專利名稱：寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母檢測(cè)鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母快速檢測(cè)鑒定方法。
一種用于檢測(cè)鑒定寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母培養(yǎng)基，它除含有普通培養(yǎng)基所需的碳水化合物、生物素、維生素、瓊脂，還含有對(duì)-氨基苯甲酸、螯合劑、生色反應(yīng)促進(jìn)劑以及三種堿性氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其碳水化合物可以是葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖之一，適宜濃度范圍是0.01％到1.00％。其中葡萄糖、果糖和蔗糖是適宜碳源，優(yōu)選葡萄糖。葡萄糖和果糖優(yōu)選0.05％。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基中對(duì)-氨基苯甲酸的濃度范圍是0.1％--1.0％，優(yōu)選0.8％。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其中的天冬酰胺，谷氨酰胺和甘氨酸的濃度范圍是0.1％--1.5％，優(yōu)選1.0％.。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其中生物素濃度范圍10-30微克/升，優(yōu)選20微克/升。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其中維生素可以是B1、B12，B1濃度范圍0.5-1.0g/升，優(yōu)選0.75g/升。B12濃度范圍1.0-3.0mg/升，優(yōu)選2.0mg/升。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其生色反應(yīng)促進(jìn)劑可以是Mn2+和/或Ca2+和/或Fe3+，它們能夠強(qiáng)化該3種酵母Candida tropicalis，Candida parapsilosis，Cryptococcusalbidus的生色反應(yīng)，優(yōu)選陽(yáng)離子為Mn2+。錳離子的形式為MnCl2或MnSO4，優(yōu)選MnCl2。錳鹽的濃度范圍是0.1mMol/L-10mMol/L，優(yōu)選1mMol/L。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其螯合劑可以是EDTA或EDTANa2Fe，優(yōu)選EDTANa2Fe。濃度為0.1mMol/L-10mMol/L，優(yōu)選1.0mMol/L。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其瓊脂用量是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的量。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其pH范圍是pH4-7，優(yōu)選4.0；該培養(yǎng)基的起始pH調(diào)節(jié)緩沖液體系是磷酸鹽，濃度為1mol/L。
根據(jù)本發(fā)明提供的上述培養(yǎng)基的組成及用量，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可配制出本發(fā)明的培養(yǎng)基。
應(yīng)用含有0.1％環(huán)己酰亞胺的本發(fā)明培養(yǎng)基以及不同培養(yǎng)溫度可以區(qū)分熱帶假絲酵母Candida tropicalis、Debaryomyces polymorphus與其他酵母。Candidatropicalis、Debaryomyces polymorphus與其他酵母都能夠在本發(fā)明所述的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和產(chǎn)生顏色，但是在含有0.1％環(huán)己酰亞胺的本發(fā)明培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)的只有熱帶假絲酵母Candida tropicalis、Debaryomyces polymorphus，從而實(shí)現(xiàn)將熱帶假絲酵母Candida tropicalis、Debaryomyces polymorphus與其他酵母區(qū)分；實(shí)驗(yàn)證明Candida tropicalis能夠在40℃下生長(zhǎng)，而Debaryomyces polymorphus不能在40℃下生長(zhǎng)，從而將Candida tropicalis與Debaryomyces polymorphus區(qū)別開(kāi)來(lái)。
應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基可以區(qū)別白隱球酵母菌Cryptococcus albidus與其他具有生色反應(yīng)的酵母，這些酵母都能夠本發(fā)明的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和產(chǎn)生顏色，但是只有Crptococcus albidus能夠在含有硝酸鹽或者亞硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而區(qū)別該酵母與其他酵母。
本發(fā)明培養(yǎng)基中生色底物對(duì)-氨基苯甲酸、氨基酸、生物素、維生素、螯合劑、環(huán)己酰亞胺等成分通過(guò)過(guò)濾除菌，其它成分通過(guò)121℃高壓滅菌，在50-55℃下在無(wú)菌條件下將培養(yǎng)基所有成分混合均勻，后分裝、制作平板。
本發(fā)明檢測(cè)和鑒定微生物方法為本發(fā)明培養(yǎng)基在接種待測(cè)微生物樣品后置于20℃--30℃下保溫培養(yǎng)到24-96小時(shí)。
利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，通過(guò)菌落表面紅色特性可鑒別出對(duì)于本發(fā)明培養(yǎng)基同樣具有生色反應(yīng)的Rhodotorula屬酵母菌株。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，通過(guò)嗅聞菌落散發(fā)出的芳香型發(fā)酵香味特性鑒別出對(duì)于本發(fā)明培養(yǎng)基同樣具有生色反應(yīng)的Pichia屬酵母菌株。
本發(fā)明可以應(yīng)用于來(lái)源于食品、飲料、飼料產(chǎn)品中Candida tropicalis和Candidaparapsilosis菌落計(jì)數(shù)和患者感染部位樣品中Cryptococcus albidus菌落計(jì)數(shù)。
本發(fā)明較已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)鑒定反應(yīng)時(shí)間短；(2)鑒定反應(yīng)具有分類意義上的特異性；(3)鑒定反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)單易操作；(4)檢測(cè)反應(yīng)成本低。
篩選培養(yǎng)基以Chaskes-Tyndall(1975，簡(jiǎn)寫(xiě)為CT培養(yǎng)基)為基礎(chǔ)，維生素類、生色底物和氨基酸物質(zhì)等溶解于200ml溶液中，經(jīng)過(guò)濾除菌，稱為A液；另外800ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基在115℃下滅菌20分鐘，冷卻到50℃后與A液混合，并倒加厚平板?；A(chǔ)培養(yǎng)基組成為4g KH2PO4，2.5g MgSO4.7H2O，0.5g葡萄糖和20g瓊脂，加800ml蒸餾水。A瓶溶液組成為0.1或者1.0g生色底物，1.0g天冬酰胺，1.0g甘氨酸和1.0g谷氨酰胺，加20μg生物素、2mg維生素B12和1g維生素B1，溶解于蒸餾水200ml，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除菌(0.45μm孔徑)。同時(shí)，設(shè)置由有機(jī)物組成的培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為YCB培養(yǎng)基)，對(duì)照培養(yǎng)基的有機(jī)培養(yǎng)基A液組成為0.1或者1.0g生色底物，11.7g酵母碳源，溶解于200ml溶液中，經(jīng)過(guò)濾除菌；對(duì)照培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為3g細(xì)菌用蛋白胨和20g瓊脂溶解于800ml蒸餾水中，在115℃下滅菌20分鐘，冷卻到50℃后與A液混合，并倒加厚平板。培養(yǎng)基各組分在滅菌前用1M K2HPO4或1M KH2PO4調(diào)整培養(yǎng)基初始pH到5.5。4，微生物培養(yǎng)微生物樣品或者活化的酵母斜面接種到上述平板培養(yǎng)基上，每平皿接種三個(gè)菌種，24℃下倒置培養(yǎng)1-3天，每天記錄菌體生長(zhǎng)和顏色產(chǎn)生情況，將有色現(xiàn)象稱為陽(yáng)性反應(yīng)。并用加號(hào)多少表示生長(zhǎng)情況和顏色分泌量大小。然后將初篩具有顏色陽(yáng)性反應(yīng)的菌株進(jìn)一步在單獨(dú)平板上作重復(fù)驗(yàn)證，以排除在初步篩選中因?yàn)?個(gè)菌株共處于同1平板而產(chǎn)生的干擾效應(yīng)。5，區(qū)別鑒定對(duì)于具有生色陽(yáng)性反應(yīng)的酵母進(jìn)一步做具有特異性的區(qū)別鑒定，5.1酵母菌落生色陽(yáng)性效應(yīng)與種屬特異性Candida tropicalis和Candida parapsilosis對(duì)4-氨基苯甲酸具有明顯陽(yáng)性反反應(yīng)。在86個(gè)菌株中唯一只有此二種菌株具有陽(yáng)性反應(yīng)。表明該反應(yīng)具有較高程度的特異性。5.2假絲酵母屬Candida 12個(gè)種的菌株對(duì)4-氨基苯甲酸反應(yīng)的特異性從表1可以看出，12種假絲酵母均能夠利用4--氨基苯甲酸正常生長(zhǎng)，但是只有寄生型假絲酵母和熱帶假絲酵母具有陽(yáng)性生色反應(yīng)。這顯示出該生色反應(yīng)具有較強(qiáng)的特異性。具有建立鑒定培養(yǎng)基的可能性。5.3寄生型假絲酵母Candida parapsilosis和熱帶假絲酵母Candida tropicalis種內(nèi)不同菌株在含0.1％4-氨基苯甲酸的CT培養(yǎng)基上的生色效應(yīng)特異性12株寄生型假絲酵母和9株熱帶假絲酵母分別僅各有2株具有陽(yáng)性效應(yīng)，從72h到192h生色強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。顯然，該陽(yáng)性反應(yīng)在該培養(yǎng)基條件下對(duì)此二種生色底物均不具有種的特異性。因此該培養(yǎng)基不具備作為鑒定此二種變質(zhì)微生物的基本條件。顯然，0.1％4-氨基苯甲酸對(duì)于1922和1927此寄生型假絲酵母二株的生長(zhǎng)具有明顯的抑制效應(yīng)。5.4陽(yáng)離子對(duì)寄生型假絲酵母和熱帶假絲酵母在含4-氨基苯甲酸的CT培養(yǎng)基上的生色效應(yīng)的影響選擇15種陽(yáng)離子化合物研究了它們對(duì)寄生型假絲酵母和熱帶假絲酵母在4-氨基苯甲酸的CT培養(yǎng)基上的生色效應(yīng)的影響。這15種陽(yáng)離子化合物的形式是FeCl3·6H2O，NH4Fe(SO4)2·12H2O，F(xiàn)ePO4·4H2O，檸檬酸三鐵，F(xiàn)eSO4·7H2O，MnSO4·5H2O，MnCl2·5H2O，H24Mo7N6O24·4H2O，(NH4)2MoO2·4H2O，Na2·Mo4O4·2H2O，ZnSO4·7H2O，ZnCl2，Ca(NO3)2·4H2O，Co(NO3)2·6H2O，CuSO4·5H2O。處理1，2，3，4，5，......，14，15和16分別代表FeCl3·6H2O，NH4Fe(SO4)2·12H2O，F(xiàn)ePO4·4H2O，檸檬酸三鐵，F(xiàn)eSO4·7H2O，MnSO4·5H2O，MnCl2·5H2O，H24Mo7N6O24·4H2O，(NH4)2MoO2·4H2O，Na2·Mo4O4·2H2O，ZnSO4·7H2O，ZnCl2，Ca(NO3)2·4H2O，Co(NO3)2·6H2O，CuSO4·5H2O，和對(duì)照。處理1，2，5，6和7的陽(yáng)離子在培養(yǎng)基中的終濃表1.Candida 12個(gè)種在含0.1％4-氨基苯甲酸的CT培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和生色效應(yīng)

注培養(yǎng)基中生色底物濃度0.1％(W/V)，如無(wú)特別說(shuō)明以下各表生色底物均為此濃度。產(chǎn)生的褐色素分泌于菌體之外.不接種的對(duì)照平板無(wú)自氧化現(xiàn)象，不產(chǎn)生任何顏色。P代表菌落生色強(qiáng)度，數(shù)字表示強(qiáng)弱；G代表菌落長(zhǎng)勢(shì)，數(shù)字表示強(qiáng)弱。以下各表同，不再重復(fù)說(shuō)明。度均為0.25mMol/l，其它處理均為0.10mMol/l。與對(duì)照比較，多數(shù)陽(yáng)離子化合物能有效促進(jìn)生色反應(yīng)，尤其是Co(NO3)2·6H2O，CuSO4·5H2O效果最佳，次為MnSO4·5H2O、MnCl2·5H2O和NH4Fe(SO4)2·12H2O，其余化合物如FeCl3·6H2O，F(xiàn)ePO4·4H2O，檸檬酸三鐵，H24Mo7N6O24·4H2O，(NH4)2MoO2·4H2O，Na2·Mo4O4·2H2O，ZnSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O都能夠程度不同的促進(jìn)生色反應(yīng)；FeSO4·7H2O不僅不能夠促進(jìn)生色反應(yīng)強(qiáng)度，反而抑制顏色產(chǎn)生，ZnCl2效果也不理想。需要指出的是盡管如此多的化合物能夠顯著促進(jìn)生色反應(yīng)，但是沒(méi)有一種化合物能夠增加產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的菌株數(shù)量。5.5螯合劑及螯合劑與陽(yáng)離子互作對(duì)寄生型假絲酵母和熱帶假絲酵母在含4-氨基苯甲酸的CT培養(yǎng)基上的生色效應(yīng)的影響從表2知，與CT培養(yǎng)基比較，螯合劑具有明顯的強(qiáng)化菌株生色陽(yáng)性反應(yīng)和增加陽(yáng)性菌株的雙重作用。而螯合劑和金屬離子還具有正向互作效應(yīng)，具有明顯互作效應(yīng)的處理組合是EDTANa2Fe+MnCl2+CT和EDTANa2Fe+MnSO4+CT，該二處理組合不僅強(qiáng)化了生色效應(yīng)，更為重要的是增加了具有陽(yáng)性效應(yīng)的菌株數(shù)量，培養(yǎng)至48h，EDTANa2Fe+MnCl2+CT處理組合中熱帶假絲酵母的陽(yáng)性反應(yīng)率達(dá)到100％，寄生型假絲酵母菌株的陽(yáng)性反應(yīng)率也達(dá)到80％以上。兩個(gè)種的部分菌株(1811，1914，1810，1988)陽(yáng)性反應(yīng)在16小時(shí)內(nèi)就很明顯(表中未列出)。其次是EDTANa2Fe+Co(NO3)2+CT處理組合也增加了具有陽(yáng)性反應(yīng)的熱帶假絲酵母菌株數(shù)量。但是當(dāng)將EDTANa2Fe和鹽濃度由1mMol/l提高到2mMol/l時(shí)(表3)，在48h內(nèi)，EDTANa+MnCl2+CT處理組合中二菌種的陽(yáng)性反應(yīng)明顯強(qiáng)化，二種假絲酵母21個(gè)菌株的陽(yáng)性反應(yīng)率均同時(shí)達(dá)到100％，顯然，這是本發(fā)明最佳結(jié)果。而EDTANa2Fe+MnSO4+CT處理組合中的陽(yáng)性反應(yīng)率則沒(méi)有因?yàn)闈舛忍岣叨l(fā)生變化。在處理組合EDTANa2Fe+MnCl2(1+0.1mMol/l)中，即使MnCl2濃度降低10倍，熱帶假絲酵母陽(yáng)性反應(yīng)率仍為100％；寄生型假絲酵母陽(yáng)性反應(yīng)率為90％以上。表2和表3結(jié)果充分說(shuō)明在影響此二菌種生色陽(yáng)性反應(yīng)中，螯合劑起主導(dǎo)作用，其次為金屬離子作用，尤其以EDTANa2Fe+MnCl2效果最佳，其次為EDTANa2Fe+MnSO4。
表2螯合劑及螯合劑與陽(yáng)離子互作對(duì)寄生型假絲酵母和熱帶假絲酵母在含4-氨基苯甲酸的CT培養(yǎng)基上的生色效應(yīng)的影響 注*處理號(hào)1，2，3，4，5，6和7內(nèi)容分別為EDTANa+MnCl2+CT，EDTANa+MnSO4+CT，EDTANa+CuSO4+CT，EDTANa+NH4FeSO4+CT，EDTANa+Co(NO3)2+CT，EDTANa+Ca(NO3)2+CT，EDTANa+CT(CK)和CT(CKo)；EDTANa和其它鹽份終濃度均為1mMol/L.表3螯合劑與陽(yáng)離子互作對(duì)寄生型假絲酵母和熱帶假絲酵母在4-氨基苯甲酸培養(yǎng)基上生色效應(yīng)的影響* 注*處理號(hào)1，2，3，4，5，6和7分別是EDTANaFe+MnCl2(1+1mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnSO4(1+1mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnCl2(2+2mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnSO4(2+2mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnCl2(1+0.1mMol/l)+CT，EDTANaFe+MnCl2(0.1+0.1mMol/l)+CT，EDTANaFe(2.0mMol/l)+CT(CK)和EDTANaFe(1.0mMol/l)+CT(CKo)。6.酵母對(duì)上述最佳生色(陽(yáng)性)反應(yīng)的種屬特異性表4.酵母23個(gè)屬的70個(gè)種對(duì)上述特異性陽(yáng)性反應(yīng)的種和屬的特異性效應(yīng)*

注*培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同于表3中的1號(hào)處理。所有觀測(cè)結(jié)果來(lái)自于120h；**(1)和(2)分別指不包括和包括Candida parapsilosis和Candida tropicalis在內(nèi)的結(jié)果；***在90(1)或109(2)菌株中有26個(gè)至144h生長(zhǎng)完全受到抑制，分別占總數(shù)28.89％和23.85％。
上述陽(yáng)性反應(yīng)的特異性是該生色反應(yīng)能否成為鑒定培養(yǎng)基的重要特征，將這種生色培養(yǎng)基推廣到23個(gè)屬的70種，以檢驗(yàn)其陽(yáng)性反應(yīng)的特異性發(fā)現(xiàn)23個(gè)屬中有7個(gè)具有陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)率約為26％，70個(gè)種中有14個(gè)種具有陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)率約為20％，90個(gè)菌株中共有20個(gè)菌株具有陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)率約為22％。具有較高的特異性(表4)，是建立鑒定培養(yǎng)基可以接受的范圍。7.區(qū)分Candida parapsilosis與Candida tropicalis和其它具有陽(yáng)性反應(yīng)的菌株根據(jù)該2種菌株固有特性，不難區(qū)別，Candida tropicalis具有抗環(huán)己酰亞胺能力，在0.1％環(huán)己酰亞胺的CT培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)，而Candida parapsilosis不具有這一能力，不能夠在0.1％環(huán)己酰亞胺的CT培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)；應(yīng)用含有0.1％對(duì)氨基苯甲酸和0.1％環(huán)己酰亞胺的CT培養(yǎng)基，即可以將區(qū)別此二菌種，從表5可以看出在有0.1％對(duì)-氨基苯甲酸和0.1％環(huán)己酰亞胺的CT培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)的菌株除了Candida tropicalis之外，還有Debaryomyces polymorphus(1587)，Debcast(1870)Can albi(1862)，1894 Deb occi，1899 Deb nep，但是能夠生長(zhǎng)而且又能夠產(chǎn)生生色反應(yīng)的只有Debaromyces polymorphus(1587)，因此，到此為止最后的任務(wù)就是進(jìn)一步區(qū)別Candida tropicalis和Debaryomyces polymorphus。表5.對(duì)0.1％ p-氨基苯甲酸陽(yáng)性反應(yīng)的菌株在含有0.1％環(huán)己酰亞胺的CT培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況*(24℃，96h)

注生色檢測(cè)培養(yǎng)基組成含有0.1％p-氨基苯甲酸，1mMol/l EDTANa2Fe和1mMol/l MnCl2的CT培養(yǎng)基；生長(zhǎng)檢測(cè)培養(yǎng)基組成含有0.1％p-氨基苯甲酸和0.1％環(huán)己酰亞胺的CT培養(yǎng)基。8.區(qū)分Candida tropicalis和Debaryomyces polymorphus菌株生長(zhǎng)溫度適應(yīng)性檢測(cè)最后，簡(jiǎn)單快速區(qū)別Candida tropicalis和Debaryomycespolymorphus的辦法是前者能夠在40℃下生長(zhǎng)，而后者則不能夠。實(shí)施例2最佳檢測(cè)培養(yǎng)基成分與配制本發(fā)明培養(yǎng)基物質(zhì)包括A溶液+B溶液。
A溶液1g維生素B1，2mg/L B12和20微克/L生物素、0.8％對(duì)-氨基苯甲酸，三種堿性氨基酸1.0％天冬酰胺，1.0％谷安酰胺和1.0％甘氨酸，1mMol/L MnCl2，1mMol/L EDTANa2Fe等溶解于200ml溶液中，經(jīng)微孔濾膜(0.45μm孔徑)過(guò)濾除菌。
B溶液4g KH2PO4，2.5g MgSO4.7H2O，0.5g葡萄糖和20g瓊脂，加800ml蒸餾水。800ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基在115℃下滅菌20分鐘，冷卻到50℃后與A液混合，并倒加厚平板。
該培養(yǎng)基的A和B溶液起始pH4.0；用磷酸鉀鹽緩沖液(1mol/L)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基起始pH。
同時(shí)，設(shè)置由有機(jī)物組成的培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為YCB培養(yǎng)基)，對(duì)照培養(yǎng)基的有機(jī)培養(yǎng)基A液組成為0.1或者1.0g生色底物，11.7g酵母碳源，溶解于200ml溶液中，經(jīng)過(guò)濾除菌；對(duì)照培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為3g細(xì)菌用蛋白胨和20g瓊脂溶解于800ml蒸餾水中，在115℃下滅菌20分鐘，冷卻到50℃后與A液混合，并倒加厚平板。培養(yǎng)基各組分在滅菌前用1M K2HPO4或1M KH2PO4調(diào)整培養(yǎng)基初始pH到5.5。實(shí)施例3.檢測(cè)培養(yǎng)基在食品和病牛尿樣品檢測(cè)中的使用在本發(fā)明最佳檢測(cè)培養(yǎng)基上接種來(lái)自于超級(jí)市場(chǎng)過(guò)期開(kāi)口盒裝酸奶的分離稀釋液10-5，10-6，10-8三個(gè)稀釋度，各三皿，100ul/皿；另外接種活化的酵母菌株Candidatropicalis，Candida parapsilosis和Cryptococcus albidus，Debaryomyces polymorphus，Pichia anomala，Rhodotorula mucilaginosa斜面等成熟細(xì)胞稀釋液三個(gè)10-5，10-6，10-8稀釋度，各三皿，100ul/皿；24℃下倒置培養(yǎng)1-3天，每天記錄菌體生長(zhǎng)和顏色產(chǎn)生情況，將有色現(xiàn)象稱為陽(yáng)性反應(yīng)。并用加號(hào)多少表示生長(zhǎng)情況和顏色分泌量大小。然后將初篩具有顏色陽(yáng)性反應(yīng)的菌株進(jìn)一步在單獨(dú)平板上作重復(fù)驗(yàn)證。并且按照本發(fā)明所述的檢測(cè)鑒定方法，進(jìn)行逐一鑒別、計(jì)數(shù)檢測(cè)，所得結(jié)果如下(1)在變質(zhì)乳品中檢出有病原菌酵母Cryptococcus albidus 21CFU/ml(3)至于所接種Candida tropicalis，Candida parapsilosis和Cryptococcus albidus，Debaryomyces polymorphus，Pichia anomala，Rhodotorula mucilaginosa均具有陽(yáng)性生色反應(yīng)。實(shí)施例4檢測(cè)培養(yǎng)基在飼料酵母樣品中的檢測(cè)使用取河南、山東和河北酵母飼料廠家在有效貨架期內(nèi)產(chǎn)品各20克，分別標(biāo)記為樣品1，2，3，各取1克樣品，用無(wú)菌水稀釋制作形成10-6，10-7，10-8，10-9四個(gè)稀釋度，各取100ul，涂布本發(fā)明檢測(cè)平板，重復(fù)4次。并且按照本發(fā)明所述的檢測(cè)鑒定方法，進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果如下樣品1，2，3分別含有Candida tropicalis為0.65億CFU/g，0.11億萬(wàn)CFU/g，和1.5億萬(wàn)CFU/g。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)鑒定寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母培養(yǎng)基，包括碳水化合物、生物素、維生素、瓊脂，其特征在于該培養(yǎng)基含有對(duì)-氨基苯甲酸、螯合劑、生色反應(yīng)促進(jìn)劑以及三種堿性氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于碳水化合物可以是葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖之中的一種或多種，適宜濃度是0.01％-1.00％。
3.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基中對(duì)-氨基苯甲酸的濃度是0.1％--1.0％，優(yōu)選0.8％。
4.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基中天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的濃度是0.1％--1.5％，優(yōu)選1.0％。
5.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基中生物素濃度為10-30微克/升，優(yōu)選20微克/升。
6.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于生色反應(yīng)促進(jìn)劑可以是Mn2+或/和Ca2+或/和Fe3+，優(yōu)選為Mn2+。
7.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于生色反應(yīng)促進(jìn)劑是MnCl2或MnSO4，濃度是0.1mMol/L-10mMol/L。
8.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于螯合劑可以是EDTA或EDTANa2Fe，濃度為0.1mMol/L-10mMol/L。
9.一種檢測(cè)鑒定熱帶假絲酵母Candida tropicalis與其他酵母的方法，其特征在于應(yīng)用含有0.1％環(huán)己酰亞胺的權(quán)利要求1培養(yǎng)基區(qū)分熱帶假絲酵母Candida tropicalis、Debaryomyces polymorphus與其他酵母；再用熱帶假絲酵母Candida tropicalis與Debaryomyces polymorphus酵母在含有0.1％環(huán)己酰亞胺的權(quán)利要求1培養(yǎng)基上在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)狀況檢測(cè)區(qū)分熱帶假絲酵母Candidatropicalis與Debaryomyces polymorphus酵母。
10.一種區(qū)分白隱球酵母菌Cryptococcus albidus與具有生色反應(yīng)的其他酵母的方法，其特征在于應(yīng)用Crptococcus albidus能夠在含有硝酸鹽或者亞硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而區(qū)別該酵母與其他酵母。
全文摘要
本發(fā)明是一種寄生型假絲酵母、熱帶假絲酵母和白隱球酵母快速檢測(cè)鑒定方法。本發(fā)明的培養(yǎng)基除含有普通培養(yǎng)基所需的碳水化合物、生物素、維生素、瓊脂，還含有對(duì)－氨基苯甲酸、螯合劑、生色反應(yīng)促進(jìn)劑以及三種堿性氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。本發(fā)明具有鑒定反應(yīng)時(shí)間短、鑒定反應(yīng)具有分類意義上的特異性、鑒定反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)單易操作、檢測(cè)反應(yīng)成本低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1396266SQ0212344
公開(kāi)日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者王建華 申請(qǐng)人:王建華, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所