專利名稱：表達(dá)調(diào)控序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，特別涉及開發(fā)新的細(xì)菌細(xì)胞中受調(diào)控基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
對于許多基于開發(fā)重組細(xì)菌，特別是大腸桿菌的生物工程方法而言，通過加入相對簡單而廉價(jià)的化合物誘導(dǎo)克隆基因的表達(dá)是一個(gè)非常吸引人的想法。顯然，天然的L-氨基酸是用作這類誘導(dǎo)物的非常良好的候選物。但是，據(jù)發(fā)明者所知，色氨酸酶基因的調(diào)控區(qū)域是通過往培養(yǎng)基中加入色氨酸而誘導(dǎo)的獨(dú)特的天然系統(tǒng)[Landick R.，Tumbough C.L.，Yanofsky C.″轉(zhuǎn)錄衰減″/″大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella.)細(xì)胞和分子生物學(xué)″(第二版，F(xiàn).C.Neidhardt-主編)，(1996)，第1263-1286頁]。相反，存在幾個(gè)當(dāng)細(xì)胞中氨基酸過剩時(shí)使受調(diào)控基因表達(dá)減少的系統(tǒng)(特別是色氨酸操縱子阻遏物-操縱基因系統(tǒng)[Platt，T.″大腸桿菌色氨酸操縱子上基因表達(dá)調(diào)控″/″操縱子″(Miller，J.H.，Reznikoff，W.S.-編)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1978)，第263-302頁]，氨基酸操縱子轉(zhuǎn)錄的衰減[Landick R.，Tumbough C.L.，Yanofsky C.″轉(zhuǎn)錄衰減″/″大腸桿菌和沙門氏菌細(xì)胞和分子生物學(xué))″(第二版，F(xiàn).C.Neidhardt-主編)，(1996)，第1263-1286頁])。
在氨基酸操縱子中，轉(zhuǎn)錄衰減的分子機(jī)理基于在所謂的“衰減子”區(qū)域形成可變mRNA二級結(jié)構(gòu)的可能性，其依賴“前導(dǎo)”肽的翻譯，前導(dǎo)肽的基因位于操縱子的第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因上游。該前導(dǎo)肽基因的編碼部分富含有義氨基酸密碼子(那些其生物合成由相應(yīng)操縱子的蛋白質(zhì)產(chǎn)物提供的氨基酸的密碼子對于色氨酸操縱子，有色氨酸密碼子，對于組氨酸操縱子，有組氨酸密碼子，對于蘇氨酸操縱子，有蘇氨酸和異亮氨酸密碼子等)。
圖1中以大腸桿菌色氨酸和組氨酸操縱子的衰減區(qū)域?yàn)槔榻B了已良好地建立的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的詳細(xì)情況。從圖1可以看出，可變mRNA二級結(jié)構(gòu)可以在相應(yīng)的DNA片斷轉(zhuǎn)錄時(shí)形成相應(yīng)于色氨酸前導(dǎo)區(qū)形成發(fā)夾t1∶t2和t3∶t4或其替代物t2∶t3，類似地，相應(yīng)于組氨酸前導(dǎo)區(qū)形成h1∶h2、h3∶h4和h5∶h6，或h2∶h3和h4∶h5。發(fā)夾t3∶t4和h5∶h6為典型的ρ-非依賴型轉(zhuǎn)錄終止子，因此它們在轉(zhuǎn)錄的延長期的形成導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄在相應(yīng)操縱子的衰減子區(qū)域終止進(jìn)而阻止操縱子中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
由于mRNA二級結(jié)構(gòu)形成過程與mRNA合成過程相結(jié)合，因而在色氨酸衰減子中當(dāng)前導(dǎo)肽未被翻譯時(shí)，逐步地形成發(fā)夾t1∶t2和其后的t3∶t4(其另一種形式一發(fā)夾t2∶t3不能形成，因?yàn)閠1∶t2已在先形成)。類似地，在合成組氨酸衰減子mRNA但不翻譯相應(yīng)的前導(dǎo)肽的情況下，發(fā)夾h1∶h2、h3∶h4和其后的h5∶h6的較快形成，阻止了其替代物h2∶h3和h4∶h5的形成。如前述，發(fā)夾t3∶t4和h5∶h6的形成導(dǎo)致在相應(yīng)的衰減子區(qū)域的終止。在反應(yīng)混合物中不存在任何翻譯因子，由純RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的DNA的過程中，或在體內(nèi)常規(guī)氨基酸饑餓情況下，可以實(shí)現(xiàn)這種狀況。
當(dāng)有義氨基酸過剩(更為確切地說，相應(yīng)的負(fù)載tRNA過剩)或在細(xì)菌細(xì)胞中處于缺陷狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)前導(dǎo)肽的翻譯可能會(huì)出現(xiàn)更加復(fù)雜的情況。已表明，起始衰減子mRNA轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶停在位于緊鄰于發(fā)夾1∶2下游的區(qū)域的暫停位點(diǎn)(可能這種發(fā)夾的形成是這種暫停的必要但不是充足的條件)[Chan，C.L.，Wang，D.，Landick，R.″多重相互作用穩(wěn)定了單一暫停轉(zhuǎn)錄中間體，其中由發(fā)夾到3′末端間隔區(qū)可區(qū)分出暫停和終止途徑″/分子生物學(xué)雜志.268(1997)54-68]。翻譯前導(dǎo)肽N-末端部分的核糖體釋放出RNA聚合酶，然后繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的延長，從而可以形成mRNA-2∶3可變發(fā)夾。以下事件取決于有義氨基酸的負(fù)載tRNA的細(xì)胞內(nèi)濃度，因?yàn)榇藭r(shí)必須通過核糖體翻譯相應(yīng)的前導(dǎo)肽基因的密碼子。
在有義氨基酸饑餓的情況下，核糖體暫停在有義密碼子處且不會(huì)破壞發(fā)夾2∶3，而RNA聚合酶合成大體上可以形成終止子發(fā)夾(對于色氨酸衰減子為t3∶t4，而對于組氨酸衰減子為h5∶h6)的mRNA的下游片斷，但它不折疊，因?yàn)榇嬖谠摽勺儼l(fā)夾(t2∶t3-對于色氨酸衰減子，而結(jié)構(gòu)h2∶h3、h4∶h5-對于組氨酸衰減子)，然后延長轉(zhuǎn)錄并合成操縱子結(jié)構(gòu)基因的mRNA。
在有義氨基酸過剩的情況下，前導(dǎo)肽高效翻譯，因此最初破壞發(fā)夾1∶2的核糖體也破壞發(fā)夾2∶3，并停在前導(dǎo)肽的終止密碼子處。后者最終導(dǎo)致終止子發(fā)夾形成且使轉(zhuǎn)錄終止于衰減子區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是創(chuàng)建新的原核人工調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過增加細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸濃度來增加受控基因表達(dá)。
本發(fā)明人利用基于依賴前導(dǎo)肽翻譯效率而形成可變mRNA二級結(jié)構(gòu)的天然調(diào)控機(jī)理，成功地創(chuàng)建了一種依賴細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度的新的人工調(diào)控系統(tǒng)。與天然氨基酸操縱子的衰減子不同的是，該新系統(tǒng)在有義氨基酸胞內(nèi)濃度過剩的情況下使受控基因的表達(dá)并不減少而是增加。同時(shí)，在有義氨基酸饑餓時(shí)，受新表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控的基因表達(dá)水平降低。已公知的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、氨基酸操縱子轉(zhuǎn)錄的衰減已用作該新系統(tǒng)的先祖，但該新系統(tǒng)與其先祖不同的是，在有義氨基酸過剩的情況下，不是降低而是增加受控基因的表達(dá)水平。
本發(fā)明提供了下述表達(dá)調(diào)控序列，表達(dá)調(diào)控方法和使用該表達(dá)調(diào)控序列的生產(chǎn)方法(1)一種依賴細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度來調(diào)控連接于表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列，其中，在含有包括表達(dá)調(diào)控序列、連接在表達(dá)調(diào)控序列上游的啟動(dòng)子和連接在表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體的細(xì)菌中，通過增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度而降低在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄頻率，以增加靶基因的表達(dá)。
(2)根據(jù)(1)的表達(dá)調(diào)控序列，它包括編碼含有所述氨基酸和ρ-非依賴型終止子的前導(dǎo)肽的區(qū)域，其中在氨基酸饑餓的情況下，在翻譯過程中當(dāng)前導(dǎo)肽的翻譯停在該氨基酸的密碼子處時(shí)，在表達(dá)調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結(jié)構(gòu)，以增加在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、以及轉(zhuǎn)錄的頻率。
(3)根據(jù)(2)的表達(dá)調(diào)控序列，它包括不少于3的奇數(shù)個(gè)區(qū)段，其中每個(gè)區(qū)段可以與其相鄰區(qū)段形成堿基對結(jié)構(gòu)，并且在表達(dá)調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄物中，當(dāng)除了末端區(qū)段以外的區(qū)段各自與其兩個(gè)相鄰區(qū)段之一形成堿基對結(jié)構(gòu)時(shí)，該區(qū)段與其兩個(gè)相鄰區(qū)段的另一區(qū)段不形成堿基對結(jié)構(gòu)；在上游末端的第一區(qū)段和與翻譯前導(dǎo)肽的核糖體相互作用的區(qū)域重疊；在前導(dǎo)肽翻譯過程中，與第一區(qū)段相鄰的第二區(qū)段和與第二區(qū)段相鄰的第三區(qū)段形成堿基對結(jié)構(gòu)；由下游末端區(qū)段和其相鄰區(qū)段形成的堿基對結(jié)構(gòu)是ρ-非依賴型終止子的堿基對結(jié)構(gòu)。
(4)根據(jù)(3)的表達(dá)調(diào)控序列，其中，第一區(qū)段與前導(dǎo)肽的氨基酸密碼子重疊。
(5)根據(jù)(3)或(4)的表達(dá)調(diào)控序列，其中區(qū)段數(shù)為5。
(6)根據(jù)(3)-(5)的任一表達(dá)調(diào)控序列，其中各區(qū)段的序列或其部分和相鄰區(qū)段的序列或其部分構(gòu)成反向重復(fù)序列。
(7)根據(jù)(2)-(6)的任一表達(dá)調(diào)控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)或沙雷氏菌屬(Serratia)細(xì)菌中發(fā)揮功能。
(8)根據(jù)(7)的表達(dá)調(diào)控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能。
(9)根據(jù)(7)或(8)的表達(dá)調(diào)控序列，它順次包括來自上游側(cè)的5段區(qū)段an1-an5，其中區(qū)段an1和an2，以及前導(dǎo)肽的編碼區(qū)來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的衰減子序列，區(qū)段an4和an5來自大腸桿菌的組氨酸操縱子的衰減子序列，而區(qū)段an3來自色氨酸操縱子和組氨酸操縱子的衰減子序列的組合。
(10)根據(jù)(9)的表達(dá)調(diào)控序列，該前導(dǎo)肽經(jīng)修飾為含有不少于2個(gè)色氨酸殘基。
(11)一種調(diào)控靶基因表達(dá)的方法，包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有包含(1)-(10)之任一定義的表達(dá)調(diào)控序列、連接在該表達(dá)調(diào)控序列上游的啟動(dòng)子和連接在該表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體的細(xì)菌；和改變該表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控表達(dá)所依賴的細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度，以調(diào)控靶基因的表達(dá)。
(12)一種生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括步驟培養(yǎng)能夠生產(chǎn)該物質(zhì)的細(xì)菌以產(chǎn)生該物質(zhì)并收集該物質(zhì)，其中該細(xì)菌含有包含(1)-(10)之任一定義的表達(dá)調(diào)控序列、連接在該表達(dá)序列上游的啟動(dòng)子和與該靶物質(zhì)的生產(chǎn)有關(guān)且連接在該表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體；并改變該表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控表達(dá)所依賴的細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度，以調(diào)控靶基因的表達(dá)。
(13)根據(jù)(12)的方法，其中，通過所述細(xì)菌合成或降解氨基酸來改變細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過增加細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的濃度而增加被調(diào)控基因表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控方法，可以通過增加細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的濃度而增加靶基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，可以通過增加細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的濃度而增加靶物質(zhì)的產(chǎn)量，從而有效地生產(chǎn)該靶物質(zhì)。


圖1是天然衰減子和本發(fā)明表達(dá)調(diào)控序列(人工抗衰減子)的結(jié)構(gòu)和特性的說明圖。
圖2是天然衰減子和人工抗衰減子的詳細(xì)結(jié)構(gòu)。A和B分別表示所建議的延滯于“前導(dǎo)”肽的“有義”密碼子(A)并終止于終止密碼子(B)的核糖體所保護(hù)的mRNA部分的″下游″區(qū)域。C表示由大腸桿菌RNA聚合酶驅(qū)動(dòng)的DNA轉(zhuǎn)錄的暫停位點(diǎn)。
圖3是人工抗衰減子的基本結(jié)構(gòu)圖。帶叉的圓標(biāo)記表示與天然序列相比的核苷酸變化。BI∶BamHI，Bg∶BglII，NI∶NdeI，XI；XbaI，XI*；XbaI(dam-)。
圖4是實(shí)施例1中的質(zhì)粒構(gòu)建圖。
圖5是來自質(zhì)粒PDR540的Ptac啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。用網(wǎng)狀點(diǎn)標(biāo)出用于PCR的″上游″(III)和″下游″(IV)引物序列。
圖6是化學(xué)合成的an3∶an4(an4∶an5)片斷結(jié)構(gòu)和將該片斷插到克隆載體的方法。
圖7是天然大腸桿菌色氨酸操縱子的衰減子區(qū)域的結(jié)構(gòu)。前導(dǎo)肽由大寫的斜體字母表示。
圖8顯示了包括噬菌體T7基因10的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和色氨酸操縱子前導(dǎo)區(qū)之間融合物的中間體的結(jié)構(gòu)。前導(dǎo)肽由大寫的斜體字母表示。
具體實(shí)施例方式
<1>表達(dá)調(diào)控序列本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列為依賴細(xì)胞內(nèi)氨基酸(有義氨基酸)濃度來調(diào)控連接在表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列，其中，在含有包括表達(dá)調(diào)控序列、連接在表達(dá)調(diào)控序列上游的啟動(dòng)子和連接在表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體的細(xì)菌中，通過增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度而降低在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄頻率，以增加靶基因的表達(dá)。
有義氨基酸是不受限制的，只要其氨?；鵷RNA可以合成且該合成的氨?；鵷RNA可以用于翻譯本發(fā)明表達(dá)調(diào)控序列所應(yīng)用的細(xì)菌的蛋白質(zhì)即可。優(yōu)選的有義氨基酸為色氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、或纈氨酸。
靶基因的實(shí)例包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)，氨基酸操縱子，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物與氨基酸、核苷和核苷酸的生物合成有關(guān)的基因；和編碼外源蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。
啟動(dòng)子的實(shí)例包括Ptac和任何其它受調(diào)控的和組成型原核啟動(dòng)子。
含有DNA構(gòu)建體的細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬和沙雷氏菌屬細(xì)菌。
可以根據(jù)常規(guī)的基因工程技術(shù)(例如，參見分子克隆，第二版，冷泉港出版社(1989)，日本專利申請公開2-207791等)進(jìn)行表達(dá)調(diào)控序列和DNA構(gòu)建體的構(gòu)建，以及含有DNA構(gòu)建體的細(xì)菌的制備。
還可以根據(jù)常規(guī)基因工程技術(shù)測定通過增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度而降低在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄頻率，以增加靶基因的表達(dá)。在細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的濃度方面，如果已知細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外濃度的關(guān)系，則不需要直接測定細(xì)胞內(nèi)濃度并可以根據(jù)細(xì)胞外濃度如培養(yǎng)基中的濃度來估算細(xì)胞內(nèi)濃度。也不需要直接測定表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率及起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的頻率，測定靶基因表達(dá)的增加就夠了。靶基因表達(dá)增加的測定可以通過測定靶基因的基因產(chǎn)物的數(shù)量，或當(dāng)該基因產(chǎn)物具有活性時(shí)，測定該基因產(chǎn)物的活性來確定。
例如，在一個(gè)關(guān)于通過增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度而降低在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的頻率，以增加靶基因的表達(dá)的實(shí)施方案中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的濃度不高于某一水平時(shí)，起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止于該表達(dá)調(diào)控序列，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的濃度高于某一水平時(shí)，該轉(zhuǎn)錄延長，由此表達(dá)靶基因。
本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列優(yōu)選包含編碼前導(dǎo)肽的區(qū)域，該前導(dǎo)肽含有義氨基酸和ρ-非依賴型終止子，其中在有義氨基酸饑餓的情況下，在翻譯過程中當(dāng)前導(dǎo)肽的翻譯停在有義氨基酸的密碼子(有義密碼子)處時(shí)，在表達(dá)調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結(jié)構(gòu)，以增加在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、以及轉(zhuǎn)錄頻率。
前導(dǎo)肽的長度通常為14-32個(gè)殘基。前導(dǎo)肽通常含有占總氨基酸殘基的14-57％，優(yōu)選30-45％的有義氨基酸殘基。有義氨基酸的比例增大，則通過細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸濃度的調(diào)控變得精確。
ρ-非依賴型終止子具有可以形成堿基對結(jié)構(gòu)(發(fā)夾)的序列，并在形成堿基對結(jié)構(gòu)時(shí)終止轉(zhuǎn)錄。ρ-非依賴型終止子優(yōu)選能夠在埃希氏桿菌屬、沙門氏菌或沙雷氏菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能。
關(guān)于在翻譯過程中，當(dāng)前導(dǎo)肽的翻譯停在有義密碼子處時(shí)，在表達(dá)調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結(jié)構(gòu)的方法，舉例如下使表達(dá)調(diào)控序列包含不少于3的奇數(shù)個(gè)區(qū)段，其中每個(gè)區(qū)段可以與其相鄰區(qū)段共同形成堿基對結(jié)構(gòu)，并且在表達(dá)調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄物中，當(dāng)除了末端區(qū)段以外的區(qū)段各自與其兩個(gè)相鄰區(qū)段之一形成堿基對結(jié)構(gòu)時(shí)，該區(qū)段與其兩個(gè)相鄰區(qū)段的另一區(qū)段不形成堿基對結(jié)構(gòu)；在上游末端的第一區(qū)段和與翻譯前導(dǎo)肽的核糖體相互作用的區(qū)域重疊；與第一區(qū)段相鄰的第二區(qū)段在前導(dǎo)肽翻譯過程中和與第二區(qū)段相鄰的第三區(qū)段形成堿基對結(jié)構(gòu)；由下游末端區(qū)段和其相鄰區(qū)段形成的堿基對結(jié)構(gòu)是ρ-非依賴型終止子的堿基對結(jié)構(gòu)。
在這個(gè)實(shí)施方案中，有必要使核糖體停在有義氨基酸的密碼子處而阻斷第一區(qū)段和第二區(qū)段之間的堿基對結(jié)構(gòu)的形成。由于核糖體的質(zhì)量的原因，核糖體覆蓋從所停留的有義氨基酸密碼子的上游約17bp至所述有義氨基酸密碼子的下游約13bp的區(qū)域。與核糖體相互作用的區(qū)域是指受核糖體覆蓋的區(qū)域。如果第一區(qū)段和與翻譯前導(dǎo)肽的核糖體相互作用的區(qū)域重疊，則預(yù)計(jì)可通過使核糖體停在有義氨基酸的密碼子處充分地阻斷第一區(qū)段和第二區(qū)段之間的堿基對結(jié)構(gòu)的形成。例如，如果有義氨基酸的密碼子剛好出現(xiàn)在前導(dǎo)肽的終止密碼子之前而從有義氨基酸密碼子到第一區(qū)段起始點(diǎn)的距離在約13bp之內(nèi)，則可以阻斷第一區(qū)段和第二區(qū)段之間的堿基對結(jié)構(gòu)的形成。
第一區(qū)段與前導(dǎo)肽上的有義氨基酸的密碼子重疊。
在這個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)由于有義氨基酸饑餓而使第一區(qū)段受核糖體阻斷時(shí)，則形成第二和第三，第四和第五區(qū)段...之間的堿基對結(jié)構(gòu)，而最終的堿基對結(jié)構(gòu)用作終止轉(zhuǎn)錄的終止子。另一方面，如果提供充足的有義氨基酸且核糖體以足夠的速率沿mRNA移動(dòng)至終止密碼子以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致核糖體阻斷至第二區(qū)段，則在第三和第四區(qū)段...之間形成堿基對結(jié)構(gòu)以阻止終止子的形成。
在本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列中，優(yōu)選RNA聚合酶的暫停位點(diǎn)存在于編碼前導(dǎo)肽C-末端區(qū)域的區(qū)域，或編碼該前導(dǎo)肽的區(qū)域的下游，更優(yōu)選在第二區(qū)段至第三區(qū)段的區(qū)域。當(dāng)不存在暫停位位點(diǎn)時(shí)，如果與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的翻譯不夠充分，則可能不會(huì)充分調(diào)控靶基因的表達(dá)。
在本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列中，優(yōu)選RNA聚合酶的暫停位點(diǎn)存在于編碼前導(dǎo)肽C-末端區(qū)域的區(qū)域，或編碼該前導(dǎo)肽的區(qū)域的下游，更優(yōu)選在第二區(qū)段至第三區(qū)段的區(qū)域。當(dāng)不存在暫停位點(diǎn)時(shí)，如果與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的翻譯不夠充分，則可能不會(huì)充分調(diào)控靶基因的表達(dá)。
例如區(qū)段的數(shù)目為5。
各個(gè)區(qū)段的核苷酸序列可以是可與其相鄰區(qū)段形成堿基對結(jié)構(gòu)的區(qū)段。例如，各個(gè)區(qū)段的序列或其部分和相鄰區(qū)段的序列或其部分可以構(gòu)成反向重復(fù)序列。構(gòu)成反向重復(fù)的序列可以不是連續(xù)的。換句話說，它可以在其序列內(nèi)含有不形成堿基對的部分。在除了末端區(qū)段之外的區(qū)段中，在與其相鄰區(qū)段之一構(gòu)成反向重復(fù)序列的部分和與其相鄰的另一區(qū)段構(gòu)成反向重復(fù)序列的部分之間存在至少部分重疊就足夠了。
表達(dá)調(diào)控序列的一個(gè)實(shí)例順次包含5個(gè)從上游側(cè)的區(qū)段an1-an5，其中區(qū)段an1和an2，以及編碼前導(dǎo)肽的編碼區(qū)來自大腸桿菌色氨酸操縱子的衰減子序列，區(qū)段an4和an5來自大腸桿菌的組氨酸操縱子的衰減子的序列，而區(qū)段an3來自色氨酸操縱子和組氨酸操縱子的衰減子序列的組合。
本文所用的術(shù)語“來自”是指具有與天然序列相同或類似的序列。獲得序列的方法是不受限制的?？梢詮纳锊牧现蟹蛛x或通過化學(xué)合成。類似的序列可以是在天然序列中取代、缺失或插入一種或多種核苷酸的序列并且該序列可以形成等同于在天然序列中形成的堿基對結(jié)構(gòu)。
在優(yōu)選的表達(dá)調(diào)控序列的實(shí)例中，優(yōu)選前導(dǎo)肽被修飾為含有不少于2個(gè)色氨酸殘基。這些色氨酸殘基優(yōu)選是連續(xù)的。
參照優(yōu)選的表達(dá)調(diào)控序列的實(shí)例描述本發(fā)明。為了方便起見，下文中將表達(dá)調(diào)控序列稱作人工抗衰減子。
人工抗衰減子的生物特性如圖1所示。從圖1可以看出，在有義氨基酸饑餓和核糖體停在相應(yīng)的前導(dǎo)肽密碼子的情況下，未受破壞的抗衰減子的發(fā)夾an2∶an3可以導(dǎo)致形成作為典型的ρ-非依賴型轉(zhuǎn)錄終止子一部分的發(fā)夾an4∶an5。另一方面，在有義氨基酸過剩的情況下，前導(dǎo)肽的充分翻譯可以破壞人工抗衰減子中的發(fā)夾an2∶an3，然后形成可變發(fā)夾an3∶an4，該發(fā)夾阻止在遠(yuǎn)側(cè)(下游)基因轉(zhuǎn)錄之前的終止，因?yàn)榻K止子發(fā)夾an4∶an5不能形成。
在兩種已知的天然大腸桿菌色氨酸和組氨酸操縱子的衰減子基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)構(gòu)建出人工抗衰減子。至于人工抗衰減子的前導(dǎo)肽，使用了天然色氨酸操縱子(trpL)的前導(dǎo)肽基因，并且在其結(jié)構(gòu)部分具有兩個(gè)調(diào)控色氨酸密碼子。另一方面，與相應(yīng)的天然組氨酸衰減子區(qū)域一樣，在人工抗衰減子的3’-非翻譯區(qū)域?qū)⑿纬煽勺僲RNA的二級結(jié)構(gòu)。
在圖2中是作為基礎(chǔ)的兩個(gè)天然衰減子(色氨酸和組氨酸)的編碼部分和3’-未翻譯區(qū)域的核苷酸序列，以及相應(yīng)的人工抗衰減子區(qū)域的序列。由圖2可以看出，來自天然色氨酸衰減子和來自人工抗衰減子的直至″+85″(將前導(dǎo)肽編碼部分的ATG中的A看作″+1″而得到該數(shù)字)的結(jié)構(gòu)相一致。因此可以推測，在轉(zhuǎn)錄延長過程中，RNA聚合酶在″+66-+67″位置暫停；在色氨酸饑餓情況下，翻譯前導(dǎo)肽的核糖體對發(fā)夾an1∶an2進(jìn)行破壞；以及在細(xì)胞中色氨酸過剩的情況下，發(fā)夾an2∶an3的額外破壞可以剛好以與天然色氨酸衰減子相同的方式在人工抗衰減子的調(diào)控區(qū)發(fā)生。另一方面，抗衰減子的遠(yuǎn)側(cè)部分明顯不同于組氨酸衰減子的相應(yīng)區(qū)域，這部分作為第二先祖。
已在可以形成終止子發(fā)夾an4∶an5的區(qū)域作了最小的改動(dòng)。但是，如在天然組氨酸衰減子中一樣，在人工抗衰減子上已可能形成可變發(fā)夾an3∶an4(該區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)與天然組氨酸衰減子的h4∶h5同源)，而該發(fā)夾的形成可以阻止人工抗衰減子上轉(zhuǎn)錄的終止。與天然組氨酸衰減子相比，在抗衰減子中不存在形成h3∶h4發(fā)夾的DNA片斷，并且其生物學(xué)特性發(fā)生改變在有義氨基酸饑餓的情況下，形成ρ-非依賴型轉(zhuǎn)錄終止子而不是其細(xì)胞內(nèi)濃度增加。證明人工抗衰減子特性的結(jié)果如下述。
如圖3圖示，已采用常規(guī)基因工程技術(shù)(包括PCR驅(qū)動(dòng)的天然色氨酸衰減子片斷的擴(kuò)增和寡核苷酸化學(xué)合成等等)合成人工抗衰減子。已經(jīng)獲得兩種不同類型的人工抗衰減子。天然trpL核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)用于人工抗衰減子一第一型抗衰減子-I的前導(dǎo)肽的翻譯起始。更有效的噬菌體T7基因10的RBS已插入到第二抗衰減子-II前導(dǎo)肽基因5’-區(qū)域。已在載體質(zhì)粒上高效啟動(dòng)子Ptac的下游和具有其自身RBS的cat基因結(jié)構(gòu)的上游的克隆了這兩種人工抗衰減子。編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的cat基因用作報(bào)道基因，其表達(dá)水平可以提供關(guān)于所創(chuàng)建的依賴細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸-色氨酸濃度的調(diào)控元件的功能效率信息。
而且，已在相同載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建了多種調(diào)控重組質(zhì)粒。第一種質(zhì)粒帶有天然色氨酸操縱子-trpL的衰減子。第二種帶有-潛在的轉(zhuǎn)錄終止子-形成終止子發(fā)夾an4∶an5的抗衰減子的3’-末端DNA片斷。第三種質(zhì)粒帶有較長的3’-末端DNA片斷，它不能形成終止子發(fā)夾an4∶an5，因?yàn)樵趍RNA合成期間必須首先形成潛在的可變發(fā)夾an3∶an4。
文獻(xiàn)中已知，大腸桿菌色氨酸操縱子中的天然trpL(不同于其它氨基酸操縱子的衰減子)是相當(dāng)微弱的衰減子″生長培養(yǎng)基中存在或不存在色氨酸一般不影響色氨酸衰減子的通讀；通讀發(fā)生的10倍的變化僅發(fā)生在突變型細(xì)菌極度色氨酸饑餓時(shí)或細(xì)菌由含色氨酸培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至不含色氨酸的培養(yǎng)基的瞬間發(fā)生″轉(zhuǎn)錄衰減″/在″大腸桿菌和沙門氏菌細(xì)胞和分子生物學(xué)″(第二版，F(xiàn).C.Neidhardt-主編)，(1996)，第1263-1286頁)。后者可能是因?yàn)樵谙鄳?yīng)的前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)部分僅存在與有義氨基酸串聯(lián)密碼子。由于人工抗衰減子前導(dǎo)肽的編碼部分和天然trpL相同，必須使用特定的模型系統(tǒng)以測定該新系統(tǒng)的調(diào)控性能。已在帶有所需重組質(zhì)粒的trp細(xì)胞中測定了報(bào)道基因CAT的酶活性，再在色氨酸饑餓條件下生長，然后如果需要的話，在培養(yǎng)基中加入色氨酸。所得結(jié)果如表1所示。
表1.在帶有含受試調(diào)控元件的重組質(zhì)粒的菌株中進(jìn)行的CAT活性測定

從表1可以看出，CAT活性水平并不依賴于將色氨酸加到帶有不含trpL編碼部分的質(zhì)粒的細(xì)胞中。而且，可以根據(jù)關(guān)于編碼″終止子″和″抗終止子″發(fā)夾的調(diào)控質(zhì)粒的所得結(jié)果，評價(jià)依賴于可變mRNA二級結(jié)構(gòu)形成過程的CAT活性所達(dá)到的水平上的理論差異。與在人工抗衰的3’-部分的ρ-非依賴型轉(zhuǎn)錄終止相比，在″抗終止子″形成的情況下可以實(shí)現(xiàn)1/20倍的轉(zhuǎn)錄增加。
可以推測，在利用具有天然色氨酸衰減子的質(zhì)粒情況下，CAT活性的測定水平在色氨酸饑餓的情況下已提高了該水平，比將色氨酸加到正在生長的質(zhì)粒-載體細(xì)菌后的水平要高。實(shí)際獲得的CAT活性水平(17單位)不能與最高水平(60單位)相比。這是因?yàn)?，首先，在?xì)菌生長情況下的色氨酸饑餓不保證trpL通讀轉(zhuǎn)錄的最大效率；其次，cat基因的5’-非翻譯區(qū)位于其自身RBS的直接上游，在利用天然trpL和其它受試結(jié)構(gòu)的情況下是不同的，因此CAT翻譯起始效率也可以是不同的。
已獲得關(guān)于帶有人工抗衰減子的質(zhì)粒的主要結(jié)果。從表1可以看出，對于兩種質(zhì)粒-載體細(xì)菌菌株而言，在將色氨酸加到正在生長的細(xì)菌中之后可以看到CAT活性水平升高。而且，利用高效的噬菌體T7基因10的RBS進(jìn)行前導(dǎo)肽的翻譯起始，獲得接近于理論最大值的CAT的累積水平(51單位比60單位)。后者可以由以下事實(shí)解釋需要改進(jìn)前導(dǎo)肽的RBS，以在由相當(dāng)強(qiáng)的啟動(dòng)子Ptac(比天然色氨酸操縱子的啟動(dòng)子更強(qiáng))轉(zhuǎn)錄人工抗衰減子的情況下，完成實(shí)現(xiàn)可變mRNA二級結(jié)構(gòu)形成的分子機(jī)理所需的全轉(zhuǎn)錄-翻譯相結(jié)合(對于天然的原核氨基酸操縱子上的衰減轉(zhuǎn)錄而言是典型的)。
可以在所得結(jié)果的基礎(chǔ)上作出以下結(jié)論1.可以利用可變mRNA二級結(jié)構(gòu)形成過程來調(diào)控轉(zhuǎn)錄由于利用人工“組氨酸樣”尾，表達(dá)水平可以實(shí)現(xiàn)多達(dá)20倍的差異。
2.所得的人工“抗衰減子”系統(tǒng)是功能活性的2.1.天然色氨酸前導(dǎo)肽編碼部分的存在可以促進(jìn)依賴細(xì)胞內(nèi)色氨酸水平的mRNA二級結(jié)構(gòu)折疊。
2.2.將Ptac-啟動(dòng)子用于與優(yōu)化的前導(dǎo)肽翻譯起始相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄(利用噬菌體T7 S10 RBS代替天然trpL的RBS)的情況下，發(fā)現(xiàn)了過剩色氨酸的最佳“活化劑”效應(yīng)。
3.可以推測該研制的系統(tǒng)可以用作創(chuàng)建實(shí)際可誘導(dǎo)調(diào)控元件的基礎(chǔ)可以在增加抗衰減子區(qū)域的前導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)部分的有義(色氨酸)氨基酸密碼子的數(shù)量后，在培養(yǎng)基中加入過量的色氨酸而將其誘導(dǎo)。
<2>用于調(diào)控靶基因表達(dá)的方法本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控方法是一種調(diào)控靶基因表達(dá)的方法，它包括步驟
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含包括本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列、連接在該表達(dá)調(diào)控序列上游的啟動(dòng)子和連接在該表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體的細(xì)菌；并改變該表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控表達(dá)所依賴的細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度，以調(diào)控靶基因的表達(dá)。
該DNA構(gòu)建體和含有該DNA構(gòu)建體的細(xì)菌可以如以上關(guān)于表達(dá)調(diào)控序列中所述。
培養(yǎng)條件是不受限制的，只要細(xì)菌可以存活。根據(jù)細(xì)菌適當(dāng)選擇條件。
改變細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸濃度的方法的例子為在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中改變有義氨基酸濃度的方法，改變細(xì)胞中有義氨基酸的合成或降解數(shù)量的方法?？梢酝ㄟ^測定靶基因的基因產(chǎn)物數(shù)量確定靶基因表達(dá)改變，或當(dāng)該基因產(chǎn)物具有活性時(shí)可以測定該基因產(chǎn)物的活性。
<3>生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法本發(fā)明的方法是一種生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，它包括步驟培養(yǎng)能夠生產(chǎn)該物質(zhì)的細(xì)菌以產(chǎn)生該物質(zhì)并收集該物質(zhì)，其中該細(xì)菌含包括本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列、連接在該表達(dá)序列上游的啟動(dòng)子和與該靶物質(zhì)的生產(chǎn)有關(guān)且連接在該表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體；并改變該表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控表達(dá)所依賴的細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度以調(diào)控靶基因的表達(dá)。
靶物質(zhì)的實(shí)例包括CAT和其它原核酶、外源蛋白質(zhì)產(chǎn)物、氨基酸、核苷酸和核苷、維生素和其它生物活性物質(zhì)。
能夠生產(chǎn)靶物質(zhì)的細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬和沙雷氏菌屬的細(xì)菌。
培養(yǎng)條件不受限制，只要能夠生產(chǎn)靶物質(zhì)的細(xì)菌能夠生產(chǎn)該靶物質(zhì)。根據(jù)細(xì)菌適當(dāng)選擇條件。
培養(yǎng)通常在需氧條件下進(jìn)行10-50小時(shí)。培養(yǎng)溫度通常控制在28-37℃，pH通常在培養(yǎng)期間控制在6.6-7.4?？梢詫o機(jī)或有機(jī)、酸性或堿性物質(zhì)以及氨氣等等用于調(diào)節(jié)pH。
培養(yǎng)基可以是含有碳源、氮源、有機(jī)離子和可選擇的其它有機(jī)組分的普通培養(yǎng)基。
作為碳源，可以使用糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖或淀粉水解產(chǎn)物；醇如甘油或山梨醇；或有機(jī)酸如富馬酸、檸檬酸或琥珀酸。
作為氮源，可以使用無機(jī)銨鹽如硫酸銨、氯化銨或磷酸銨；有機(jī)氮如大豆水解產(chǎn)物；氨氣；或氨水。
可允許添加的所需的物質(zhì)如維生素B1或含有適量的有機(jī)微量營養(yǎng)物的酵母提取物。與以上不同的是，如果需要的話，可以加入少量的磷酸、硫酸鎂、鐵離子、鎂離子等等。
通?？梢越M合離子交換樹脂法、沉淀法和其它已知方法，從培養(yǎng)物如細(xì)胞和培養(yǎng)基中收集靶物質(zhì)。
DNA構(gòu)建體可以如以上關(guān)于表達(dá)調(diào)控序列所述，只要將與靶物質(zhì)的生產(chǎn)有關(guān)的基因用作靶基因即可。與靶物質(zhì)生物有關(guān)的靶基因的實(shí)例包括用于靶物質(zhì)的生物合成基因、用于產(chǎn)生能量和相關(guān)的物質(zhì)的基因如用于靶物質(zhì)生物合成的中間體、用于此目的的調(diào)控基因等等。其具體的實(shí)例包括L-色氨酸生物合成的基因、L-絲氨酸生物合成基因(特別用于L-色氨酸生物合成)、pntAB基因、H+-腺苷三磷酸酶(ATPase)基因。
具體而言，如果在產(chǎn)L-色氨酸細(xì)菌中，將L-色氨酸用作有義氨基酸，而作為靶基因的L-絲氨酸生物合成基因連接于本發(fā)明表達(dá)調(diào)控序列的下游，則當(dāng)細(xì)胞內(nèi)L-色氨酸的累積量增加時(shí)，L-絲氨酸生物合成基因的表達(dá)增加。細(xì)胞內(nèi)L-色氨酸累積量增加的時(shí)間也是作為L-色氨酸生物合成的底物之一的L-絲氨酸減少的時(shí)間。因此，L-絲氨酸生物合成基因的表達(dá)僅在L-絲氨酸減少時(shí)增加。另一方面，L-絲氨酸生物合成基因不可能總是在生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌中高度表達(dá)，因?yàn)楦邼舛鹊腖-絲氨酸對細(xì)胞生長有害。因此認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的表達(dá)調(diào)控序列用于在L-色氨酸-生產(chǎn)細(xì)菌中提高L-絲氨酸生物合成基因的表達(dá)時(shí)非常有用。
能夠生產(chǎn)靶物質(zhì)并含有DNA構(gòu)建體的細(xì)菌可以通過能夠生產(chǎn)靶物質(zhì)的細(xì)菌包含DNA構(gòu)建體或賦予含有DNA構(gòu)建體的細(xì)菌生產(chǎn)靶物質(zhì)的能力而得到?？梢愿鶕?jù)常規(guī)基因工程技術(shù)使細(xì)菌包含DNA構(gòu)建體?？梢愿鶕?jù)已知方法賦予生產(chǎn)靶物質(zhì)的能力。例如，當(dāng)靶物質(zhì)為CAT時(shí)，可以使用引入編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶DNA的方法。
改變細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸濃度的方法的例子有改變培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中有義氨基酸濃度的方法，改變細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的合成和降解數(shù)量的方法。優(yōu)選改變細(xì)胞內(nèi)有義氨基酸的合成和降解數(shù)量的方法，因?yàn)榘形镔|(zhì)的生產(chǎn)可以與用于靶物質(zhì)生產(chǎn)的中間體等的生產(chǎn)結(jié)合。靶基因表達(dá)改變的確定可以通過測定靶基因的基因產(chǎn)物數(shù)量，或當(dāng)該基因產(chǎn)物具有活性時(shí)，測定該基因產(chǎn)物的活性。
實(shí)施例實(shí)施例1.帶有天然衰減子和人工抗衰減子及其片斷的重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.載體質(zhì)粒pML-Ptac-ter_thrL-cat的構(gòu)建用以下方式構(gòu)建帶有ColE1樣復(fù)制子、作為選擇性標(biāo)記的ApR-基因、tac啟動(dòng)子(Ptac)(Russel D.R.，Bennett G.，基因20(1982)231)、合成的大腸桿菌蘇氨酸操縱子(ter_thrL)前導(dǎo)肽的ρ-非依賴型轉(zhuǎn)錄終止子和Ptac下游的cat-基因結(jié)構(gòu)部分的質(zhì)粒載體pML-Ptac-ter_thrL-cat。將從Ptac開始轉(zhuǎn)錄的基因cat用作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的報(bào)道基因。
1.1.pML-pp-載體的構(gòu)建兩種質(zhì)粒用作構(gòu)建pML-pp-載體的起始質(zhì)粒。第一個(gè)質(zhì)粒是前述的質(zhì)粒pML24(Trukhan等人Biotechnologiya(俄文)4，No.3(1988)325-334)。第二個(gè)質(zhì)粒是可商購得到的(MBI″Fermentas″，立陶宛)載體pUC57(GenBank/EMBL入藏號(hào)Y14837)。在圖4中顯示了基于常規(guī)基因工程方法(Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊″.(1989)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)的pML-pp-載體的構(gòu)建圖。
1.2.在質(zhì)粒pML-pp-載體中插入化學(xué)合成的ter_thrL由具有以下結(jié)構(gòu)的兩種化學(xué)合成的寡核苷酸的退火而構(gòu)建了合成的大腸桿菌蘇氨酸操縱子前導(dǎo)肽的ρ-非依賴型轉(zhuǎn)錄終止子I-5′-ctagaaagcttaacacagaaaaaagcccgcacctgacagtgcgggctttttttttcgaccactgcagg→3′(SEQ ID NO4)，和II-5′-gatccctgcagtggtcgaaaaaaaaagcccgcactgtcaggtgcgggcttttttctgtgttaagcttt→3′(SEQ ID NO5)。
在合成的寡核苷酸退火之后，構(gòu)建了雙鏈DNA片斷，該雙鏈DNA片斷帶有典型的經(jīng)XbaI-和BamHI處理DNA之后獲得的單鏈“粘性”末端。
根據(jù)常規(guī)方法，采用T4多核苷酸激酶將該片斷磷酸化，并克隆到由XbaI和BamHI切割的質(zhì)粒pML-pp-載體上。由插入片斷的限制酶切分析和DNA測序建立所需質(zhì)粒與所測得的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系。
1.3.Ptac的分子克隆將PCR驅(qū)動(dòng)的DNA擴(kuò)增用于分子克隆雜合啟動(dòng)子(Ptac)。為此目的，化學(xué)合成了兩種寡核苷酸。
III-5′-gcttaggtaccctccccatccccctgttgac-3′(SEQ ID NO6)，和IV-5′-ctgtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3′(SEQ ID NO7)；將可商購得到的帶有Ptac-啟動(dòng)子的質(zhì)粒pDR54O(Pharmacia，瑞典)用作PCR模板。
如圖5所示，這些寡核苷酸帶有啟動(dòng)子的上游(III)和下游(IV)序列。而且它們帶有可被多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶(KpnI和XbaI)(見圖5)識(shí)別的序列，以利于以下的分子克隆。用KpnI和XbaI處理擴(kuò)增的DNA片斷，然后在已事先由相同的限制酶切割(參見1.2項(xiàng))的載體質(zhì)粒上進(jìn)行克隆。所選擇的重組質(zhì)粒命名為pML-Ptac→ter_thrL→cat，它用作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的載體。
2.用天然和人工轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件構(gòu)建質(zhì)粒上述的質(zhì)粒pML-Ptac→ter_thrL→cat用作創(chuàng)建所有有用質(zhì)粒的載體。而且已化學(xué)合成了一組寡核苷酸olig15′-cagagctctagaagttcacgtaaaaagggtatcgac-3I(SEQ ID NO8)；olig25′-gtatcgcatatgaaagcaattttcgtactgaaagg-3′(SEQ ID NO9)；olig35′-gtctgagatctagtatctgattgctttacgcatggtg-3′(SEQ ID NO10)；olig45′-atcataggatcctaattttgttcaaaaaaaagcccgctcatt-3′(SEQ ID NO11)；oligs5′-cgactgtctagaacggtacagaaagcccccggcagat-3′(SEQ ID NO12)；cat3′5′-agctcaccgtctttcattgccatacgg-3′(SEQ ID NO13)；cr5′5′-acatgcggtaccgatcccgcgaaattaatacg-3′(SEQ ID NO14)。
如下述，這些寡核苷酸用作PCR驅(qū)動(dòng)的DNA擴(kuò)增的引物。另一組寡核苷酸olig65′-cagagctctagaagatctgcccgactgcgtacaacggtacagaaagcccccggcagatcacctgc-3′(SEQID NO15)；olig75-cgggggcttttttattgcgcggttgataacgggatccagcgta-3(SEQ ID NO16)；olig85′-tacgctggatcccgttatcaaccgcgcaataaaaaagcccccggcaggtgatctgccgggggctt-3′(SEQID NO17)；
olig95′-tctgtaccgttgtacgcagtcgggcagatcttctagagctctg-3′(SEQ ID NO18)，直接用于該新的人工抗衰減子的3′-末端部分的構(gòu)建過程(見以下)。
2.1.質(zhì)粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat的構(gòu)建在pML-Ptac→ter_thrL→cat的基礎(chǔ)上，插入由化學(xué)合成的寡核苷酸(olig6，olig7，olig8和olig9)創(chuàng)建的雙鏈DNA片斷，代替啟動(dòng)子Ptac和cat-基因結(jié)構(gòu)部分之間的ter_thrL(見圖6)，而構(gòu)建了該質(zhì)粒。為此目的，根據(jù)建議的方法，采用T4多核苷酸激酶(″MBI Fermentas″，立陶宛)將最初650ng的olig7和650ng的olig9磷酸化。兩種混合物含有在30μl″y+/Tango″緩沖液(″MBI Fermentas″，立陶宛)中的430ng的olig6與650ng的磷酸化olig9，和430ng的olig8與650ng的磷酸化olig7，100℃下將其加熱5分鐘，然后在75℃下退火5分鐘。隨后將其混合在一起，在60℃下加熱5分鐘并在20℃下退火10分鐘。然后加入5單位的T4 DNA連接酶(UMBI Fermentas″，立陶宛)和0.5μl的100mM ATP，并在22℃下保溫4小時(shí)，并在+4℃下保溫過夜。68℃下將混合物加熱10分鐘并將其上樣至凝膠-電泳。采用低熔點(diǎn)瓊脂糖技術(shù)分離明顯可見的DNA帶。依照制造商建議，采用XbaI(＂MBI Fermentas″，立陶宛)處理所得的雙鏈DNA片斷(長108 bp)。將360ng的該片斷連接至50ng由大腸桿菌(dam-)鏈制備并由XbaI切割的載體pML-Ptac→ter_thrL→cat上。在載體質(zhì)粒pML-Ptac→ter_thrL→cat和在其基礎(chǔ)上得到的重組質(zhì)粒必須用限制酶XbaI切割的所有情況下，必須由大腸桿菌(dam-)鏈提供質(zhì)粒DNA，因?yàn)檫@些質(zhì)粒的XbaI-限制位點(diǎn)與GATC-序列重疊，這是Dam驅(qū)動(dòng)的DNA修飾的目標(biāo)，因而XbaI不能切割從大腸桿菌(dam+)菌株中純化的質(zhì)粒DNA。采用3個(gè)單位的T4 DNA連接酶在+4℃下連接過夜。根據(jù)常規(guī)方案，用BamHI(″MBI Fermentas″，立陶宛)處理所得混合物。在最后步驟，用60μl體積的T4 DNA連接酶緩沖液稀釋DNA混合物，并于+4℃下用5個(gè)單位的T4 DNA連接酶處理過夜。將所得混合物轉(zhuǎn)化至菌株HB101并篩選菌落以獲得所需構(gòu)建體。因此，得到質(zhì)粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat，并通過限制酶切分析和根據(jù)常規(guī)Sanger法進(jìn)行DNA測序證明了它的結(jié)構(gòu)。我們推測，所得的質(zhì)粒帶有被轉(zhuǎn)錄的DNA片斷，可以形成抗終止子發(fā)夾an3∶an4(終止子發(fā)夾an4∶an5不能形成，因?yàn)閍n3∶an4在先合成)。
2.2.質(zhì)粒pML-Ptac-an4∶an5-cat的構(gòu)建上述的質(zhì)粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat作為構(gòu)建下一重組DNA的起始質(zhì)粒它被用作為編碼最后的，an4∶an5，新調(diào)控區(qū)域發(fā)夾的片斷而進(jìn)行PCR驅(qū)動(dòng)的DNA擴(kuò)增的模板。在該P(yáng)CR中，寡核苷酸olig5和cat3′用作引物(見圖6)。這些核苷酸的第一部分相應(yīng)于較早克隆的編碼發(fā)夾an4∶an5的片斷的起始部分，但它還含有5’-末端附近的由XbaI識(shí)別的核苷酸(見圖6)。第二個(gè)寡核苷酸，cat3′相應(yīng)于cat-基因的編碼部分的片斷(位置+219-+245，如果來自CAT的ATG起始密碼子的A編號(hào)為″+1″的話)(見圖6)。用XbaI處理由PCR得到的雙鏈DNA片斷，將其與由相同的限制酶切割的載體質(zhì)粒pML-Ptac→ter_thrL→cat連接，然后進(jìn)行BamHI處理并用T4 DNA連接酶將產(chǎn)物環(huán)化。由此得到名為pML-Ptac-an4∶an5-cat的所需質(zhì)粒。
2.3.質(zhì)粒pML-Ptac-trpL-cat的構(gòu)建為了在Ptac-啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下構(gòu)建帶有天然大腸桿菌色氨酸操縱子前導(dǎo)肽基因(基因trpL)的質(zhì)粒，將已測定了其全基因組序列的來自菌株大腸桿菌MG1655的染色體DNA用作PCR的模板。相應(yīng)于trpL-基因的5′和3′-末端部分的寡核苷酸olig1和olig4(見圖7)用作DNA擴(kuò)增的引物。從圖7中可以看出，這些引物還帶有側(cè)翼XbaI和BamHI(相應(yīng)地在olig1和olig4上)識(shí)別位點(diǎn)以便于以下的操作。用XbaI和BamHI處理長175bp的雙鏈DNA片斷，然后將其克隆到由相同的限制酶切割的載體質(zhì)粒pML-Ptac→ter_thrL→cat上。所得的質(zhì)粒命名為pML-Ptac-trpL-cat，該載體質(zhì)粒帶有天然trpL-基因它替代了載體上的ter_thrL。
2.4.質(zhì)粒pML-Ptac-anti_att-I-cat的構(gòu)建將上述的質(zhì)粒pML-Ptac-trpL-cat用作創(chuàng)建下一重組DNA的模板。在該方法中，將上述的寡核苷酸，olig1以及olig3用作引物。olig3相應(yīng)于天然trpL-基因的中央部位，并在其5′-末端還帶有BglII-識(shí)別位點(diǎn)(見圖7)。在PCR驅(qū)動(dòng)的DNA擴(kuò)增之后，用XbaI處理所得的長133bp的雙鏈片斷，并將其與由相同的限制酶切割的載體質(zhì)粒pMLPtac-an3∶an4(an4∶an5)-cat連接，然后由BglII水解產(chǎn)物并用T4 DNA連接酶環(huán)化產(chǎn)物。將所得的在Ptac-啟動(dòng)子和cat-基因結(jié)構(gòu)部分之間帶有人工抗衰減子的質(zhì)粒命名為pML-Ptac-anti_att-I-cat。
2.5 質(zhì)粒pML-Ptac-anti_att-II-cat的構(gòu)建用以下方式構(gòu)建帶有人工抗衰減子的重組質(zhì)粒，該人工抗衰減子含有位于天然大腸桿菌色氨酸操縱子前導(dǎo)肽編碼部分上游的噬菌體T7基因10的高效核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)。最初，由PCR得到雙鏈DNA片斷，該P(yáng)CR使用olig2(見圖7)和olig3作為引物而將質(zhì)粒pML-Ptac-trpL-cat的DNA作為模板。NdeI的限制性位點(diǎn)重建于前導(dǎo)肽的ATG-起始密碼子的上游(ATG-密碼子的核苷酸是NdeI所識(shí)別的序列CATATG的一部分)。將所得的由NdeI切割的DNA片斷與可商購得到的(UNovagenfl，USA)用NdeI處理的質(zhì)粒載體pET-22b(+)連接。質(zhì)粒pET-22b(+)在XbaI和NdeI限制位點(diǎn)之間帶有T7基因的RBS。連接反應(yīng)的產(chǎn)物用作下一步構(gòu)建的PCR模板。新的寡核苷酸cr5′(見圖8)和前面所用的olig3用作該P(yáng)CR的引物。用XbaI和BglII處理所得的長210bp的雙鏈DNA片斷，并在質(zhì)粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat上根據(jù)構(gòu)建pML-Ptac-anti_att-I-cat所用的方案進(jìn)行克隆。因此，得到新的名為pML-Ptac-anti_att-II-cat的質(zhì)粒，該質(zhì)粒帶有人工抗衰減子和處在色氨酸前導(dǎo)肽基因5′-未翻譯區(qū)的噬菌體T7基因10的RBS。通過限制酶切分析和常規(guī)Sanger法測序證明了所有帶有人工轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2.檢測含具有天然trpL、人工抗衰減子及其片斷的重組質(zhì)粒的菌株中Cat蛋白質(zhì)累積水平。
根據(jù)常規(guī)實(shí)施方案，將前述的質(zhì)粒(見實(shí)施例1)pML-Ptac-an4∶an5-cat、pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat、pML-Ptac-trpL-cat、pML-Ptac-anti_att-I-cat、pML-Ptac-anti_att-II-cat引入菌株大腸桿菌TG1(supE、hsd、thi、Δ(lac-proAB)、F′(traD36、proAB+、laclQ、lacZΔM15])和大腸桿菌B7248(trpB-Tnl0，StrR)并在加入氨芐青霉素(100μg/ml)的培養(yǎng)基中選擇質(zhì)粒載體細(xì)胞(Sambrook等人，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”.(1989)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。所得的細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃和良好的通風(fēng)條件下，在含有液體培養(yǎng)基的試管中生長。關(guān)于培養(yǎng)基，加入氨芐青霉素的L-肉湯用于TG1-驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒-載體菌株，而含有氨芐青霉素(100μg/ml)、硫胺素(5μg/ml)和色氨酸(10μg/ml)的極限M9-培養(yǎng)基用于在大腸桿菌B7248的基礎(chǔ)上構(gòu)建的菌株。用相同的培養(yǎng)基將過夜的B7248-驅(qū)動(dòng)的培養(yǎng)物稀釋50倍，并繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)直至600nm處的光密度為1(OD600＝1)。將各培養(yǎng)基分成兩部分并將色氨酸(200μg/ml)加到這兩部分之一。繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，然后離心收集細(xì)胞，用生理溶液洗滌，并重懸在1/10初始體積磷酸鈣緩沖液中。然后超聲處理細(xì)胞，4℃下離心收集碎片。根據(jù)制造商所述的方案，采Bio-Rad Coumassie R250試劑測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)常規(guī)方法測定氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(Schottel JL，Sninsky JJ，Cohen SN″翻譯調(diào)控區(qū)的變化對細(xì)菌基因表達(dá)的影響由lac啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的cat基因用作模式系統(tǒng)″基因，28(1984)177-193)。在這些實(shí)驗(yàn)中，5，5′-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)-Ellman試劑)(″Sigma″)用作具體的試劑。所得結(jié)果如正文的表1所示。
進(jìn)行SDS-PAGE (0.1％SDS-12.5％ PAAG電泳)以目測檢驗(yàn)大腸桿菌TG1驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒-載體菌株累積的CAT。各菌株的生長如上述。將各培養(yǎng)物分成兩部分。往這些培養(yǎng)物上添加IPTG(直至0.4mM的最終濃度)并培養(yǎng)2小時(shí)。然后收集細(xì)胞，將其重懸于SDS-加樣緩沖液(60mM Tris-HCl pH6.8/2.3％ SDS/10％甘油/5％β-巰基乙醇)，并煮沸15分鐘。將作為試樣的10-20μl所得懸浮液加到PAAG上，并根據(jù)Laemmli所述的方法進(jìn)行電泳(Laemmli V.K.//″在裝配噬菌體T4頭部期間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的切割″，自然227(1970)680-685)。用考馬斯藍(lán)給凝膠染色以檢測分離的蛋白質(zhì)。相應(yīng)的所得凝膠的帶型如圖3所示。
序列表<110>味之素株式會(huì)社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>表達(dá)調(diào)控序列<130><150>RU 2001104817<151>2001-02-22<160>18<210>1<211>118<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt cctgaaacgg gcagtgtatt 60caccatgcgt aaagcaatca gatacccagc ccgcctaatg agcgggcttt tttttgaa118<210>2<211>153<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>2atgacacgcg ttcaatttaa acaccaccat catcaccatc atcctgacta gtctttcagg 60cgatgtgtgc tggaagacat tcagatcttc cagtggtgca tgaacgcatg agaaagcccc 120cggaagatca ccttccgggg gcttttttat tgc 153<210>3<211>169<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子<400>3atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt cctgaaacgg gcagtgtatt 60caccatgcgt aaagcaatca gatactagat ctgcccgact gcgtacaacg gtacagaaag120cccccggcag atcacctgcc gggggctttt ttattggcgg ttgataacg 169<210>4<211>69<212>DNA<213>大腸桿菌(Eshcerichia coli)<400>4ctagaaagct taacacagaa aaaagcccgc acctgacagt gcgggctttt tttttcgacc 60actgcagga 69<210>5<211>69<212>DNA<213>大腸桿菌(Eshcerichia coli)<400>5gatccctgca gtggtcgaaa aaaaaagccc gcactgtcag gtgcgggctt ttttctgtgt60taagcttta69<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gcttaggtac cctccccatc cccctgttga ca 32<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ctgtttctag atcctgtgtg aaattgttat ccgca 35<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8cagagctcta gaagttcacg taaaaagggt atcgac 36<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gtatcgcata tgaaagcaat tttcgtactg aaagg35<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10gtctgagatc tagtatctga ttgctttacg catggtg 37<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11atcataggat cctaattttg ttcaaaaaaa agcccgctca tt42<210>12<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12cgactgtcta gaacggtaca gaaagccccc ggcagat47<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13agctcaccgt ctttcattgc catacgg 27<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14acatgcggta ccgatcccgc gaaattaata cg 32<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>15cagagctcta gaagatctgc ccgactgcgt acaacggtac agaaagcccc cggcagatca 60cctgc 65<210>16<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>16cgggggcttt tttattgcgc ggttgataac gggatccagc gta 43<210>17<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>17tacgctggat cccgttatca accgcgcaat aaaaaagccc ccggcaggtg atctgccggg 60ggctt 65<210>18<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>18tctgtaccgt tgtacgcagt cgggcagatc ttctagagct ctg 4權(quán)利要求
1.一種依賴細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度來調(diào)控連接于表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列，其中，在含包括表達(dá)調(diào)控序列、連接在表達(dá)調(diào)控序列上游的啟動(dòng)子和連接在表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體的細(xì)菌中，通過增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度而降低在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄頻率，以增加靶基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)調(diào)控序列，它包括編碼含有所述氨基酸和ρ-非依賴型終止子的前導(dǎo)肽的區(qū)域，其中在所述氨基酸饑餓的情況下，在翻譯過程中當(dāng)前導(dǎo)肽的翻譯停在該氨基酸的密碼子處時(shí)，在表達(dá)調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結(jié)構(gòu)，以增加在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率以及轉(zhuǎn)錄頻率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的表達(dá)調(diào)控序列，它包括不少于3的奇數(shù)個(gè)區(qū)段，其中每個(gè)區(qū)段可以與其相鄰區(qū)段形成堿基對結(jié)構(gòu)，并且在表達(dá)調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄物中，當(dāng)除了末端區(qū)段以外的區(qū)段各自與其兩個(gè)相鄰區(qū)段之一形成堿基對結(jié)構(gòu)時(shí)，該區(qū)段與其兩個(gè)相鄰區(qū)段的另一區(qū)段不形成堿基對結(jié)構(gòu)；在上游末端的第一區(qū)段和與翻譯前導(dǎo)肽的核糖體相互作用的區(qū)域重疊；在前導(dǎo)肽翻譯過程中，與第一區(qū)段相鄰的第二區(qū)段和與第二區(qū)段相鄰的第三區(qū)段形成堿基對結(jié)構(gòu)；由下游末端區(qū)段和其相鄰區(qū)段形成的堿基對結(jié)構(gòu)是ρ-非依賴型終止子的堿基對結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)調(diào)控序列，其中，第一區(qū)段與前導(dǎo)肽的氨基酸密碼子重疊。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的表達(dá)調(diào)控序列，其中的區(qū)段數(shù)為5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的表達(dá)調(diào)控序列，其中各區(qū)段的序列或其部分和相鄰區(qū)段的序列或其部分構(gòu)成反向重復(fù)序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的表達(dá)調(diào)控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬或沙雷氏菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的表達(dá)調(diào)控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的表達(dá)調(diào)控序列，它順次包括來自上游側(cè)的5段區(qū)段an1-an5，其中區(qū)段an1和an2，以及前導(dǎo)肽的編碼區(qū)來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的衰減子序列，區(qū)段an4和an5來自大腸桿菌的組氨酸操縱子的衰減子序列，而區(qū)段an3來自色氨酸操縱子和組氨酸操縱子的衰減子序列的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的表達(dá)調(diào)控序列，該前導(dǎo)肽被修飾成含有不少于2個(gè)色氨酸殘基。
11.一種調(diào)控靶基因表達(dá)的方法，包括下述步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含包括權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)所定義的表達(dá)調(diào)控序列、連接在該表達(dá)調(diào)控序列上游的啟動(dòng)子和連接在該表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體的細(xì)菌；和改變該表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控表達(dá)所依賴的細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度，以調(diào)控靶基因的表達(dá)。
12.一種生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法，包括步驟培養(yǎng)能夠生產(chǎn)該物質(zhì)的細(xì)菌以產(chǎn)生該物質(zhì)并收集該物質(zhì)，其中該細(xì)菌含包括權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)所定義的表達(dá)調(diào)控序列、連接在該表達(dá)序列上游的啟動(dòng)子和與該靶物質(zhì)的生產(chǎn)有關(guān)且連接在該表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體；并改變該表達(dá)調(diào)控序列調(diào)控表達(dá)所依賴的細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度，以調(diào)控靶基因的表達(dá)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中，通過細(xì)菌氨基酸的合成或降解來改變細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度。
全文摘要
一種依賴細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度來調(diào)控連接于表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列,其中,在含包括表達(dá)調(diào)控序列、連接在表達(dá)調(diào)控序列上游的啟動(dòng)子和連接在表達(dá)調(diào)控序列下游的靶基因的DNA構(gòu)建體的細(xì)菌中,通過增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度而降低在表達(dá)調(diào)控序列中的終止頻率、起始于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的頻率,以增加靶基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1375556SQ0211855
公開日2002年10月23日 申請日期2002年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月22日
發(fā)明者S·V·馬什科, D·V·茲門科夫 申請人:味之素株式會(huì)社