷如圖26，長(zhǎng)約200bp；擴(kuò)增片斷與質(zhì)粒pTN314被KpnI和Pst I雙酶切，結(jié)果如圖27；可以看到酶切后的擴(kuò)增片斷比酶切之前略小，但大于pTN314切出的小片斷，與實(shí)際相符；轉(zhuǎn)化后的挑選單菌落，測(cè)序按常規(guī)方法進(jìn)行；重組質(zhì)粒如圖28，命名為pTNP314；(4)融合蛋白的酸解釋放濃度為5-100mM的稀鹽酸在85℃，作用2小時(shí)，融合蛋白被高效裂解，當(dāng)酸終濃度為25mM時(shí)，重組蛋白得率最高為63％，占酸解液中總蛋白含量為28％，此時(shí)裂解溶液pH約為2.2；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的純化方法包括(1)重組毒素與載體蛋白的分離色譜柱XK16/60裝填Superdex 75 prep介質(zhì)流動(dòng)相50mM Tris，pH8.0，0.15 M NaCl以1.0ml/min的流速，用兩個(gè)柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱，取酸解后Tris中和的融合蛋白溶液5ml，上樣；峰收集組分，-25℃凍存；(2)重組蛋白的濃縮與脫鹽流動(dòng)相5mM NEPES，pH7.0，25mM NaCl凝膠分離的重組神經(jīng)毒素凍干，測(cè)定重組蛋白含量，將重組蛋白以1mg/ml溶于純水中，每次上樣1.0ml，紫外及電導(dǎo)檢測(cè)，HiTrap Desalting Superdex G-25柱脫鹽；收集蛋白組分，BCA法測(cè)定蛋白含量，-25℃凍存；
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼鏡蛇神經(jīng)毒素蛋白的融和可溶表達(dá)、重組神經(jīng)毒素的酸裂解釋放及其生產(chǎn)純化方法，包括天然毒素的理化性質(zhì)及序列的測(cè)定、神經(jīng)毒素基因的克隆和以融合方式的可溶表達(dá)、重組蛋白的融合位點(diǎn)的改造以及重組毒素的酸裂解釋放以及純化；采用本發(fā)明所述的用基因工程的方法表達(dá)生產(chǎn)重組神經(jīng)毒素可獲得大量可用于臨床的重組神經(jīng)毒素，可以使毒素的來(lái)源不受自然條件的制約。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1453294SQ02117198
公開日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2002年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月25日
發(fā)明者徐康森, 王永保, 劉兢 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所