專利名稱：白點癥桿狀病毒的多核苷酸片段及使用其檢測病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種感染節(jié)肢動物，特別是蝦類的新病毒性病原體的鑒定、純化及檢測。該病毒命名為WSBV(白點癥桿狀病毒)。本發(fā)明尤其涉及WSBV的特征性多核苷酸片段及使用其檢測病毒的方法。
背景技術(shù)：
近年來，由于疾病的爆發(fā)造成亞洲國家的養(yǎng)殖蝦類大量死亡。自1992年起，在臺灣北部爆發(fā)一種新的疾病，造成養(yǎng)殖的斑節(jié)蝦(Penaeusjaponicus)族群嚴重死亡，此病的特征為患病蝦體的頭胸甲、附肢及蝦體內(nèi)面表皮組織會出現(xiàn)明顯的白點，并且發(fā)病后2至7天內(nèi)的死亡率達100％。患病的蝦體通?；顒恿p弱，肝胰腺略紅。1993年間，白點癥亦出現(xiàn)于臺灣的養(yǎng)殖草蝦(P.monodon)及紅尾蝦(P.penicillatus)，目前已有學者針對白點癥所造成的危害提出報導(董明澄等，個人報導)
在日本，有關(guān)斑節(jié)蝦的疫情報導亦有類似發(fā)現(xiàn)(Nakano et al.，F(xiàn)ish Pathology，29(2)135-139，1994)。根據(jù)電子顯微鏡的觀察及以病蝦淋巴組織濾液進行的感染試驗結(jié)果顯示，造成白點癥的病原體為一桿狀病毒，暫稱之為RV-PJ，(rod-shaped nuclear virusof Penaeus japonicus)(Inouye et al.，F(xiàn)ish Pathology，29(2)149-158，1994；Takahashi et al.，F(xiàn)ish Patyhology，29(2)121-125，1994)。
目前養(yǎng)殖對蝦類普遍受到桿狀病毒感染的事實已有明確報導(Lightner et al.，Aquaculture，32209-233，1983)。在這些感染對蝦類的桿狀病毒中，以monodon baculovirus(MBV)，baculoviralmid-gut necrosis virus(BMNV)及Baculovirus(MBV)，baculoviralmid-gut necrosis virus(BMNV)及Baculovirus penaei(BP)最為重要，因其感染養(yǎng)殖蝦類而造成嚴重損失(Couch，Nature 247(5438)22-231，1974；J.Invertebr.Pathol.，24311-331，1974；Lihgtner et al.(1983)，supra；Lightner et al.，1987；Sano etal.，F(xiàn)ish Pathology，15185-191，1981)。
自然界中患白點癥的蝦體組織內(nèi)可觀察到桿狀病毒的存在(董明澄等，個人報導)。此病毒極可能是造成臺灣養(yǎng)殖對蝦類白點癥的主要致病原。為避免此病毒的擴散，造成養(yǎng)殖蝦類因白點癥的危害而導致經(jīng)濟上嚴重損失，實在需要發(fā)展鑒定致病原及診斷的方法，以期在不犧牲檢測個體的狀況下，能以方便、精準又不費時的方法檢測白點癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于一種引起對蝦白點癥的新病原的發(fā)現(xiàn)。此病原已被分離及純化，為一種無包含體桿狀病毒粒子，具有包膜，長約330±20nm，直徑約87±7nm。此病毒被認定為桿狀病毒科(Baculovirdae)，裸桿狀病毒亞科(Nudibaculovirinae)，無包含體桿狀病毒屬(NOB，Non-Occluded Baculovirus)的一員，本發(fā)明所分離的病毒被稱為PmNOBIII，而與白點癥相關(guān)的病毒則稱之為WSBV(白點癥桿狀病毒)。WSBV的基因組DNA文庫已被建立，并基于其中一段克隆的DNA片段序列設(shè)計出一對WBSV專一性引物對，用于通過PCR反應檢測對蝦類WSBV的侵染。以此WSBV專一性引物對進行PCR反應的結(jié)果顯示，不同蝦種白點癥的致病原事實上是密切相關(guān)的。因此本發(fā)明的結(jié)果提供了一有效的檢測工具，適用于篩檢動物宿主生物體特別是蝦類中的白點癥桿狀病毒的傳染，所以本發(fā)明的使用對于防止此病毒性疾病的蔓延是相當重要的。一個簡易、靈敏、專一性高又立即可用于診斷的產(chǎn)品，其中包括基于一個獨特的白點癥桿狀病毒基因組DNA克隆的核苷酸序列所設(shè)計的引物對，可被發(fā)展成檢測白點癥桿狀病毒的存在及防止此病毒性疾病蔓延的工具。
本發(fā)明的特征和優(yōu)點將通過參照附圖對優(yōu)選實施方案的描述而變得清楚明了。


圖1為患白點癥草蝦(P.monodon)的照片，示出白點由不易辨到直徑約3mm不等。比例尺1cm。
圖2為觀察白點癥草蝦頭胸甲外骨骼下的角質(zhì)狀表皮(C)等組織的光學顯微鏡照片，有分解現(xiàn)象的細胞其細胞核脹大并呈現(xiàn)許多嗜堿性包含體(箭頭所指處)。比例尺10μm。
圖3為白點癥草蝦頭胸甲外骨骼下的角質(zhì)狀表皮(C)等組織的透射電鏡照片，示出在壞死區(qū)域脹大的細胞核中有病毒粒子存在(箭頭所指處)。比例尺0.5μm。
圖4示出以病草蝦組織過濾液人工感染斑節(jié)蝦(P.japonicus)后，在其表皮組織所出現(xiàn)的桿狀病毒粒子。比例尺200nm。
圖5為以負染法觀察患病草蝦表皮組織濾液沉淀物中的桿狀病毒粒子的顯微照片。比例尺50nm。
圖6示出人工感染斑節(jié)蝦剝離的頭胸甲，上有明顯白點(箭頭所指)。
圖7示出人工感染斑節(jié)蝦(平均體重0.08g)的累計死亡率(％)。實驗組浸泡于病草蝦及病斑節(jié)蝦的組織過濾液中，對照組則以健康草蝦組織過濾液浸泡。
圖8為以透射電子顯微鏡觀察純化的病毒粒子(負染法)，病毒粒子一端延伸出尾狀凸出物(tail-like projection)(P)。比例尺0.1μm。
圖9為以透射電子顯微鏡觀察純化的病毒粒子(負染法)，顯示由病毒衣殼蛋白環(huán)狀亞基所形成的橫紋，此環(huán)狀排列與病毒衣殼長軸垂直。比例尺0.1μm。
圖10為由純化病毒提取的PmNOBIII DNA的溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠上顯示出病毒的單一DNA分子。泳道1為分子量標記(λ/HindIII DNA片段標記物)；泳道2-4為三次分別純化的PmNOBIII DNA。
圖11為PmNOBIII DNA以三種限制性內(nèi)切酶酶切后的瓊脂糖凝膠電泳(經(jīng)溴化乙錠染色)。凝膠上至少有22個片段。泳道1λDNA HindIII片段標記物；泳道2PmNOBIIIDNA以HindIII酶切的片段。泳道3PmNOBIII DNA以SalI酶切的片段。泳道4PmNOBIII DNA以XhoI酶切的片段。泳道51kb DNA梯。
圖12示出蝦基因組DNA經(jīng)PCR反應擴增的18SrDNA片段，經(jīng)DNA電泳分析及溴化乙錠染色后的瓊脂糖凝膠。反應使用用于節(jié)肢動物18S RNA高保守區(qū)序列的引物143F，145R，以健康蝦DNA為模板進行PCR反應擴增出一848bp的DNA片段(泳道2)。泳道1pGEM DNA分子量標記物。DNA分子量標記物的大小單位為堿基對(bp)。
圖13示出了以蝦類DNA專一性引物對143F，145R，進行PCR反應，檢測WSBV基因組DNA制備物中是否夾雜蝦DNA的定性分析。PCR反應產(chǎn)物以1％凝膠電泳分析，PCR擴增產(chǎn)物若出現(xiàn)848bp的片段則代表存在蝦DNA的污染。泳道1pGEM DNA分子量標記物。泳道2-6以各白點病桿狀病毒(WSBV)基因組DNA為模板進行PCR的擴增產(chǎn)物。泳道7-8以健康草蝦DNA為模板進行PCR的擴增產(chǎn)物。泳道9無DNA模板所進行PCR的擴增產(chǎn)物。標記物DNA片段的大小單位為堿基對(bp)。
圖14示出WSBV基因組以SalI酶切割的片段。WSBV基因組DNA以SalI在37℃下作用3小時，取5μl以0.8％凝膠電泳分析，并用溴化乙錠染色，顯示出片段由15kb到1kb不等(泳道2)，自相同反應物中取20μl進一步建立白點癥桿狀病毒(WSBV)的基因組文庫。泳道1λ/HindIII片段標記物。DNA分子量標記物的大小單位為堿基對(bp)。
圖15A表示以SalI酶切的1461bp片段的克隆于pms146質(zhì)粒的位置圖。
圖15B示出用于PCR反應的引物在SalI-1461bp DNA片段上的位置。146F1及146R1引導1447bp片段的擴增，而146F2及146R2則引導941bp片段的擴增，SalI 1461bp DNA片段中的兩個EcoRI酶切位點也在圖中示出。
圖15C示出SalI-1461bp片段的詳細的核苷酸序列，其中也示出兩個引物對(146F1/146R1，146F2/146R2)以及兩個EcoRI酶切位點。
圖15D示出由SalI-1461bp片段所設(shè)計的六個引物對的核苷酸序列。
圖16示出由蔗糖密度梯度離心純化的WSBV病毒DNA為模板進行PCR反應，所擴增的WSBV DNA片段及蝦類DNA特異性片段。泳道2，5，8，11的反應所使用的為WSBV專一性引物對143F1/146R1，擴增出一1447bp DNA片段。泳道3，6，9，12進行PCR反應所使用的為蝦類DNA專一性引物對143F/145R。泳道4，7，10，13則使用143F/145R及146F1/146R1引物對同時反應。PCR擴增產(chǎn)物均以1％瓊脂糖凝膠電泳分析。泳道1pGEM DNA分子量標記；泳道2-4以病蝦(1#)表皮組織所純化的病毒的DNA為模板進行PCR反應的擴增產(chǎn)物，示出蝦類DNA帶和WSBV DNA帶。泳道5-7以病蝦(2#)表皮組織所純化的病毒的DNA為模板進行PCR反應的擴增產(chǎn)物，顯示只擴增出WSBV DNA帶。泳道8-10以病蝦(2#)肌肉組織所純化的病毒的DNA為模板進行PCR反應的擴增產(chǎn)物，顯示擴增出集中的蝦類DNA帶和WSBV DNA帶。泳道11-13以健康蝦DNA為模板進行PCR反應的擴增產(chǎn)物，顯示只擴增出蝦類DNA帶。DNA分子量標記物的大小單位為堿基對(bp)。
圖17顯示由pms146質(zhì)?；蚧及c癥的草蝦DNA為模板進行PCR反應所擴增的WSBV及蝦類專一性DNA的片段。泳道2，5，8，11所使用的引物為WSBV專一性引物146F1，146R1，所擴增的產(chǎn)物大小為1447bp，泳道3，6，9，12使用專一于1447bp片段的內(nèi)部引物146F2，146R2，所擴增的產(chǎn)物大小為941bp，泳道4，7，10所使用的是蝦類DNA專一性引物143F，145R，所擴增的產(chǎn)物大小為848bp。以上擴增產(chǎn)物均以1％瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析。泳道1pGEM DNA分子量標記物，泳道2-4pms146質(zhì)粒DNA，泳道5-7自然患病草蝦的DNA提取物，泳道8-10自然患病斑節(jié)蝦的DNA提取物，泳道11-12為不加模板反應的對照組。DNA分子量標記物的大小單位為堿基對(bp)。
圖18顯示以人工感染W(wǎng)SBV的病草蝦DNA為模板進行PCR反應所擴增的WSBV及蝦類專一性的DNA片段。PCR反應使用引物146F1，146R1，其所擴增的產(chǎn)物大小為1447bp，擴增產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析。泳道1pGEM DNA分子量標記物，泳道2-4分別為以三尾人工感染的草蝦DNA為模板進行PCR所擴增的產(chǎn)物，泳道5-7分別為以三尾健康草蝦DNA為模板進行PCR所擴增的產(chǎn)物。DNA分子量標記物的大小單位為堿基對(bp)。
圖19為WSBV感染的健康草蝦的DNA與DIG標記的1447bpPCR產(chǎn)物進行的斑點雜交反應。將兩尾受WSBV感染的病蝦DNA(1，2)及兩尾健康蝦DNA(3，4)以雙份(A，B)點在Hybond-N paper上，接著以DIG標記的1447bp PCR產(chǎn)物片段為探針進行斑點雜交反應，此探針只與受感染的蝦的DNA雜交，而不與健康蝦DNA雜交。
圖20為來自患病草蝦或斑節(jié)蝦的WSBV DNA與DIG標記的1447bp PCR產(chǎn)物進行的Southern雜交。來自草蝦或斑節(jié)蝦的WSBVDNA以SalI酶切后，轉(zhuǎn)印至Hybond-N paper上并以DIG標記的1447bp PCR產(chǎn)物進行探測。結(jié)果顯示探針以相同的強度與由草蝦或斑節(jié)蝦來源的WSBV DNA經(jīng)SalI酶切后的1461bp片段雜交，因此顯示它們密切的相關(guān)性。A以溴乙錠染色的0.8％瓊脂糖凝膠，B凝膠(A)的Southern印跡的放射自顯影圖。泳道1pGEM DNA分子量標記物，泳道2由草蝦分離純化的WSBV的基因組DNA的SalI酶切片段，泳道3由斑節(jié)蝦分離純化的WSBV基因組DNA的SalI酶切片段。
圖21示出以疫區(qū)收集的節(jié)肢動物的DNA為模板，并利用WSBV專一性引物對146F1/146R1進行的PCR擴增反應。泳道1pGEMDNA分子量標記物，泳道2草蝦，泳道3斑節(jié)蝦，泳道4螃蟹，泳道5橈足類，泳道6昆蟲(水蠅科)，泳道7正反應對照組，DNA來自已知的病蝦，泳道8負反應對照組，樣品未加模板。
具體實施方案
臺灣的養(yǎng)殖對蝦近來相繼爆發(fā)病害，造成經(jīng)濟上的嚴重損損，其中包括草蝦(Penaeus monodon)、斑節(jié)蝦(P.japonicus)、紅尾蝦(P.penicillatus)等。其共同病征為頭胸甲、附肢及蝦體內(nèi)表面上出現(xiàn)明顯白點。為鑒定造成對蝦白點癥之病原體，使用電子顯微鏡觀察患病的蝦體組織。取具有明顯白點患病草蝦及斑節(jié)蝦的表皮萃取液浸泡不同大小的健康斑節(jié)蝦，進行感染實驗。
利用電子顯微鏡觀察人工感染或自然感染的患病斑節(jié)蝦，均發(fā)現(xiàn)一種無包含體的桿狀病毒粒子存在于病蝦的表皮組織中。此病毒粒子具包膜，長約330±20nm，直徑約87±7nm。這些人工感染的蝦很象自然感染的蝦。將含此病毒的濾液直接接種于魚類細胞株，未發(fā)生細胞病變的現(xiàn)象。在人工感染實驗中，累計死亡率在5-7天內(nèi)高達100％，且實驗蝦易受撈捕及溫度改變等緊迫因子影響而死亡。
由于自然界中患病的病蝦與人工感染的病蝦的病征及所見到的病毒形態(tài)非常相似，因此可判斷此桿狀病毒是造成臺灣養(yǎng)殖對蝦白點癥的主要病原體，因此，這種病毒性疾病被命名為“白點癥”(W.S.S)，而此病原體的分類地位則以進一步研究分離自患W.S.S病草蝦的病原體(白點癥病毒)來判定。
所述的病原體自患白點癥的草蝦純化得到。此病毒粒子以負染法觀察時是多態(tài)的，呈橢圓形或紡錘形或桿形，長約250-380nm，最寬處約70-150nm，部分病毒粒子的一端具有尾狀凸出物。病毒衣殼是由亞基環(huán)繞相疊而成，呈現(xiàn)與病毒衣殼縱軸垂直的特殊橫紋狀。病毒基因組為雙鏈DNA分子，經(jīng)由HindIII酶切后，至少可分為22個片段，總長約150kb，基于形態(tài)特征及基因組結(jié)構(gòu)，可確認此病毒屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)，裸桿狀病毒亞科(Nudibaculovirinae)，無包含體桿狀病毒屬(Non-OccludedBaculovirus)，因此稱最近所分離的病毒為PmNOBIII，而與PmNOBIII相關(guān)的病毒則稱為WSBV(白點癥桿狀病毒)。
目前推測和PmNOBIII相類似的WSBV包括在大陸地區(qū)于1993-1994年間所發(fā)生的EEDS致病原-皮下及造血組織壞死桿狀病毒(hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus，HHHNBV)(Cai et al.，J.Fish.China，19112-117，1995)以及發(fā)生于泰國地區(qū)養(yǎng)殖草蝦的系統(tǒng)性外胚層及中胚層組織桿狀病毒(Systematic ectodermal and mesodermal baculovirus SEMBV)，(Wang et al.，Dis.aquat.Org.，23239-242，1996；Wongteerasupayaet al.，Dis.aquat.Org，2169-77，1995)
這種新病毒疾病的主要臨床癥狀為病蝦的外骨骼及表皮上出現(xiàn)明顯白點或白斑，白點大小從肉眼幾乎不可見到直徑3mm不等，從病理組織學的研究可證明WSBV主要攻擊的部位是角質(zhì)狀表皮，在這些病灶組織中可發(fā)現(xiàn)許多細胞核脹大的細胞(Momoyama et al.，F(xiàn)ish Pathol.，29141-148，1994，Chou et al.，Dis.aquat.Org.，23165-173，1996；C.H.Wang et al.，1995)，因此對蝦類的白點癥可確知是由無包含體桿狀病毒所引起的，在前期研究中，本發(fā)明人以從草蝦中分離的WSBV為起始材料以開發(fā)一種檢測蝦中WSBV的診斷工具。
為發(fā)展檢測蝦體是否受WSBV及相關(guān)病毒體感染的準確診斷法，本實驗室由受WSBV嚴重感染的草蝦組織中純化出病毒粒子，并由純化的病毒粒子提取基因組DNA，其中包括用蛋白酶K及十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)處理病毒粒子、苯酚-氯仿萃取、酒精沉淀等步驟。所純化的病毒DNA以蝦類DNA專一性引物對進行PCR定性檢測，以確定其中無蝦DNA的污染，并以此病毒DNA建立WSBV基因組文庫且由克隆的DNA片段的序列設(shè)計出一套專一性引物。
以此套專一性引物對含有WSBV DNA的樣品進行PCR反應，結(jié)果正如預期的出現(xiàn)一約1447bp的DNA片段，而健康蝦的DNA樣品則不出現(xiàn)此片段，所以肯定了此套引物對于WSBV DNA的專一性。由于患白點癥之不同蝦種，均能以此套WSBV專一性引物以PCR反應檢測出，因此可證明不同蝦種白點癥的病原是很相近的。至于其他生物，如橈足類、蟹類及昆蟲等以此套引物進行PCR反應均出現(xiàn)正反應。本發(fā)明結(jié)果提供了節(jié)檢蝦體是否受WSBV感染的有效檢測工具，這對于防止此病毒性疾病的擴散是相當重要的。材料與方法
蝦類來源
作為感染試驗的健康斑節(jié)蝦取自于臺灣南部一不曾出現(xiàn)病毒性疾病的斑節(jié)蝦繁殖場。所有斑節(jié)蝦均飼養(yǎng)于水族箱，水溫25-28℃，充分曝氣并每日二次喂食人工飼料?；疾〉陌吖?jié)蝦得自于臺灣北部的養(yǎng)殖場，而患病垂死的草蝦(平均重量30g/每尾)則于1994年11月收集自臺灣南部的養(yǎng)殖場。所有樣品均以解剖、光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察，以確定此病癥，所使用的方法詳述如下
光學顯微鏡觀察
正常蝦及具有白點的斑節(jié)蝦先以Davison’s固定液浸泡(Bell&Lighter 1988)，固定48小時后，將樣品轉(zhuǎn)移至50％酒精中，然后進行脫水、包埋、切片等過程制成5μm石蠟切片，并以Hemtaoxylinand Eosin(H&E)染色。
透射電子顯微鏡觀察
取自然或人工感染斑節(jié)蝦頭胸甲下方、鰓部上方的表皮組織，立即以2.5％戊二醛(于0.1M冷磷酸緩沖液中，pH7.4，PBS)于4℃浸泡2小時，之后用冷PBS清洗數(shù)次，再用1％四氧化鋨4℃固定3小時，接著進行脫水過程并以Spurr’s樹脂包埋。使用Richert-jung Ultracut E Ultrome進行超薄切片，續(xù)以乙酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色，觀察時則使用HITACHI H-600透射電子顯微鏡。
感染試驗
負染法觀察病毒粒子
取病草蝦表皮組織與海水在4℃下勻漿(組織∶海水＝1∶9)，之后以8510×g離心5分鐘(Sigma 2K15 rotor 12141)，上清液用0.45μm濾膜過濾，濾液再14549×g離心1小時，(Sigma 2K15rotor 12139)，得到的沉淀物用滅菌海水懸浮，作為負染之用。負染時取1滴懸浮液加上4滴0.1％牛血清白蛋白和2％磷鎢酸(1∶2；pH7.0)混合液，將此混合物置于300目載網(wǎng)上，30-60分鐘后以濾紙吸去多余液體待其干燥后進行電鏡觀察，所使用的透射電子顯微鏡為HITACHI H-600透射電子顯微鏡。
細胞病理分析
先將EPC(epithlioma papulosum cyprini)，CHSE-214(chinooksalmon embryow)，F(xiàn)HM(fathead minnow)，SSE-5(sockeye salmonembryo)等細胞接種于24孔的微滴定板上，病蝦表皮組織過濾液則以5倍連續(xù)稀釋成1/20至1/12500等倍數(shù)，用稀釋的濾液直接與上述四種魚類細胞株共同培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃，共培養(yǎng)觀察4星期。
感染試驗使用病蝦表皮組織濾液用海水稀釋500-750倍后以浸泡方式進行，蝦體為活的或冰凍過的自然感染的病斑節(jié)蝦和草蝦。實驗時將35尾斑節(jié)蝦浸泡于稀釋濾液中2小時(所使用的蝦年齡為一個月，平均體重0.08g)，對照組則浸泡于健康草蝦表皮組織濾液或Grace昆蟲培養(yǎng)液中。浸泡感染后的斑節(jié)蝦飼養(yǎng)于玻璃水族箱中，水溫25-28℃，鹽度維持25-30ppt，并充分打氣。每日觀察并計算死亡率，同時收集垂死蝦體以透射電子顯微鏡觀察研究。
WSBV的純化、基因組構(gòu)造及分類地位
由草蝦分離純化WSSV病毒粒子的方法如下，蝦體先用冰的一倍TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.6)潤濕體表，由一到五只活蝦或冰凍蝦體取下的外骨骼及其下表皮，加入20毫升冰的萃取緩沖液(20mM HEPES，0.4N NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，2.5mM苯甲基磺酰氟、1μg/ml亮抑酶肽、1.6μg/ml抑胃酶肽，2μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml苯丁抑制素)進行萃取，接著使用重量百分比35％到65％梯度濃度的遮糖溶液，進行74，700xg(Hitachi SRP 285 rotor 24,000rpm)超高速離心一小時。將梯度中段肉眼可見的病毒層移出，并在4℃下以74,700xg離心30分鐘，沉淀物用冰的一倍TE緩沖液洗兩次，視沉淀物的大小以300到500毫升不等的冰的一倍TE緩沖液重新溶解，并且立刻進行病毒DNA的提取，另取一小部分純化的病毒懸浮液用2％磷鎢酸(PTA)(pH＝7)進行負染，用做病毒粒子超微結(jié)構(gòu)的研究。
從蔗糖梯度濃度純化出的病毒粒子，進行病毒基因組DNA的提取，使用蛋白酶K及N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化銨(CTAB)處理后用苯酚-氯仿萃取及酒精沉淀(Wilson(1994)，Preparation ofgenomic DNA from bacteria.Miniprep of bacterial genomicDNA.in Ausubel，F(xiàn).M.et al(.(eds.)Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1.Greene Pub.Assoc.and Wiley-Interscience，NY，p.2.4.1-2.4.5)。
利用限制性內(nèi)切酶酶切分析，估算病毒基因組的大小。病毒DNA利用限制性內(nèi)切酶HindIII，SalI及XhoI(Boehringer MannheimCompany)酶切之后，酶切片段在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，其中緩沖液為含0.5μg/ml溴化乙錠的Tris-乙酸緩沖液(0.04MTris乙酸鹽，0.1mM EDTA，pH8.0)，并同時使用1kb的DNA梯及HindIII片段二種標記物(Life Technlolgies，Inc.)做為估算DNA大小的參考標準。
有效診診斷工具的開發(fā)
為了開發(fā)有效的診斷工具，以從病毒粒子中提取的“超純”WSBV基因組DNA為材料，構(gòu)建WSBV基因組文庫，并且使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增選定的DNA片段，此方法是證明病原存在與否的非常有利的診斷工具。(Erlich et al.，Nature 331461-462，1988；Oste，C.，Biotechniques 6162-167，1988)。依據(jù)克隆的WSBV DNA片段序列，設(shè)計了一組專一于WSBV的PCR引物對。
I.WSBV基因組文庫的構(gòu)建
A.病毒純化及病毒DNA的提取
利用與分類研究同一批的冰凍感染病毒草蝦做為純化病毒的材料，這株WSBV病毒依據(jù)Franki等人(Arch.Virol.，21-450，1991)的標準命名為PmNOBIII(the third non-occluded baculovirusreported from P.monodom)。純化病毒的方法如前文所述。病毒基因組的提取是將純化的病毒粒子用蛋白酶K及N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化銨(CTAB)處理，并用苯酚-氯仿萃取及酒精沉淀(Wilson(1994)，supra)。簡單說明如下，梯度純化出的病毒粒子，在含有100mM KCl，1％SLS(N-十二烷基肌氨酸)及0.2mg/ml蛋白酶K的TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.6)中置于65℃下溫育三小時。之后加入5M NaCl使DNA溶液中NaCl的濃度達到0.7M，再緩慢加入十分之一體積的CTAB/NaCl(10％CTAB于0.7M NaCl中)，充分混勻后置于65℃溫育十分鐘。
經(jīng)二次等體積的氯仿/異戊醇提取之后，再進行二次等體積的苯酚/氯仿/異戊醇萃取，DNA以二倍體積的100％乙醇進行沉淀，之后以冰的70％乙醇清洗。干燥的DNA沉淀溶于適量的0.1倍TE緩沖液中，65℃下水浴30分鐘，然后保存于4℃直到使用。
B.蝦DNA的制備，以供做PCR反應的對照組
為了監(jiān)測WSBV基因組DNA純化的過程中是否遭受蝦DNA的污染，因此設(shè)計一組專一于蝦基因組DNA的PCR引物對。為了這個目的，搜尋電腦資料檔案(GenBank，National Iustitute of Health，MD，U.S.A)中已發(fā)表的十足類基因序列(Kim & AbeleJ.Crust.Biol.10，1-13，1990)，以PC/GENE程序(Intelligenetics，Inc.)進行序列對比分析，在18S rRNA序列中高度保守的區(qū)域設(shè)計二個引物，143F正向引物(5’-TGC CTT ATC AGC TNT CGATTG TAG-3’，N表示G、A、T或C)及145R反向引物(5’-TTC AGN TTT GCA ACC ATA CTT CCC-3’)。通過二者配對以供PCR反應的進行，蝦DNA如預期產(chǎn)生了長848bp的PCR產(chǎn)物，相對于P.aztecus 18S rRNA的核苷酸序列中第352到第1200位核苷酸。
以健康草蝦及斑節(jié)蝦肌肉提取的基因組DNA為PCR反應的正對照。提取去蛋白質(zhì)的蝦基因組DNA的方法，是依照提取哺乳動物組織的基因組DNA的方式進行(Strauss，WM(1994)，Preparation ofgenomic DNA from Mammalian tissue.In Ausubel，F(xiàn)M，BrentR，Kingston RE，Moore DD，Seidman JG.Smith JA，Struhl K(ED.s)Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1.GreenePublishing Associates Inc.and John Wiley and Sons，Inc.，New York，p.2.2.1-2.2.3)。簡單說明如下，從蝦腹部切下重約200毫克的肌肉組織后，置入液氮中急速冷凍并磨碎成粉末狀，處理過的組織加入2.4毫升消化緩沖液(100mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH8，25mM EDTA，pH8，0.05％十二烷基硫酸鈉，0.1mg/ml蛋白酶K)并置于65℃水浴12到18小時。消化之后利用苯酚/氯仿/異戊醇萃取以去除蛋白質(zhì)，并以酒精沉淀DNA，DNA干燥后用0.1倍TE緩沖液重新溶解，置于65℃水浴30分鐘，然后保存在4℃下直到PCR反應時使用。
C.構(gòu)建WSBV基因組文庫
如下構(gòu)建兩個WSBV基因組文庫
PmNOBIII(pms)及PmNOBIII HindIII(pmh)無蝦體DNA污染的WSBV基因組DNA，用SalI或HindIII限制酶(BRL，LifeTechnologies Inc.)在37℃下作用3小時，以得到DNA片段，利用T4連接酶將這些DNA片段與已被SalI或HindIII酶切的pUC19質(zhì)粒載體進行連接反應，16℃下反應過夜。得到的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH 5α感受態(tài)細胞，并涂布在氨芐青霉素/異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷(X-gal)瓊脂培養(yǎng)基上。以小量制備法篩選抗氨芐青霉素的白色轉(zhuǎn)化子，以確定是否得到適當?shù)闹亟M質(zhì)粒，之后用雙鏈DNA模板、測序試劑盒(United States Biochemical Corp.)及M13/pUC測序引物(GIBCO BRL Life Technologies)測定插入的DNA片段的兩條鏈的序列，并接著設(shè)計序列內(nèi)具有專一性的引物。從轉(zhuǎn)化子中分離出重組質(zhì)粒，利用SalI或HindIII酶切篩選插入片段的在與否。插入片段的大小列于表1。
II.利用由純的WSBV病毒粒子提取的DNA擴增WSBV DNA片段
寡核苷酸引物(146F及146R)用于擴增WSBV DNA片段。引物146F及146R的設(shè)計是依據(jù)一段來自于重組質(zhì)粒pms146的克隆的WSBV 1461bp SalI DNA片段的序列，在這段DNA片段中設(shè)計了11個引物，如圖15D所示。146R1及146F1引物對的序列如下146R1，5’-TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A-3′；146F1，5’-ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG-3’，利用這對引物，預期可從WSBV基因組DNA中擴增出一段1447個堿基對的DNA片段。而內(nèi)部的引物對146R2 5’-TAC GGC AGCTGC TGC ACC TTG T-3’及146F2 5’-GTA ACT GCCCCT TCC ATC TCC-3’則用于確定擴增片段的確來自WSBV 941bp的SalIDNA片段。
PCR反應中用來測定引物專一性的DNA模板是用從純的WSBV病毒粒子及健康蝦肉中提取的去蛋白的DNA樣品。
III.由自然感染及人工感染W(wǎng)SBV的蝦體中提取的DNA進行WSBV DNA片段的擴增反應
病蝦包括自然感染及人工感染W(wǎng)SBV的蝦體。人工感染是指健康蝦(平均體重0.5克)利用前述的方法感染W(wǎng)SBV，感染五天后取三只人工感染的蝦及三只健康蝦提取其DNA，并用專一于WSBV的引物對(146F1及146R1)與專一于蝦DNA的引物對(143F及145R)進行PCR檢測反應。
IV.PCR擴增反應及產(chǎn)物分析
進行擴增反應的去蛋白DNA樣品用量約0.1-0.3μg，最后的反應混合物體積為100μl，其中包含10mM Tris-HCI，25℃時pH9，50mM KCl，1.5mM MgCl攬2攭，0.1％Triton X-100，每種dNTP200μM，每種引物100pmol及2.5單位的TaqDNA聚合酶(Promega)。擴增反應由AG-9600 Thermal Station(BiotronicsCorp.)完成，其反應程序為94℃4分鐘，55℃1分鐘及72℃3分鐘一個循環(huán)，94℃1分鐘，55℃1分鐘及72℃3分鐘39個循環(huán)，共40個循環(huán)后再72℃5分鐘。每次PCR反應的對照組中均不加入DNA模板，有些PCR反應的對照組則在反應混合物中還加入提自健康蝦的DNA，PCR產(chǎn)物利用含有0.5μg/ml溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在UV光照射下可用肉眼辨認。
V.利用DIG標記的1447bp的PCR產(chǎn)物與提取自WSBV感染草蝦或健康草蝦的DNA進行斑點雜交反應
將從WSBV感染草蝦或健康草蝦提取的DNA利用96孔斑點印跡真空過濾裝置(Schleicher and Schuell Inc.)點在Hybond-N paper上，自然干燥后用1.5M NaCl及0.5N NaOH使DNA變性10分鐘，然后用1.5M NaCl及1M Tris pH7.4中和10分鐘。根據(jù)標準的分子克隆技術(shù)(Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T(1989，)Molecular cloningA Laboratory Manual，2nd.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)將這些印跡與DIG標記的1447bp的PCR產(chǎn)物進行雜交反應。首先在37℃下，這些斑點印跡置于預雜交液中(50％甲酰胺，5X SSC，1mM EDTA，50mM Tris(pH8)，5X Denhardt′s試劑(0.1％Ficoll-400，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA))進行預雜交反應12小時，然后將這些斑點印跡與DIG標記的探針進行斑點印跡雜交反應，37℃16小時。以1447bp的PCR產(chǎn)物為模板，利用隨機引物方法(BoehringerMannheim)制備探針，雜交反應之后，利用DIG發(fā)光檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)進行呈色反應，檢測斑點印跡上具有DIG標記的核苷酸。37℃下，這些斑點曝露在柯達底片XAR-5上30分鐘，以記錄發(fā)光訊號。
VI.利用DIG標記的1447bpPCR產(chǎn)物與病草蝦或病斑節(jié)蝦提取的WSBV DNA進行Southern雜交反應
進行Southern雜交反應以確定1447bp PCR產(chǎn)物在由感染白點癥的病草蝦或病斑節(jié)蝦純化而來的WSBV基因組DNA中的位置。為此目的，從病蝦分離而來的200ngWSBV基因組DNA用SalI限制酶酶切，并以0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳分離，凝膠經(jīng)過酸化(0.25NHCI)去嘌呤及堿處理(1.5M NaCl-0.5N NaOH)使DNA變性后，用1M Tris(pH7.4)及1.5M NaCl中和處理，之后將DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N尼龍膜上，轉(zhuǎn)移步驟利用抽真空轉(zhuǎn)移裝置進行60分鐘，轉(zhuǎn)移緩沖液是20X SSC(3M NaCl，1.5M檸檬酸鈉)(Sambrooket al.(1989)，supra)，Hybond-N膜與DIG標記的1447bp PCR產(chǎn)物進行雜交反應。
VII.檢測疫情流行區(qū)收集到的節(jié)肢動物感染W(wǎng)SBV的情況
從疫情流行區(qū)收集到的節(jié)肢動物提取其DNA做為DNA模板，利用146F1及146R1引物對進行PCR反應，檢測試驗生物體內(nèi)是否有WSBV的存在。
結(jié)果
A.組織病理研究
對蝦類白點癥的爆發(fā)不再只是局限于局部地區(qū)的問題，它已帶來整個亞洲養(yǎng)蝦工業(yè)的危機。為了更清楚地將這些致病病毒分類，并能發(fā)展快速的診斷方法，對于此病毒的物理化學特征，做更進一步的研究。
病草蝦的主要臨床癥狀是外骨骼出現(xiàn)白點(圖1)，尤其蝦殼剝下后的頭胸甲上的白點最為明顯，即使在輕微感染個體的頭胸甲亦可見。組織病理學的研究證明病蝦表皮是此病毒的攻擊部位，因為這類組織會出現(xiàn)核脹大并有內(nèi)含體的退化細胞(圖2)。
利用白點癥病蝦角質(zhì)層下的表皮做超薄切片，在電子顯微鏡下觀察，可見到壞死區(qū)域具有大量無包含體桿狀病毒顆粒，也很容易看見脹大的核中充滿病毒粒子(圖3)。這些病毒顆粒長約330±20nm，直徑為87±7nm(n＝30)，病毒顆粒中的電子致密中心是核衣殼，大小約220×70nm，自然感染及人工感染病蝦中的病毒粒子在外觀上沒有差異(圖4)。
B、負染色及濾液毒性測定的感染試驗
從病草蝦表皮制得的濾液沉淀的負染結(jié)果如圖5所示，病毒粒子可見桿狀外型，與自然界感染蝦體做超薄切片后所見的病毒粒子相似，沒有觀察到細菌的存在。
已試過的四株魚類細胞株中，沒有發(fā)現(xiàn)任何一株出現(xiàn)細胞致病反應(CPE)，用于浸泡接種的濾液對于細胞沒有毒性。
C、感染試驗
將健康蝦暴露于白點癥病斑節(jié)蝦及病草蝦外表皮濾液中。這些人工感染的蝦相似于自然界被感染的蝦(圖6)，并且在5到7天內(nèi)累積死亡率高達100％(圖7)，而對照組則無蝦死亡。
另外，WSBV接種對于試驗中最小的蝦(平均體重0.08克)具有高致病力，在五天內(nèi)所有這些蝦均死亡；然而在0.16克大小的蝦群中，雖然在十二天達到100％的累計死亡率，但是七天后只有35％的累計死亡率；而試驗中最大的蝦群(平均體重0.26克)則在二星期內(nèi)只有10％的死亡率。對照組均無死亡。
D、WSBV的純化、基因組結(jié)構(gòu)及分類地位
純化的病毒粒子呈紡錘形或兩端鈍圓的桿狀，負染制備下，病毒粒子最寬點為70-150nm，長為250-380nm，比超薄切片約大了10％。有些病毒粒子則可觀察到某一端延伸出尾狀凸出物(圖8)。無包膜的核衣殼通常直徑約58-67nm，長約330-350nm。衣殼部分呈平行橫紋(圖9)，因此衣殼看起來由相疊的亞基環(huán)組成，這些環(huán)的厚度(20nm)非常一致且垂直于衣殼的縱軸。就病毒外型來看，WSSV相近于SEMBV(Systemic Ectodermal and MesodermalBaculovirus)而不同于BMN(Baculoviral Mid-gut Gland NecrosisVirus)及PmSNPV(Penaeus monodoon Single Nucleocapsid NclearPolyhedrosis virus＝MBV)(Mari et al.，Dis aquat.Org.162-7-215，1993；Sano et al.，Dis.aquat.Org.2169，1995)。然而SEMBV感染的蝦體并未被報導具有如同WSSV感染呈現(xiàn)白點的主要臨床特征，因此目前為止很難推測WSSV及SEMBV間的相關(guān)性。
圖10是純化的WSBV病毒粒子中提取的一條DNA分子，圖11則是WSBV的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII、SalI及XhoI酶切后的圖譜，WSSV的基因組DNA用HindIII酶切割后，在瓊脂糖凝膠上電泳后可見到至少有22個片段，其大小分別約為19.4，16.9，14.9，12.5，10.0，9.6，8.4，8.0，7.3，6.1，5.5，4.8，4.3，3.9，3.6，3.3，3.0，2.5，2.0，1.6，1.4及1.1kbp。若尚有小于1kbp的片段則已走出凝膠無法辨識。估算WSBV的DNA長度大于150kbp，其位于昆蟲桿狀病毒基因組大小90-230kbp的范圍內(nèi)(Francki et al.Arch.Virol.，suppl.121-450，1991)。
依據(jù)形態(tài)特征及基因組結(jié)構(gòu)，將白點癥病毒分類于桿狀病毒科(Baculoviridae)，裸桿狀病毒亞科(Nudibaculovirinae)的無包含體桿狀病毒屬(NOB)(Francki et al.(1991)，supra)，且由于其為記錄中草蝦體內(nèi)第三種無包含體狀病毒，而命名為PmBOBIII(the thirdnon-occluded baculovirus repeoted for p.monodon)(D.V.Lightner，Boca Raton，p.393-486，1993；Wongteerasupaya et al.，1995，supra)。本發(fā)明的病毒分離物PmNOBIII根據(jù)布達佩斯條約已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日為1996年1月11日，保藏號為CCTCC-V96001。我們也建議可用WSBV(Baculovirus associated withwhite-spot syndrome)表示與PmNOBIII相關(guān)的病原。
E、有效診斷WSBV感染的工具的開發(fā)
I、WSBV基因組文庫的構(gòu)建
a)病毒純化及病毒DNA的提取
經(jīng)過蔗糖梯度離心濃縮及純化之后，可見到典型桿狀的WSBV病毒粒子，這些病毒粒子可用以提取病毒DNA。
利用PCR反應及專一于18srRNA的引物對擴增蝦DNA，的確可見到如預期中的848的bp的片段(圖12)。如此提供了一個簡單且靈敏度高的方法檢測少量蝦DNA的存在，因此在構(gòu)建WSBV基因組文庫的過程中，利用此法可以監(jiān)測WSBV基因組DNA制備的過程中蝦DNA污染的情況。圖13中PCR反應的分析可見大部分WSBV基因組DNA制備物中均有宿主DNA的污染，然而少量從純化病毒提出的WSBV基因組DNA樣本的沒有宿主DNA的污染，例如圖13中泳道3。
b)基因組文庫的構(gòu)建
利用SalI或HindIII限制性內(nèi)切酶(BRL，Life Technologies Inc.)及pUC19質(zhì)粒載體構(gòu)建二個基因組文庫，PmNOBIIISaI(pms)及PmNOBIIIHindIII(pmh)。
例如，取5μlSalI酶切后的WSBV DNA，以含有溴乙錠的0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，確定WSBV基因組DNA已被SalI酶切完全后(圖14)，取20μl同一批酶切的DNA片段進行基因文庫的構(gòu)建。
用SalI或HindIII酶切篩選轉(zhuǎn)化子中分離出的重組質(zhì)粒，其中pms基因文庫的592個克隆(pms1-pms592)，pmh基因文庫的410個克隆(pmh1-pmh245及pmh419-pmh584)通過SalI或HindIII酶切篩選插入片段的存在，插入片段的大小從15kbp到小于100bp不等，如表1。這些基因文庫提供了大量WSBV DNA的材料，以供病毒分子生物學更進一步的研究，并且開發(fā)核酸及免疫診斷試劑盒。
II、擴增從純化病毒粒子提取的去蛋白WSBV DNA片段
依據(jù)WSBV SalIDNA片段的基因序列(未顯示資料)，設(shè)計了幾對引物對，并通過PCR反應評價這些引物證明WSBV存在于感染組織的能力。
圖15A顯示出質(zhì)粒pms146中克隆的SalI-1461bpDNA片段。圖15B則表示用做PCR擴增反應的引物對在SalI1461-bpDNA片段中的位置。146F1及146R1引導擴增反應產(chǎn)生1447bpDNA片段，而146F2及146R2則引導擴增出941bpDNA片段，圖中亦標明SalI1461bpDNA片段中兩個EcoRI位點的位置。圖15C顯示SalI 1461bpDNA片段的詳細核苷酸序列，其中還標出了二套引物對(146F1/146R1及146F2/146R2)及兩個EcoRI位點的位置。圖15D顯示自SalI1461bpDNA開發(fā)的11個引物對的核苷酸序列，其中146F1/146R1引物對對于WSBV DNA的擴增反應一直是有效且穩(wěn)定的，而對蝦DNA則無反應，因此之后的研究工作選用這對引物進行。
圖16示出用純化的WSBV基因組DNA做為模板，用專一于WSBV DNA或蝦DNA的引物進行PCR擴增的結(jié)果，其中泳道2、5和8表示利用專一于WSBV DNA的引物對146F1/146R1及三種獨立制備的WSBV DNA進行擴增反應的結(jié)果，結(jié)果顯示這幾個泳道中1447bpPCR產(chǎn)物很亮，證明這三個試驗樣品中都含有相對大量的WSBV基因組DNA，而由于圖16中第6泳道沒有可檢測到的蝦DNA的PCR產(chǎn)物，可以證明至少有一個WSBV DNA的樣品是沒有蝦DNA污染的。在反應混合物中同時使用專一于WSBV DNA的引物對146F1/146R1及專一于蝦DNA的引物對143F/145R以證明DNA模板中WSBV DNA所占的大約比例。
圖16中資料證明，在三種獨立制備的WSBV DNA樣品中可檢測到WSBV特異性DNA片段均是主要的DNA帶(泳道4、7和10)，然而三個樣品中有二個WSBV DNA的樣品(泳道4和10)可以檢測到蝦DNA的存在，因此DNA模板中含有不同比例蝦DNA及WSBVDNA。還可很清楚地看到雖然有蝦DNA的污染，但經(jīng)過蔗糖梯度離心后純化的WSBV病毒粒子提取的DNA大部分仍是WSBV DNA。同時PCR反應混合物中使用臨床上健康蝦組織提取的核酸及專一于WSBV DNA的引物對146F1/146R1，擴增反應結(jié)果都是負的。(圖16，泳道11)，因此證明這套引物對的專一性。
III.以自然感染及人工感染W(wǎng)SBV病毒的蝦組織提取的DNA進行WSBV DNA片段的擴增反應。
圖17顯示利用pms146質(zhì)粒DNA和從自然感染W(wǎng)SBV的草蝦或斑節(jié)蝦組織提取的DNA做為DNA模板進行擴增反應的結(jié)果，這些DNA模板利用專一于WSBV的引物對146F1/146R1或?qū)Ｒ挥谖rDNA的引物對143F/145R進行擴增反應。從純的pms146質(zhì)粒DNA擴增出的DNA與1447bpPCR產(chǎn)物共遷移，證明WSBV DNA存在于每一個自然感染的蝦提取的核酸中，如圖17泳道2、5和8所示。
10μl的上述PCR產(chǎn)物利用內(nèi)部引物對146F2/146R2可以再擴增產(chǎn)生預期為941bp的PCR產(chǎn)物(圖17泳道3、6和9)，結(jié)果證明擴增產(chǎn)物與模板間的一致性。利用專一于蝦DNA的引物對143F/145R可以非常有效地擴增蝦DNA，如圖17泳道7和10。圖17中泳道5-10的結(jié)果顯示利用專一于WSBV DNA的引物對146F1/146R1及146F2/146R2即使有很大部分的蝦DNA存在，也可以有效地檢測WSBV DNA的存在。
圖18示出PCR反應的擴增結(jié)果，此反應利用從人工感染W(wǎng)SBV的草蝦組織中提取出的DNA做為DNA模板，并用146F1/146R1做為引物，所有人工感染的蝦體均擴增出如預期的1447bp的PCR產(chǎn)物。而對照組的健康蝦進行的擴增反應則無1447bp的PCR產(chǎn)物存在。
IV.DIG標記的1447bpPCR產(chǎn)物與提取自WSBV感染的草蝦或健康草蝦的DNA的斑點印跡雜交反應
斑點印跡雜交反應的結(jié)果證明，所述的PCR產(chǎn)物與WSBV感染蝦提取出的DNA能雜交，但不與健康蝦提取出的DNA雜交(圖19)，此結(jié)果證明1447bpPCR產(chǎn)物的專一性。
V.DIG標記的1447bp PCR產(chǎn)物與提取自病草蝦或病斑節(jié)蝦的WSBVDNA的Southern雜交。
為了確定1447bpPCR產(chǎn)物在WSBV基因組DNA中的位置，用DIG標記的1447bpPCR產(chǎn)物為探針，與WSBV基因組SalI DNA片段進行Soutbern雜交反應，結(jié)果證明1447bpPCR產(chǎn)物專一地與WSBV基因組DNA中1461bp長的SalI片段雜交(圖20)。從草蝦或斑節(jié)蝦分別制備的WSBV基因組DNA中的1461bpSalI片段均與探針產(chǎn)生正反應。
VI.檢測疫情流行區(qū)收集到節(jié)肢動物感染W(wǎng)SBV的情況
在試驗的生物體中，草蝦、斑節(jié)蝦、螃蟹、橈足類及昆蟲(Ephydridaefamily)均呈現(xiàn)WSBV正反應(圖21)。
計論
病蝦的頭胸甲、附肢及體表內(nèi)側(cè)均會出現(xiàn)明顯白點，并出現(xiàn)活力降低、肝胰腺變紅的情況。導致疾病爆發(fā)的可能原因有包括弧菌感染、病毒感染、環(huán)境管理不良及營良不均衡等多種推測出現(xiàn)。然而依據(jù)電子顯徽鏡下的觀察，一種桿狀病毒被認為是主要的病原。具有白點的病斑節(jié)蝦及病草蝦體內(nèi)分離出的致病病毒，在目前研究中首先研究其致病力。自然感染及人工感染的蝦體中可以見到相似的白點病征及相近的病毒形態(tài)，由此可以證明這種病毒的確是導致疾病爆發(fā)的病原。這種病毒具有高致病力并持續(xù)對蝦類造成威脅，健康蝦喂食病蝦的實驗中，推測病毒可以經(jīng)口傳染以及經(jīng)水傳染。
除了WSBV外，根據(jù)報導有一群不同的桿狀病毒可以感染甲殼綱十足類，首先出現(xiàn)在Couch的報導中(Nature，247(5438)229-231，1974；J.Inverteba.Pathol.，24311-311，1974)，并且有些病毒對發(fā)病生物有很高的致死率(Lightner & Redman，J.Inverteba.Pathol.，38299-302，1981；Sona et al.，F(xiàn)ish Pathol.，15185-191；Lester et al.，Dis aquat.Org.，3217-219，1987；Johnson P.T.，Dis aquat.Org.，5111-122，1988；Johnson&Lightner，Dis aquat.Org.，5123-141，1988；Bruce et al.，J.Virol.methods，34245-254，1991；Chang et al.，F(xiàn)ish Pathol.，27(3)127-130，1992；Chang et al.，J.Invertebr.Pathol.，62116-120，1993；Mari et al.，Dis.aquat.Org.16207-215，1993；Wongteerasupaya et al.，Dis.aquat.Org.2169-77，1995)。這些病素在外型上十分相近，大部分的研究者都同意在病毒因組結(jié)構(gòu)方面應該有更多的參考資料，以供確定甲殼類桿狀病毒的分類地位。利用分子生物學技術(shù)開發(fā)快速且可信度高的診斷方法，將在病毒之間認定及比較方面非常有用，并且可用以篩選蝦苗及種蝦是否為帶原者。有鑒于這些原因，目前的研究者重于分析WSBV基因組的結(jié)構(gòu)及發(fā)展有效且靈敏的診斷方法。
實驗中，專一于蝦DNA的引物對用于幾項分析，在目前研究中使用專一于蝦DNA的引物對有以下幾項目的(i)分析WSBV基因組制備的純度，(ii)評價用于提供足以擴增的DNA模板的核酸提取方法，(iii)估算從感染組織提出的所有核酸制備的DNA模板中蝦DNA及WSBV DNA所占的比例。我們嘗試從不同組識中純化WBSV病毒粒子，這些組識包括表皮、肌肉及鰓，利用專一于蝦DNA的引物對分析，我們從這些病毒粒子中可以得到不同純度的WSBV DNA，這些分析的例子如圖13及圖16所示。從肌肉提得的核酸中含有大量的WSBV DNA，但被蝦DNA污染也很嚴重(圖16，泳道9)，從感染嚴重的外骨骼底下的表皮純化出的病毒粒子則是很好的起始材料，用以提取“非常純”的WSBV基因組DNA(圖16，泳道2和5)，利用專一于蝦DNA的引物對及PCR反應，是第一個可以分析蝦病毒基因組DNA制備中蝦DNA污染與否的工具。
利用專一于WSBV DNA的引物對，所有純化出的WSBV基因組DNA樣品都可產(chǎn)生如預期中1447bp的DNA片段的擴增產(chǎn)物，從自然界有白點的病蝦及用WSBV人工感染的病蝦組織中提得的核酸，亦可得到同樣大小的PCR產(chǎn)物，但從臨床上健康的蝦體提得的核酸則無正反應的結(jié)果，這些結(jié)果證明目前研究設(shè)計的這些專一于WSBV DNA的引物對其專一性非常高。另外，1447bpPCR產(chǎn)物可制備專一于WBSV核酸的探針，利用斑點印跡雜交法檢測蝦中WBSV的感染情況，如圖19。實際上，目前的研究提供了三種足以篩檢對蝦感染W(wǎng)SBV與否的有效檢測方法，如圖17、19、20。
利用PCR(圖17)及Southern雜交(圖20)，我們證明導致不同蝦體產(chǎn)生白點癥的病原實際上十分相近，篩檢WSBV感染的蝦需要立刻進行，以避免這種病毒疾病進一步擴散。另一方面，目前研究中開發(fā)的PCR診斷WSBV的方法，提供了有效的工具用于比較蝦無包含體桿狀病毒間的關(guān)系，如日本的PV-PJ(Inouye et al(1994)，supra)、中國大陸的HHNBV(Cai etal.，J.Fish.China，19112-117，1995)、泰國的SENBV(Wongteerasupaya et al.(1995)，supra)、目前分離出的PmNOBIII及其他甲殼類的無包含體桿狀病毒。
根據(jù)上述描述，在不背離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍內(nèi)可以作出各種改動和變化是顯而易見的。因此應理解的是本發(fā)明可以以不同于已具體描述的方式進行實施。
表1 PmNOBIII SalI(pms)和PmNOBIII HindIII(pmh)基因文庫的克隆中
的插入片段的大小(kb)
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
序列表
(1)一般信息
(i)申請人郭光雄
王重雄
羅竹芳
(ii)發(fā)明名稱白點癥桿狀病毒的鑒定、純化及檢測
(iii)序列數(shù)13
(iv)通訊地址
(A)收信人
(B)街道
(C)城市
(D)州
(E)國家
(v)計算機可讀形式
(A)媒介類型3.5寸軟盤，1.44M內(nèi)存
(B)計算機IBM PC、386兼容機
(C)操作系統(tǒng)MS-DOS 50
(D)軟件PE2
(vi)本申請資料
(A)申請?zhí)?br> (B)申請日
(C)分類
(vii)在先申請資料
(A)申請?zhí)?br> (B)申請日
(viii)代理人信息
(A)姓名
(B)注冊號
(C)編號/文檔號
(ix)通訊信息
(A)電話
(B)傳真
(C)電傳
(2)SEQ ID NO1信息
(i)序列特征
(A)長度1461bp
(B)類型核酸
(C)鏈性雙鏈(只示出一條鏈)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型基因組DNA
(vi)最初來源
(A)生物體WS BV(白點癥桿狀病毒)
(B)病毒株P(guān)mNOBIII
(vii)現(xiàn)來源
(A)文庫
(B)克隆
(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞
(B)位置
(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞
(B)位置
(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞
(B)位置
(xi)序列描述SEQ ID NO1GTCGACAGAC TACTAACTTC AGCCTATCTA GTAAAACAAG CTAAAAGATT CGACGGAGTT 60GACCCAGCCT TCCCTGCCGC CCTCACCTGC GCTTCTCACC TCATGCTTTC TTCCATGGAT 120TCCCATACAA AGTCATCTTT CATGGACAAC ATCAAATTGC ACATGACTGA TACTCAATGC 180TTCTTCAAGA ACATTGAACG ATTTGAGAAA TTCTTGGGAA GATATGGGGA CGAATACGCC 240ATGTCCCACA AGCAAAATTG TAACTGCCCC TTCCATCTCC ACCACACTTT TACTCCCTCA 300GATAACGAGC ATCTGGTATC CTCTTTCGCA TTCGCCCGCC CAGAAGTCTC CATGGAAGAA 360ATTAGAGCCA CACCCTATCA GGCCAACAAG CTTATTAGTG ACAAACATTA CGTGATGAAC 420ATGTCCAAGA TCGATTCTAG AGTAACAGGA TCTTCCCTCC TTAAGAAGGT TAGCGAATGG 480ACTGAAATGA GAATGAACTC CAACTTTAAT GGAACATTTG AACCATCAAG ACTCGCCCTC 540TCCAACTCTG GCATGACAAC GGCAGGAGTC AACCTCGACG TTATTGTCAA ACCAAATAAT 600GCAAGAAGTG TACTAGGAAT ATTGGAATGT CATCGCCAGC ACGTGTGCAC CGCCGACGCC 660AAGGGAACTG TCGCTTCAGC CATGCCAGCC GTCTTCCAGG CAACCGATGG AAACGGTAAC 720GAATCTGAAC TGATCCAGAA TGCTCTGCCA AGGAACAGAT ACATCCAAAA GAGCACAATG 780AACGCTCAAA CTGTCGTGTT TGCTAATGTT TTGGAACAAC TTATCGCCGA TCTTGGAAAG 840GTTATCGTGA ACGAACTGGC CGGCACCATC GCTGAATCTG TACCAGAAAG CGTATATGAA 900AACACCAAGG AAATGATTGA TAGACTAGGC TCTGACGACC TCTTCAAATC TAATAATAAT 960GGAGGAGTAG AATCAATGGA TTATGAAGAT AGCGAAACAA CATCCAACAA TGGTCCCGTC1020CTCATCTCAG AAGCCATGAA GAATGCCGTC TATCACACAC TAATTTCCGG CAAGGCAGCT1080CGCCCGGAAA ATGTACCATT CGCCTCATGC GCCAGCGGCC CTCTCGCCTT TGATTTCCTT1140CTGTCAAAGG GAGATACATT CGAAGAAAAG AACGCCGAAC AAGGTGCAGC AGCTGCCGTA1200TCCTCTACCT ATTCTTCCTC TTCTAACACT ACTCTTCGTA AGCATTTGGC TCGAGTTTTC1260GAAGCCATCT CTAAGCAAGT AACTGATGCT GAATTCAAGG ATATCCTCAA CGATATCGAA1320CGTAATATTT CTTCTGACTA TACTAACTGT CCACCAAATA CTAACCAAAA TGCCTTTGCT1380CTAGCTATCA AGAGAGAATT CAGCAGAATT GTTTCCTTCT TAACCATTCT TCGTAAGAAC1440ATTACACCCG CATTAGTCGA C
(2)SEQ ID NO2信息
(i)序列特征
(A)長度1447bp
(B)類型核酸
(C)鏈性雙鏈(只示出一條鏈)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型基因組DNA
(vi)最初來源
(A)生物體WSBV(白點癥桿狀病毒)
(B)病毒株P(guān)mNOBIII
(vii)現(xiàn)來源
(A)文庫
(B)克隆
(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞
(B)位置
(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞
(B)位置
(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞
(B)位置
(xi)序列描述SEQ ID NO2ACTACTAACT TCAGCCTATC TAGTAAAACA AGCTAAAAGA TTCGACGGAG TTGACCCAGC 60CTTCCCTGCC GCCCTCACCT GCGCTTCTCA CCTCATGCTT TCTTCCATGG ATTCCCATAC 120AAAGTCATCT TTCATGGACA ACATCAAATT GCACATGACT GATACTCAAT GCTTCTTCAA 180GAACATTGAA CGATTTGAGA AATTCTTGGG AAGATATGGG GACGAATACG CCATGTCCCA 240CAAGCAAAAT TGTAACTGCC CCTTCCATCT CCACCACACT TTTACTCCCT CAGATAACGA 300GCATCTGGTA TCCTCTTTCG CATTCGCCCG CCCAGAAGTC TCCATGGAAG AAATTAGAGC 360CACACCCTAT CAGGCCAACA AGCTTATTAG TGACAAACAT TACGTGATGA ACATGTCCAA 420GATCGATTCT AGAGTAACAG GATCTTCCCT CCTTAAGAAG GTTAGCGAAT GGACTGAAAT 480GAGAATGAAC TCCAACTTTA ATGGAACATT TGAACCATCA AGACTCGCCC TCTCCAACTC 540TGGCATGACA ACGGCAGGAG TCAACCTCGA CGTTATTGTC AAACCAAATA ATGCAAGAAG 600TGTACTAGGA ATATTGGAAT GTCATCGCCA GCACGTGTGC ACCGCCGACG CCAAGGGAAC 660TGTCGCTTCA GCCATGCCAG CCGTCTTCCA GGCAACCGAT GGAAACGGTA ACGAATCTGA 720ACTGATCCAG AATGCTCTGC CAAGGAACAG ATACATCCAA AAGAGCACAA TGAACGCTCA 780AACTGTCGTG TTTGCTAATG TTTTGGAACA ACTTATCGCC GATCTTGGAA AGGTTATCGT 840GAACGAACTG GCCGGCACCA TCGCTGAATC TGTACCAGAA AGCGTATATG AAAACACCAA 900GGAAATGATT GATAGACTAG GCTCTGACGA CCTCTTCAAA TCTAATAATA ATGGAGGAGT 960AGAATCAATG GATTATGAAG ATAGCGAAAC AACATCCAAC AATGGTCCCG TCCTCATCTC1020AGAAGCCATG AAGAATGCCG TCTATCACAC ACTAATTTCC GGCAAGGCAG CTCGCCCGGA1080AAATGTACCA TTCGCCTCAT GCGCCAGCGG CCCTCTCGCC TTTGATTTCC TTCTGTCAAA1140GGGAGATACA TTCGAAGAAA AGAACGCCGA ACAAGGTGCA GCAGCTGCCG TATCCTCTAC1200CTATTCTTCC TCTTCTAACA CTACTCTTCG TAAGCATTTG GCTCGAGTTT TCGAAGCCAT1260CTCTAAGCAA GTAACTGATG CTGAATTCAA GGATATCCTC AACGATATCG AACGTAATAT1320TTCTTCTGAC TATACTAACT GTCCACCAAA TACTAACCAA AATGCCTTTG CTCTAGCTAT1380CAAGAGAGAA TTCAGCAGAA TTGTTTCCTT CTTAACCATT CTTCGTAAGA ACATTACACC1440CGCATTA
(2)SEQ ID NO3信息
(i)序列特征
(A)長度23bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO3
ACTACTAACT TCAGCCTATC TAG
(2)SEQ ID NO4信息
(i)序列特征
(A)長度25bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO4
TAATGCGGGT GTAATGTTCT TACGA
(2)SEQ ID NO5信息
(i)序列特征
(A)長度22bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO5
GTAACTGCCC CTTCCATCTC CA
(2)SEQ ID NO6信息
(i)序列特征
(A)長度22bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO6
TACGGCAGCT GCTGCACCTT GT
(2)SEQ ID NO7信息
(i)序列特征
(A)長度21bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO7
TGGGAAGATA TGGGGACGAA T
(2)SEQ ID NO8信息
(i)序列特征
(A)長度23bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO8
CGAAGAGTAG TGTTAGAAGA GGA
(2)SEQ ID NO9信息
(i)序列特征
(A)長度21bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO9
AGAAGGTTAG CGAATGGACT G
(2)SEQ ID NO10信息
(i)序列特征
(A)長度21bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO10
TTGAAGAGGT CGTCAGAGCC T
(2)SEQ ID NO11信息
(i)序列特征
(A)長度23bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO11
GAAACGGTAA CGAATCTGAA CTG
(2)SEQ ID NO12信息
(i)序列特征
(A)長度18bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO12
CAGTCCATTC GCTAACCT
(2)SEQ ID NO13信息
(i)序列特征
(A)長度18bp
(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(5’-3’)
(D)拓撲學線性
(ii)分子類型寡聚核苷酸探針
(iv)反義
(xi)序列描述SEQ ID NO13
CGTCCCCATA TCTTCCCA
權(quán)利要求
1、一種多核苷酸，包含
(i)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列
(ii)互補于(i)的核苷酸序列的核苷酸序列；或
(iii)(i)或(ii)的核苷酸序列雜交的簡并核苷酸序列。
2、一種能與白點癥桿狀病毒基因組DNA雜交或可用作白點癥桿狀病毒基因組DNA的PCR擴增的引物的核苷酸片段，所述的核苷酸片段具有權(quán)利要求1的多核苷酸的核苷酸序列中存在的至少18個連續(xù)核苷酸。
3、根據(jù)權(quán)利要求2的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段由報道分子地高辛配基標記。
4、根據(jù)權(quán)利要求2的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段是選自SEQ ID NO3-13的引物，或是從選自SEQ ID NO3-13的一對F引物和R引物擴增的核苷酸片段。
5、根據(jù)權(quán)利要求4的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用地高辛配基標記。
6、一種在取自活蝦的一只步足或血液的體外樣品中檢測白點癥桿狀病毒的方法，包括如下步驟
(a)用權(quán)利要求2或4的核苷酸片段進行Southern雜交反應；
(b)用權(quán)利要求2或4的核苷酸片段進行斑點雜交反應；
或
(c)用選自SEQ ID NO3-13的一對F引物和R引物進行PCR擴增反應。
7、根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的核苷酸片段用報道分子地高辛配基標記。
8、根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的核苷酸片段是權(quán)利要求4中限定的核苷酸片段。
9、一種多核苷酸，包含
(i)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列
(ii)互補于(i)的核苷酸序列的核苷酸序列；或
(iii)(i)或(ii)的核苷酸序列雜交的簡并核苷酸序列。
10、一種能與白點癥桿狀病毒基因組DNA雜交或可用作白點癥桿狀病毒基因組DNA的PCR擴增的引物的核苷酸片段，所述的核苷酸片段具有權(quán)利要求9的多核苷酸的核苷酸序列中存在的至少18個連續(xù)核苷酸。
11、根據(jù)權(quán)利要求10的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段由報道分子地高辛配基標記。
12、根據(jù)權(quán)利要求10的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段是選自SEQ ID NO3-13的引物，或是從選自SEQ ID NO3-13的一對F引物和R引物擴增的核苷酸片段。
13、根據(jù)權(quán)利要求12的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用地高辛配基標記。
14、一種在取自活蝦的一只步足或血液的體外樣品中檢測白點癥桿狀病毒的方法，包括如下步驟
(a)用權(quán)利要求10或12的核苷酸片段進行Southern雜交反應；
(b)用權(quán)利要求10或12的核苷酸片段進行斑點雜交反應；
或
(c)用選自SEQ ID NO3-13的一對F引物和R引物進行PCR擴增反應。
15、根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的核苷酸片段用報道分子地高辛配基標記。
16、根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的核苷酸片段是權(quán)利要求12中限定的核苷酸片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種感染節(jié)肢動物，特別是蝦類的新病毒性病原體的鑒定、純化及檢測。該病毒命名為WSBV(白點癥桿狀病毒)。構(gòu)建了兩個WSBV基因組文庫，并由其中一個克隆片段的DNA序列設(shè)計出專一性引物對，可用于PCR擴增反應以檢測對蝦類是否受WSBV感染。本發(fā)明的結(jié)果提供了一有效的檢測工具，適用于篩檢白點癥桿狀病毒感染的生物體，特別是蝦類，從而可避免此病毒性疾病的進一步蔓延。
文檔編號C12N7/00GK1495190SQ0212438
公開日2004年5月12日 申請日期1996年4月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月17日
發(fā)明者郭光雄, 王重雄, 羅竹芳 申請人:郭光雄, 王重雄, 羅竹芳