專利名稱：一種陰離子型層狀材料固定化酶及其制備方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種陰離子型層狀材料固定化酶及其制備方法。
為了克服游離酶的缺點，人們想到選擇適當(dāng)?shù)妮d體將酶固定化，這樣酶分子由于周圍微環(huán)境的改變，其熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性得到提高，可使酶的使用壽命延長數(shù)百倍，且固定化酶很容易與液相反應(yīng)物、產(chǎn)物分離，因此可反復(fù)使用。目前，固定化酶(Immobilized Enzyme，簡寫為IME)已在工業(yè)催化劑得到廣泛應(yīng)用，另外其他領(lǐng)域如生物分離與提純、診斷、生物過程和疾病治療方面也受益于固定化酶的發(fā)展。
固定化酶的載體分無機(jī)載體和有機(jī)載體。由于酶易以化學(xué)的方式與有機(jī)聚合物結(jié)合，使之應(yīng)用越來越廣泛，但存在的主要問題是高分子載體親水性差、酶負(fù)載量小、化學(xué)穩(wěn)定性低。
目前研究者對固定化酶載體的興趣又轉(zhuǎn)移到無機(jī)載體。這不僅出于經(jīng)濟(jì)上的考慮，也是由于無機(jī)載體在物理性質(zhì)方面比有機(jī)載體更加有優(yōu)勢，例如無機(jī)載體機(jī)械強(qiáng)度高、熱穩(wěn)定性好、抗有機(jī)溶劑、抗微生物侵蝕、易操作、貨架壽命長、通過熱裂解易再生。許多無機(jī)載體還具有在更寬的pH值、溫度和壓力范圍內(nèi)不改變其結(jié)構(gòu)的優(yōu)點。
文獻(xiàn)Challa V.Kumar and George L.Mclendon，Nanoencapsulation ofCytochrome c and Horseradish Peroxidase at the Galleries of α-ZirconiumPhosphate，Chem.Mater.1997，9，863-870中介紹了直接將細(xì)胞色素酶和過氧化辣根酶固定在α-磷酸鋯層板之間，層間距增大為3.3nm，酶與載體的相互作用與α-磷酸鋯層板的功能基團(tuán)有直接關(guān)系，載體對細(xì)胞色素c的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于載體對過氧化辣根酶的親和力。其不足之處是由于α-磷酸鋯層板顯強(qiáng)酸性，這種直接固定化酶的方法只適合于少量的能在該pH值范圍內(nèi)成活的酶，并且由于酶與載體通過離子鍵相互作用，作用力相對較弱，使固定化酶的熱穩(wěn)定性較差，與游離酶幾乎相同。文獻(xiàn)中沒有討論固定化酶的操作穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是選擇具有特定反應(yīng)基團(tuán)的客體分子，通過插層方法，按層間定向力組裝進(jìn)入層狀材料層間，構(gòu)筑可進(jìn)一步反應(yīng)的“分子反應(yīng)器”，得到層柱材料。再以該材料為載體，將酶分子固定在“分子反應(yīng)器”中，得到固定化酶層柱材料。該固定化酶因受層板內(nèi)幾何結(jié)構(gòu)的限制，反應(yīng)時底物和產(chǎn)物在由層板構(gòu)筑的反應(yīng)平臺上進(jìn)行有序轉(zhuǎn)換，而酶分子不會流失。
類水滑石(Layered Double Hydroxides簡寫為LDHs)是一種陰離子型層狀材料，其典型結(jié)構(gòu)是由MgO6(ZnO6)八面體共用棱形成單元層，位于層板上的二價離子可在一定范圍內(nèi)被半徑相似的Al3+等同晶取代，使得層板帶正電荷，層間可交換的CO32-陰離子與層板上的正電荷平衡，使得這一結(jié)構(gòu)呈電中性。層與層容易被其他分子撐開，而層板結(jié)構(gòu)不受影響，這一結(jié)構(gòu)特點使層狀化合物具有可插層和組裝性能。因此選擇類水滑石作為固定酶的主體層狀材料。
客體分子選擇含有羧基和氨基基團(tuán)且其羧基數(shù)量大于等于氨基數(shù)量的分子，通過插層方法，使客體羧基與主體層板按層間定向力相互作用，組裝進(jìn)入類水滑石的層板間，而氨基作為活性基團(tuán)保留在層板之間，為后續(xù)反應(yīng)提供特定的反應(yīng)平臺。這種組裝了客體分子的類水滑石層柱材料被形象地稱著“分子反應(yīng)器”?！胺肿臃磻?yīng)器”所提供的氨基基團(tuán)與酶分子通過交聯(lián)劑形成共價鍵，使酶分子被固定在“分子反應(yīng)器”中，得到固定化酶層柱材料。
制備工藝路線是將所需結(jié)構(gòu)的類水滑石配成懸浮液，將同時含有羧基和氨基基團(tuán)的客體分子插層組裝進(jìn)入層間，然后加入交聯(lián)劑和酶分子，氨基基團(tuán)作為“分子反應(yīng)器”中的活性基團(tuán)通過交聯(lián)劑與酶分子形成共價鍵，從而形成固定化酶層柱材料，得到固定化酶。
具體操作步驟如下A制備層板二價、三價金屬陽離子摩爾比為1.6-4.5∶1的類水滑石(制備方法見專利申請00132146)，取一定量的該類水滑石加入到盛有去離子水的容器中配制濃度為0.2-2M的懸浮液，室溫下磁力攪拌，按類水滑石與客體分子完全反應(yīng)計加入過量客體分子，此時容器中由渾濁液變?yōu)槌吻迦芤?，備用；用濃度?.01-0.5M的NaOH稀溶液，加入帶冷凝和攪拌的反應(yīng)器中，一邊攪拌，一邊滴加上述備用澄清溶液，保持滴加過程pH＞9，滴加結(jié)束后，冷凝回流約6h，過濾、用熱水充分洗滌至pH＜8，于85℃左右干燥，得到層間陰離子為客體分子的類水滑石層柱材料。
B按“分子反應(yīng)器”與水的重量比為1∶50-80的比例加入帶磁力攪拌的反應(yīng)器中，按“分子反應(yīng)器”與交聯(lián)劑的重量比為1∶1-3的比例，向反應(yīng)器中加入5％wt濃度交聯(lián)劑，磁力攪拌1小時左右，過濾，充分水洗；將洗好的濾餅放入容器，加入去離子水和磷酸緩沖液以保護(hù)酶分子的催化活力，按類水滑石層柱材料與液體酶的固液比為1∶6-12的比例加入需固定的酶，于搖床中在一定溫度下固定約20h，經(jīng)離心分離，充分水洗，得到固定化酶。
所用的類水滑石的層板二價金屬陽離子M2+為A所用的類水滑石為主體層板二價金屬陽離子M2+為Mg2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、、Ca2+的任何一種，優(yōu)選Mg2+或Zn2+，三價金屬陽離子M3+為Al3+、Ga3+、Co3+、Fe3+、Cr3+、V3+、Ti3+任何一種，優(yōu)選Al3+和Fe3+；其摩爾比優(yōu)選M2+∶M3+＝2-4∶1；層間陰離子為Cl-、CO2-、NO3-、OH-、SO42-、ClO3-任何一種或幾種的組合。
所用的客體分子是同時含有羧基和氨基基團(tuán)且羧基數(shù)量大于等于氨基數(shù)量的酸，優(yōu)選谷氨酸、天冬氨酸、6-氨基己酸。更優(yōu)選谷氨酸。
所用的酶是能在各種pH值下存活的酶，如青霉素?；?、脂肪酶、過氧化辣根酶等，優(yōu)選青霉素?；?。
所用的交聯(lián)劑為任何一種含有兩個醛基基團(tuán)，且在小于40℃的溫度下能同時與酶分子中氨基和客體分子中的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)，如戊二醛、三氯化嗪等，優(yōu)選戊二醛。
效果將按以上方法準(zhǔn)備得到的固定化酶進(jìn)行操作穩(wěn)定性研究，其在37℃、底物濃度8％條件下間歇操作，可連續(xù)操作多達(dá)60次左右，固定化酶活力保持了其初始活力的80-90％。該固定化酶的熱穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)游離酶活力在45℃急劇下降時，固定化酶活力可在57℃左右仍保持不變。且該固定化酶很容易與液相反應(yīng)物、產(chǎn)物分離


圖1是固定化酶結(jié)構(gòu)模型示意圖。
固定化酶的結(jié)構(gòu)如圖1所示，在類水滑石的主體層板之間，客體分子的羧基功能基團(tuán)2與帶正電荷的層板1形成離子鍵，客體分子所帶的氨基功能基團(tuán)與交聯(lián)劑所帶的醛基反應(yīng)生成西夫堿基團(tuán)3，酶分子4與交聯(lián)劑以共價鍵5結(jié)合。
配制濃度為0.05M的NaOH溶液，倒入帶有冷凝和攪拌裝置的反應(yīng)器中，一邊攪拌，一邊滴加上述備用澄清溶液，保持滴加過程pH＞9，滴加結(jié)束后，冷凝回流6h，過濾、用熱水充分洗滌至pH＜8，于85℃干燥24h，得到層間陰離子為谷氨酸的Mg-Al型類水滑石層柱材料。
B取上述0.5g谷氨酸柱撐LDHs于裝有30ml去離子水的燒杯中，加入10ml5％戊二醛，磁力攪拌1小時，過濾，充分水洗。加入80ml去離子水和1.25mlpH＝7.93的磷酸緩沖液，加入4.5ml(167U/ml)青霉素酰化酶，于搖床中30℃固定20小時，離心分離，充分水洗，得到固定化青霉素?；?。
由步驟A樣品的X射線衍射圖可知，其特征衍射峰向小角度移動，在2θ＝7.6°處出現(xiàn)層間距為d003＝1.2nm(大于未插入客體分子的類水滑石樣品d003＝0.76nm)的特征衍射峰；IR譜圖顯示，其1377cm-1處CO32-峰消失，代之分別在1594cm-1處出現(xiàn)N-H彎曲振動，在1405、1356cm-1處出現(xiàn)羧酸根離子的不對稱和對稱吸收譜帶，說明谷氨酸組裝進(jìn)入LDHs層間。
由步驟B制備的樣品的X射線衍射圖可知，在更小的角度2θ＝1.8°處出現(xiàn)層間距為d＝4.4nm較弱的特征峰；由IR譜圖可以看出，除層柱材料的特征譜帶外，在1639cm-1處出現(xiàn)西夫堿C＝N的振動譜帶，證明青霉素酰化酶已存在層板之間。
固定化酶的操作穩(wěn)定性研究顯示，在間歇反應(yīng)器中連續(xù)操作50次后，固定化酶活力保持了其初始活力的90％；固定化酶的熱穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)游離酶活力在45℃急劇下降時，固定化酶活力在55℃仍保持不變。
B按實施例1的方法制備得到固定化青霉素?；?。
步驟B制備的樣品X射線衍射圖和IR表征結(jié)果與例1類似，證明青霉素?；阜肿右殉晒Φ毓潭ㄔ趯影逯g。
固定化酶的操作穩(wěn)定性研究顯示，在間歇反應(yīng)器中連續(xù)操作60次后，固定化酶活力保持了其初始活力的80％；固定化酶的熱穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)游離酶活力在45℃急劇下降時，固定化酶活力在55℃仍保持不變。
B按實施例1的方法制備得到固定化青霉素酰化酶。
步驟B制備的樣品X射線衍射和IR表征結(jié)果與例1類似，證明青霉素酰化酶分子已成功地固定在層板之間。
固定化酶的操作穩(wěn)定性研究顯示，在間歇反應(yīng)器中連續(xù)操作40次后，固定化酶活力保持了其初始活力的80％；固定化酶的熱穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)游離酶活力在45℃急劇下降時，固定化酶活力在55℃仍保持不變。實施例4A制備Zn2+∶Al3+＝1.6∶1的Zn-Al類水滑石，將該類水滑石4.0g加入到盛有100ml去離子水的容器中，室溫下磁力攪拌，加入過量谷氨酸7.5g，按實施例1的方法制備得到層間陰離子為谷氨酸的Zn-Al型類水滑石層柱材料。
B按實施例1的方法制備得到固定化青霉素?；?。
步驟B制備的樣品X射線衍射和IR表征結(jié)果與例1類似，證明青霉素?；阜肿右殉晒Φ毓潭ㄔ趯影逯g。
固定化酶的操作穩(wěn)定性研究顯示，在間歇反應(yīng)器中連續(xù)操作30次后，固定化酶活力保持了其初始活力的82％；固定化酶的熱穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)游離酶活力在45℃急劇下降時，固定化酶活力在52℃仍保持不變。
B按實施例1中步驟B的方法制備得到固定化青霉素?；浮?br> 步驟B制備的樣品X射線衍射和IR表征結(jié)果與例1類似，證明青霉素?；阜肿右殉晒Φ毓潭ㄔ趯影逯g。
固定化酶的操作穩(wěn)定性研究顯示，在間歇反應(yīng)器中連續(xù)操作50次后，固定化酶活力保持了其初始活力的85％；固定化酶的熱穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)游離酶活力在45℃急劇下降時，固定化酶活力在52℃仍保持不變。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種陰離子型層狀材料固定化酶的制備方法，其特征是按以下步驟制備該固定化酶A制備層板二價、三價金屬陽離子摩爾比為1.6-4.5∶1的類水滑石，取一定量的該類水滑石加入到盛有去離子水的容器中配制濃度為0.2-2M的懸浮液，室溫下磁力攪拌，按類水滑石與客體分子完全反應(yīng)計加入過量客體分子，此時容器中由渾濁液變?yōu)槌吻迦芤?，備用；用濃度?.01-0.5M的NaOH稀溶液，加入帶冷凝和攪拌的反應(yīng)器中，一邊攪拌，一邊滴加上述備用澄清溶液，保持滴加過程pH＞9，滴加結(jié)束后，冷凝回流約6h，過濾、用熱水充分洗滌至pH＜8，于85℃左右干燥，得到層間組裝了客體分子的類水滑石層柱材料；B按從A得到的類水滑石層柱材料與水的重量比為1∶50-80的比例加入帶磁力攪拌的反應(yīng)器中，按該類水滑石與交聯(lián)劑的重量比為1∶1-3的比例，向反應(yīng)器中加入5％wt濃度交聯(lián)劑，磁力攪拌1小時左右，過濾，充分水洗；將洗好的濾餅放入容器，加入去離子水和磷酸緩沖液以保護(hù)酶分子的催化活力，按類水滑石層柱材料與液體酶的固液比為1∶6-12的比例加入需固定的酶，于搖床中在一定溫度下固定約20h，經(jīng)離心分離，充分水洗，得到固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陰離子型層狀材料固定化酶的制備方法，其特征在于，其中A所用的類水滑石為主體層板二價金屬陽離子M2+為Mg2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、、Ca2+的任何一種，其三價金屬陽離子M3+為Al3+、Ga3+、Co3+、Fe3+、Cr3+、V3+、Ti3+任何一種；層間陰離子為Cl-、CO2-、NO3-、OH-、SO42-、ClO3-任何一種或幾種的組合；所說的客體分子可以是谷氨酸、天冬氨酸或6-氨基己酸；其中B所用的酶是能在pH值為1-11下存活的各種酶的一種；所用的交聯(lián)劑為任何一種含有兩個醛基基團(tuán)，且在小于40℃的溫度下能同時與酶分子中氨基和客體分子中的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陰離子型層狀材料固定化酶的制備方法，其特征在于，A所用的類水滑石為主體層板二價金屬陽離子優(yōu)選Mg2+或Zn2+；三價金屬陽離子優(yōu)選Al3+或Fe3+；優(yōu)選M2+∶M3+摩爾比為2-4∶1，層間陰離子優(yōu)選CO2-和或OH-；所用的客體分子優(yōu)選谷氨酸；B所用的酶優(yōu)選青霉素?；?、脂肪酶、過氧化辣根酶；所用的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛、三氯化嗪。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陰離子型層狀材料固定化酶的制備方法，其特征在于，所用的酶更優(yōu)選青霉素?；浮?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陰離子型層狀材料固定化酶的制備方法，其特征在于，所用的交聯(lián)劑更優(yōu)選戊二醛。
6.本發(fā)明還涉及一種由權(quán)利要求1至5中任一項所述方法制備的陰離子型層狀材料固定化酶，其特征是在陰離子型層狀材料-類水滑石的主體層板之間插入客體分子，客體分子為含有羧基和氨基基團(tuán)，且羧基數(shù)量大于等于氨基數(shù)量的分子，其所帶的羧基功能基團(tuán)與帶正電荷的層板形成離子鍵，其所帶的氨基功能基團(tuán)在交聯(lián)劑作用下與酶分子上的氨基基團(tuán)形成共價鍵，由此酶分子被固定在類水滑石層板之間。
全文摘要
一種陰離子型層狀材料固定化酶及其制備方法，這種固定化酶是將酶分子通過插入類水滑石層板之間的客體分子和交聯(lián)劑，被固定在類水滑石層板之間。其制備方法是將含有羧基和氨基基團(tuán)，且羧基數(shù)量大于等于氨基數(shù)量的客體分子通過插層方法組裝進(jìn)入陰離子型層狀材料－類水滑石層板之間，再加入交聯(lián)劑和酶，在交聯(lián)劑作用下客體分子上的氨基基團(tuán)與酶分子上的氨基基團(tuán)形成共價鍵，酶分子被固定于水滑石層間得到固定化酶層柱材料。該固定化酶因受層板內(nèi)幾何結(jié)構(gòu)的限制，反應(yīng)時底物和產(chǎn)物在由層柱材料構(gòu)筑的反應(yīng)平臺上進(jìn)行有序轉(zhuǎn)換，而酶分子不會流失，且具有較好的穩(wěn)定性。
文檔編號C12N11/02GK1459502SQ02117919
公開日2003年12月3日 申請日期2002年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月23日
發(fā)明者段雪, 任玲玲, 何靜 申請人:北京化工大學(xué)