專利名稱：利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌r－8進行油品脫硫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法。
背景技術(shù)：
石油及其產(chǎn)品中含有的硫化物燃燒時產(chǎn)生二氧化硫，造成環(huán)境污染，并且是導致酸雨形成的主要原因之一，對人類的可持續(xù)發(fā)展造成了威脅。同時，硫化物的存在還會影響燃料及其產(chǎn)品的外觀，腐蝕輸送設(shè)備。為此必須脫除石油及其產(chǎn)品中的硫化物。目前，世界發(fā)達國家都制定出嚴格的規(guī)定來控制石油產(chǎn)品中的硫含量，我國SO2的排放量遠遠超過世界平均水平。面對日益嚴峻的環(huán)保形勢，我國政府實施了可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，大力推行清潔生產(chǎn)，并頒布了一系列環(huán)保法規(guī)。初步提出將目前柴油硫含量從5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市車用柴油中硫含量低于500ppm的要求。因此，開發(fā)高效、低成本的燃料脫硫技術(shù)，將對我國實施的環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略產(chǎn)生積極而深遠的影響。常用的脫硫方法有物理、化學和生物法。物理和化學法能有效脫除燃料中的無機硫和部分有機硫。目前普遍采用脫有機硫的方法為加氫脫硫(以下簡稱HDS)。HDS是一個需要催化劑和氫氣的高溫高壓過程，對于雜環(huán)類含硫化合物，如二苯并噻酚(以下簡稱DBT)、帶有烷基取代的DBT類化合物特別是4，6-二甲基二苯并噻吩(以下簡稱DMDBT)(見圖1)，HDS催化劑受烷基空間位阻的影響，脫硫速度大大降低。僅靠HDS很難滿足日益增加的超低硫燃料的生產(chǎn)要求。
生物脫硫(以下簡稱BDS)是利用微生物對硫源的特殊需要或代謝方式來實現(xiàn)硫脫除的方法。它具有反應(yīng)專一、效率高、常溫常壓操作及受烷基空間位阻影響小的特點。另外，其設(shè)備投資僅為加氫脫硫的30％，反應(yīng)過程沒有有害產(chǎn)物生成，可以實現(xiàn)深度脫硫，是一種具有廣闊發(fā)展前途的清潔燃料生產(chǎn)技術(shù)。目前，已分離了多種能脫除DBT中硫的微生物，其中有好氧菌和厭氧菌。厭氧脫硫菌如Desulfovibrio desulfurcans M6能厭氧降解DBT，并主要產(chǎn)生聯(lián)苯。但轉(zhuǎn)化率低，速度慢。好氧性脫硫菌主要有兩種脫硫途徑，一種是以攻擊C-C鍵為代表的“Kodama途徑”(如圖2)，這種類型的代謝，由于含碳結(jié)構(gòu)脫除，從而導致燃料燃燒值的降低。因此在石油及其產(chǎn)品的脫硫應(yīng)用方面受到限制；另一種是以攻擊“C-S”鍵為代表的硫特異性途徑，又稱為“4S途徑”(如圖3)，這一途徑的優(yōu)點是對底物的破壞作用很小，從而對其燃燒值的影響較小。現(xiàn)在國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了幾十株能專一性脫硫的微生物。
要實現(xiàn)BDS的工業(yè)化，必需從BDS的工藝過程進行考慮，其中限制BDS工業(yè)化的主要因素為生物催化劑的生產(chǎn)成本，油水相比，即與反應(yīng)器的體積反應(yīng)速率密切相關(guān)。BDS可以采用游離形式的整細胞或酶，或固定化的整細胞或酶對油品進行脫硫。由于游離細胞或酶在油水相脫硫過程中油水相乳化嚴重，導致后期分離及生物催化劑的回收再利用非常困難。為了克服這些問題，固定化生物催化劑是最好的解決方法。另外，BDS是一個多酶反應(yīng)過程，并且需要輔因子NADH的參與，因此采用固定化酶的方法勢必導致生物催化劑的生產(chǎn)成本大幅度上升。由此可見，固定化整細胞是促進BDS工業(yè)化不可缺的先決條件。從現(xiàn)有的文獻可以看出，有關(guān)固定化細胞脫硫的研究屈指可數(shù)。其中，韓國的Chang等人(Chang et al.FEMS Microbiol.Lett.，2000，182309-312.)采用硅藻土吸附的方法對Gordona sp.CYKS1和Nocardia sp.CYKS2進行了固定化，并用此固定化細胞進行了模擬油(DBT溶于十六烷)體系和輕汽油的脫硫。該方法是采用的吸附固定化方法。由于吸附的細胞很容易從載體脫落，仍然會對后期分離帶來困難。Naito等人(Naito et al.Appl Microbiol.Biotechnol.2001，55374-378.)嘗試了凝膠包埋的方法對R.erythropolis KA2-5-1進行了固定化研究，得到比較好的脫硫結(jié)果。其所選ENT-4000載體固定化的細胞在模擬油(DBT溶于十四烷)水相體系中的活性最好，該催化劑可重復使用達900h。
我國在油品微生物脫硫研究方面還處于起步階段。中國科學院過程工程研究所分離科學與工程青年實驗室分離的革蘭氏陰性脫硫菌—德氏假單胞菌(Pseudomonas delafieldii)R-8能選擇性脫除DBT中的硫生成2-羥基聯(lián)苯，以硫酸鹽的形式將硫釋放到水相。該菌具有較好的脫除柴油中有機硫化物的能力(姜成英，劉會洲，邢建民等.德氏假單胞菌菌株及其在脫除含硫有機化合物中硫的應(yīng)用[P].中國專利，ZL01115921.9，2001-05-28)。但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，游離的R-8菌株在油水相脫硫反應(yīng)后，油水相乳化嚴重，給油相的分離及生物催化劑的回收再利用造成很大的困難，從而會導致生物催化劑生產(chǎn)成本的上升。另外，反應(yīng)過程中有油溶性色素產(chǎn)生，造成油品的污染。
由于海藻酸鈣生物相容性好，價格便宜，因此常用作生物催化劑固定化載體。并且海藻酸鈣固定化生物催化劑也常用于有機相酶催化反應(yīng)。Naito等人(Naito etal.Appl Microbiol.Biotechnol.2001，55374-378.)雖然也采用了海藻酸鈣作為固定化載體，但由于其對模擬油體系的脫硫反應(yīng)過程中未加水相，而海藻酸鈣為親水性載體，從而導致脫硫效率不高。另外，在Naito等人的研究中，兩次脫硫過程中需要一個固定化細胞的活化過程，從而增加了工藝的復雜性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法，即采用海藻酸鈣包埋法對德氏假單胞菌R-8(保藏號CGMCC 0570)進行固定化，并用此固定化細胞脫除油相中的有機硫化合物；具有固定化細胞活性高，穩(wěn)定性好，能有效降低油水比提高體積反應(yīng)速率，易于實現(xiàn)生物催化劑的回收、再生和重復使用的優(yōu)點，并可避免游離細胞脫硫反應(yīng)所產(chǎn)生色素對油品的污染；海藻酸鈉價格便宜，生物相容性好；其工藝簡單，生產(chǎn)成本低，易于在工業(yè)上應(yīng)用。
本發(fā)明的實施方案如下本發(fā)明提供的利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法，其工藝步驟如下1)保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8對數(shù)生長期或靜止期細胞的制備挑取1～2環(huán)斜面保存或0.5～1毫升甘油保存的德氏假單胞菌R-8菌株，加入到體積為20～50毫升的培養(yǎng)基中，在30℃，170r/min的條件下培養(yǎng)1～2天后，再將培養(yǎng)后的德氏假單胞菌R-8菌株接種至含150ml上述培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，搖床或發(fā)酵罐培養(yǎng)，5000rpm離心6min獲得德氏假單胞菌R-8對數(shù)生長期或靜止期細胞；將收集到的細胞用生理鹽水洗滌2～3次，所得菌體懸浮于生理鹽水中，得保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8菌體的生理鹽水菌懸液；在4℃冰箱中放置待用；所用培養(yǎng)基組成如下去離子水1000ml，KH2PO42.44g；Na2HPO4·12H2O12.03g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g和硫源，所述硫源為二苯并噻吩，硫酸鈉或二甲基亞砜；2)用海藻酸鈣包埋所獲得的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8菌體稱取海藻酸鈉溶于去離子水、生理鹽水或增殖培養(yǎng)基中，制成質(zhì)量百分比濃度為2～6％海藻酸鈉水溶液，然后與等體積含德氏假單胞菌R-8菌體的生理鹽水菌懸液均勻混合；將此混合液用針筒、滴定管或其它裝置擠入0.1～2M CaCl2水溶液中，形成直徑為1～5mm用海藻酸鈣固定化的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8細胞的小球；室溫下固化0.5～2小時，冰箱放置過夜；所用增殖培養(yǎng)基組成如下去離子水1000ml，KH2PO40.24g；Na2HPO4·12H2O1.20g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g；3)增殖培養(yǎng)上述固定化細胞將第2步中所制得的海藻酸鈣固定化的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8的固定化細胞從冰箱取出，用去離子水或生理鹽水洗滌3～4次，然后使其懸浮于固定化細胞增殖培養(yǎng)基中，所述硫源為二苯并噻吩，于30℃，170r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)1～2天；4)油品的脫硫取增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8的固定化細胞，傾去培養(yǎng)液，加入含硫油相和水相，進行脫硫反應(yīng)，水相的體積占油水相總體積的0～50％。當硫含量降到0～30ppm以后，將油相、水相同固定化細胞分離；油水相采用常用的液液分離手段分離。所述水相為生理鹽水或增值培養(yǎng)基；5)上述固定化細胞的重復使用在經(jīng)4)步反應(yīng)后的固定化細胞中加入含硫油相和水相，進行脫硫反應(yīng)，水相的體積占油水相總體積的0～50％。當硫含量降到0～30ppm以后，將油水相同固定化細胞分離；油水相采用常用的液液分離手段分離。所述水相為生理鹽水或增值培養(yǎng)基；重復此過程，實現(xiàn)海藻酸鈣固定化的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8的固定化細胞對油品脫硫的多次使用。
本發(fā)明提供的利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法，適用于溶有DBT的十二烷、十四烷或十六烷的油相或柴油、加氫脫硫柴油、汽油等油相的油品脫硫；具有固定化細胞活性高，穩(wěn)定性好，能有效降低油水相體積比提高體積反應(yīng)速率，易于實現(xiàn)生物催化劑的回收、再生和重復使用的優(yōu)點，并可避免游離細胞脫硫反應(yīng)所產(chǎn)生色素對油品的污染；海藻酸鈉價格便宜，生物相容性好；其工藝簡單，生產(chǎn)成本低，易于在工業(yè)上應(yīng)用。


附圖1為模型化合物DBT的分子結(jié)構(gòu)圖；附圖2為模型化合物DMDBT的分子結(jié)構(gòu)圖；附圖3為生物脫硫的“4S途徑”示意圖；A為二苯并噻吩 B為二苯并噻吩亞砜C二苯并噻砜D為羥基聯(lián)苯磺酸E為羥基聯(lián)苯附圖4為海藻酸鈣固定化細胞脫除模擬油(十二烷)中的4，6-二甲基二苯并噻酚(DMDBT)中硫的脫硫曲線圖；—■—為DMDBT的脫硫曲線 —●—為脫硫產(chǎn)物曲線；附圖5為重復使用海藻酸鈣固定化細胞脫除模擬油(十二烷)中的二苯并噻吩(DBT)中的硫的脫硫曲線圖；1為第1次脫硫曲線2為第2次脫硫曲線3為第3次脫硫曲線，4為第4次脫硫曲線5為第1次脫硫曲線。
具體實施例方式
實施例11.培養(yǎng)保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8的對數(shù)生長期細胞挑取營養(yǎng)斜面培養(yǎng)的德氏假單胞菌R-8菌株，加入體積為25毫升的培養(yǎng)基中，在30℃，170r/min的條件下培養(yǎng)2天，再將培養(yǎng)后的德氏假單胞菌R-8菌株接種至含150ml上述培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5000rpm離心6min獲得德氏假單胞菌R-8菌體；將其用生理鹽水洗滌2～3次，所得德氏假單胞菌R-8菌體懸浮于生理鹽水中，在4℃冰箱中放置；培養(yǎng)基的組成如下去離子水1000ml，KH2PO42.44g；Na2HPO4·12H2O 12.03g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g，二苯并噻吩0.1mmol/L；2.用海藻酸鈣包埋所獲得的德氏假單胞菌R-8對數(shù)生長期細胞稱取海藻酸鈉溶于去離子水中，制成質(zhì)量百分比濃度為4％的海藻酸鈉水溶液，然后與等體積含德氏假單胞菌R-8菌體的生理鹽水菌懸液均勻混合；將此混合液用針筒擠入0.1M CaCl2水溶液中，形成直徑為3mm左右用海藻酸鈣固定化的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8細胞的小球；室溫下固化2小時，冰箱放置過夜；3.增殖培養(yǎng)將第2步中所制得的海藻酸鈣固定化細胞從冰箱取出，用生理鹽水洗滌3次，然后懸浮于固定化細胞增殖培養(yǎng)基中，硫源為0.1mmol/L二苯并噻吩；于30℃，170r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2天，得到增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化細胞；所用增殖培養(yǎng)基組成如下去離子水1000ml，KH2PO40.24g；Na2HPO4·12H2O1.20g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g；4.油品的脫硫處理用步驟3得到的增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化細胞脫除十二烷模擬油(十二烷)相中的DBT的硫，其具體步驟如下取步驟3得到的增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化細胞(細胞含量相當于0.2g干細胞)于100ml三角瓶中，加5ml增殖培養(yǎng)基和5ml十二烷(溶解了1mmol/LDBT)，水相體積占油水相總體積的50％；在30℃，170r/min條件下，搖床反應(yīng)；十二烷中的DBT及脫硫產(chǎn)物2-羥基聯(lián)苯(2-HBP)含量采用高效液相色譜(HPLC)分析測定；反應(yīng)24h，DBT殘留量僅為0.02mmol/L，生成0.68mmol/L2-HBP。
取步驟3得到的增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化細胞(細胞含量相當于0.2g干細胞)于100ml三角瓶中，加10ml十二烷(溶解了1mmol/L 4，6-DMDBT)，水相體積占油水相總體積的0％；在30℃，170r/min條件下，搖床反應(yīng)；十二烷中的4，6-DBT及脫硫產(chǎn)物2-羥基-3，3’-二甲基聯(lián)苯(HDMBP)含量采用高效液相色譜(HPLC)分析測定；反應(yīng)28小時，4，6-DMDBT全部降解，生成0.8mmol/LHDMBP，其結(jié)果見附圖4。
3.增殖培養(yǎng)將步驟2所制得的海藻酸鈣固定化細胞從冰箱取出，用生理鹽水洗滌4次，然后懸浮于固定化細胞增殖培養(yǎng)基中，硫源為0.1mmol/L二苯并噻吩；于30℃，170r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2天，得到增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化細胞；所用增殖培養(yǎng)基組成如下去離子水1000ml，KH2PO40.24g；Na2HPO4·12H2O1.20g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g；4.油品的脫硫處理用步驟3得到的增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化細胞脫除汽油中的硫，其具體步驟如下取步驟3得到的增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣固定化細胞(細胞含量相當于0.5g干細胞)于100ml三角瓶中，加10ml汽油和2ml增值培養(yǎng)基，水相體積占油水相總體積的17％；在30℃，170r/min條件下，搖床反應(yīng)24小時；固定化細胞脫硫前后汽油中的硫含量分別為50ppm和0ppm。
權(quán)利要求
1.一種利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法，其工藝步驟如下1)保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8對數(shù)生長期或靜止期細胞的制備挑取1～2環(huán)斜面保存或0.5～1毫升甘油保存的德氏假單胞菌R-8菌株，加入到體積為20～50毫升的培養(yǎng)基中，在30℃，170r/min的條件下培養(yǎng)1～2天后，再將培養(yǎng)后的德氏假單胞菌R-8菌株接種至含150ml上述培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，搖床或發(fā)酵罐培養(yǎng)，5000rpm離心6min獲得德氏假單胞菌R-8對數(shù)生長期或靜止期細胞；將收集到的細胞用生理鹽水洗滌2～3次，所得菌體懸浮于生理鹽水中，得保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8菌體的生理鹽水菌懸液；在4℃冰箱中放置待用；所用培養(yǎng)基組成如下去離子水1000ml，KH2PO42.44g；Na2HPO4·12H2O12.03g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g和硫源，所述硫源為二苯并噻吩，硫酸鈉或二甲基亞砜；2)用海藻酸鈣包埋所獲得的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8菌體稱取海藻酸鈉溶于去離子水、生理鹽水或增殖培養(yǎng)基中，制成質(zhì)量百分比濃度為2～6％海藻酸鈉水溶液，然后與等體積含德氏假單胞菌R-8菌體的生理鹽水菌懸液均勻混合；將此混合液用針筒、滴定管或其它裝置擠入0.1～2M CaCl2水溶液中，形成直徑為1～5mm用海藻酸鈣固定化的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8細胞的小球；室溫下固化0.5～2h，冰箱放置過夜；所用增殖培養(yǎng)基組成如下去離子水1000ml，KH2PO40.24g；Na2HPO4·12H2O1.20g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g；3)增殖培養(yǎng)上述固定化細胞將第2步中所制得的海藻酸鈣固定化的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8的固定化細胞從冰箱取出，用去離子水或生理鹽水洗滌3～4次，然后使其懸浮于固定化細胞增殖培養(yǎng)基中，硫源為0.1mmol/L二苯并噻吩；于30℃，170r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)1～2天；4)油品的脫硫取增殖培養(yǎng)活化后的海藻酸鈣的保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R-8固定化細胞，傾去培養(yǎng)液，加入含硫油相和水相，進行脫硫反應(yīng)，水相的體積占油水相總體積的0～50％。當硫含量降到0～30ppm以后，將油水相同固定化細胞分離；所述水相為生理鹽水或增值培養(yǎng)基。
2.按權(quán)利要求1所述的利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法，其特征在于，所述的油品為汽油，柴油和加氫脫硫柴油。
3.按權(quán)利要求2所述的利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法，其特征在于，所述油品為有機硫含量50～1000ppm的汽油，柴油和加氫脫硫柴油。
4.按權(quán)利要求1所述的利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R-8進行油品脫硫的方法，其特征在于，步驟4)分離得到的固定化細胞再用于含硫油品的脫硫處理在步驟4)分離得到的固定化細胞中加入含硫油相和水相，進行脫硫反應(yīng)，水相的體積占油水相總體積的0～50％，所述水相為生理鹽水或增值培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及的利用海藻酸鈣固定化德氏假單胞菌R－8進行油品脫硫的方法，其步驟如下1.保藏號為CGMCC 0570的德氏假單胞菌R－8對數(shù)生長期或靜止期細胞的制備；2.用海藻酸鈣包埋所獲得的德氏假單胞菌R－8菌體；3.增殖培養(yǎng)所得固定化細胞；4.油品的脫硫；5.按步驟4中的油品脫硫方法重復步驟4的過程；該方法的固定化細胞活性高、穩(wěn)定性好、易于回收生物催化劑重復使用，并可避免游離細胞脫硫反應(yīng)所產(chǎn)生色素對油品的污染；海藻酸鈉價格便宜，生物相容性好。故本法工藝簡單，生產(chǎn)成本低，并易于在工業(yè)上應(yīng)用。
文檔編號C12P5/00GK1458229SQ0211776
公開日2003年11月26日 申請日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者羅明芳, 劉會洲, 邢建民, 緱仲軒, 李珊, 陳家鏞 申請人:中國科學院過程工程研究所