專利名稱：淄曲霉菌云南變種Ym3221的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物，特別涉及到一種能夠發(fā)酵原植物三七的真菌微生物。
三七作為中國地方民族特色的傳統(tǒng)名貴中藥材，它與人參有關(guān)相似的性質(zhì)和功效，如滋補(bǔ)、鎮(zhèn)靜、抗溶血、抗疲勞、抗糖尿病、抗血小板凝集、促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抑制癌細(xì)胞成長等。例如，原人參二醇型皂甙Rd可以增強(qiáng)免疫功能，抑制癌細(xì)胞成長；Rh能夠促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化；原人參三醇型皂甙Rg具有抗血小板凝集的作用?？梢?，上述三類物質(zhì)是開發(fā)治療人類心腦血管疾病和抗腫瘤的一種重要而珍貴的藥物資源，原三七植物含有達(dá)瑪烷型四環(huán)三帖皂甙成分為20個左右，總皂甙含量為12~15％，主要屬于原人參二醇(Protopanaxadiol)或原人參三醇(Protopanaxatriol)及其衍生物。如何以三七為基質(zhì)，通過固體發(fā)酵方式，得到治療人類心腦血管疾病和抗腫瘤的藥用成份一直是人們研究重點之一。
本發(fā)明的目的旨在提供一種通過微生物發(fā)酵途徑，以三七中藥材為基質(zhì)，從發(fā)酵產(chǎn)物中，獲得抗人類心腦血管疾病或抗腫瘤化合物的天然藥用成分的真菌微生物——淄曲霉菌云南變種Ym3221。
本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221命名為Aspergillus tamariivar.Yunnanensis n.var chen et al.Ym3221淄曲霉菌云南變種Ym3221，分離自我國西南地區(qū)云南省土壤，該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2002年3月27日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 202015。
本發(fā)明所述的微生物經(jīng)微生物分類學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，它的分生孢子不僅壁厚、粗糙，而且具有小刺，明顯區(qū)別于已知淄曲霉菌。
本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的培養(yǎng)特征如下PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑5.0cm，13天5.0cm。菌落絨毛狀，白色帶米糠色粉狀顆粒，疏松隆起，邊緣整齊。背面白色。
麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑6.5cm，13天6.5cm。菌落絨毛疏松，白色帶米糠色粉狀顆粒，中心不規(guī)則疏松隆起，邊緣整齊，背面乳白色。
察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑2.5cm，13天3.0cm。菌落淺乳白色，粉狀顆粒，中間疏松隆起，邊緣整齊，有白色水珠。背面白色，具放射條紋。
本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的菌株的形態(tài)特征無性世代 菌絲無色有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的足細(xì)胞垂直生出，光滑無色；頂囊半球形，頂部2/3密生小梗；小梗雙層；分生孢子穗圓筒形，肉桂色；分生孢子球形光滑。孢子直徑1.8微米。
有性世代未發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221已于2002年3月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM 202015，分類命名為Aspergillus tamarii var.Yunnanens is n.var chen et al.Ym3221淄曲霉菌云南變種Ym3221，保藏單位地址中國.武漢.大學(xué)，郵政編碼430072。
本發(fā)明涉及一種微生物，該微生物能夠以三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)為發(fā)酵基質(zhì)，通過人工純培養(yǎng)方式，而獲得的三七發(fā)酵產(chǎn)物，與原三七植物比較，藥物成分的種類及含量都發(fā)生了系列變化。
本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221系一株能夠發(fā)酵原植物三七、促使三七總皂甙組分在質(zhì)量和含量方面都發(fā)生變化的高效藥用小型絲狀真菌微生促使原植物三七皂甙成分發(fā)生變化。具體表現(xiàn)為發(fā)酵產(chǎn)物的主體皂甙元由nR1、Rg1和Rh(Rh1、Rh2)組成；顯著特點之一是發(fā)酵產(chǎn)物總皂甙含量總體提高10~15％；原人參二醇型皂甙Rg1組分含量提高60％左右；原人參三醇型皂甙Rh含量提高20~25％。其二是原人參二醇型皂甙nR1含量降低48~52％；原人參二醇型皂甙Rd、Rb1及原人參三醇型皂甙Re等組分消失。可見，該菌株通過人工發(fā)酵三七，可作為篩選人類抗心腦血管疾病天然藥物成分的一種新型微生物資源。且以三七為基質(zhì)，通過淄曲霉菌微生物固體發(fā)酵方式，既能改變?nèi)咴磉霸幱贸煞值姆N類，又可以使三七藥用成分的含量得到提高。


圖1為本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的菌落圖片。
圖2為本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的菌株分生孢子穗顯微圖。
圖3為本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的菌株顯微圖。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
取YM3221(淄曲霉菌云南變種Ym3221Aspergillus tamariivar.Yunnanensis n.var.)菌種，在無菌條件下(無菌室或超凈工作臺)，用接種針挑取少許菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(15×150mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃活化培養(yǎng)96小時。取出活化96小時的菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的一級種子固體PDA培養(yǎng)基中，在28℃±1℃下培養(yǎng)96小時，即為YM31966一級種子。
采用500毫升玻璃三角瓶，裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基100毫升，15磅滅菌30分鐘備用。取YM3221菌一級種子，在無菌條件下，接種于裝有100毫升液體PDA培養(yǎng)基的500毫升玻璃三角瓶中，一級種子接種量為每支斜面接三個三角瓶，置28℃±2℃搖床培養(yǎng)96小時后，作為三七發(fā)酵二級種子用。
根據(jù)發(fā)酵規(guī)模大小，發(fā)酵料按重量比率，稱取50％三七粉(80~100目)，加入50％的新鮮黃豆渣，充分拌勻，發(fā)酵料水分不低于65％。三七發(fā)酵料配制好后，裝入500毫升罐頭瓶中，塑料薄膜、牛皮紙封口，置滅菌鍋內(nèi)15磅滅菌60分鐘后，取出待冷卻至30℃，接入液體二級種子，二級種子接用量為5％(v/w)。搖勻后放置28℃±2℃下，靜止發(fā)酵12天。在發(fā)酵期間，注意發(fā)酵室保濕不低80％相對濕度，第2天分別進(jìn)行搖瓶一次，并注意檢查有無染菌現(xiàn)象。
發(fā)酵完畢，發(fā)酵產(chǎn)物置60℃下烘干，得到三七發(fā)酵產(chǎn)物。
本發(fā)明是淄曲霉菌云南變種Ym3221(Aspergillus tamarii var.Yunnanensis n.var.)的三七發(fā)酵。采用人工固體發(fā)酵方法，發(fā)酵產(chǎn)物與三七原植物比較，主要藥用皂甙成分由nR1、Rg1和Rh(Rh1、Rh2)構(gòu)成。該菌株發(fā)酵三七能夠提高總皂甙含量10~15％范圍之間；能使原人參二醇型皂甙Rd、Rb1和原人參三醇型皂甙Re組分消失；nR1組分含量降低48~52％；原人參二醇型皂甙Rg1組分含量能夠提高60％左右；原人參三醇型皂甙Rh組分含量提高幅度在20~25％范圍內(nèi)。
綜上所述，淄曲霉菌云南變種Ym3221(Aspergillus tamarii var.Yunnanensis n.var.)YM3221菌種是發(fā)酵轉(zhuǎn)化三七皂甙，篩選抗人類心血管疾病或抗腫瘤藥用成分的又一天然微生物藥源。
本發(fā)明所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析，該菌分子的18SrRNA部分序列為序列表GGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGTTGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGACCTCTCGGTCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCAGAATCAACCAGA
權(quán)利要求
1.一種淄曲霉菌云南變種Ym3221，其特征在于命名為淄曲霉菌云南變種Ym3221Aspergillus tamarii var.Yunnanensis n.var chen et al.Ym3221，該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2002年3月27日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 202015。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221，其特征在于所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的培養(yǎng)特征如下PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑5.0cm，13天5.0cm。菌落絨毛狀，白色帶米糠色粉狀顆粒，疏松隆起，邊緣整齊，背面白色；麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑6.5cm，13天6.5cm。菌落絨毛疏松，白色帶米糠色粉狀顆粒，中心不規(guī)則疏松隆起，邊緣整齊，背面乳白色；察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑2.5cm，13天3.0cm。菌落淺乳白色，粉狀顆粒，中間疏松隆起，邊緣整齊，有白色水珠；背面白色，具放射條紋。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221，其特征在于所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的菌株的形態(tài)特征無性世代菌絲無色有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的足細(xì)胞垂直生出，光滑無色；頂囊半球形，頂部2/3密生小梗；小梗雙層；分生孢子穗圓筒形，肉桂色；分生孢子球形光滑；孢子直徑1.8微米。有性世代未發(fā)現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221，其特征在于所述的淄曲霉菌云南變種Ym3221的菌分子的18SrRNA部分序列為GGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGTTGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTAGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGACCTCTCGGTCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAA TAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCAGAATCAACCAGA
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物，特別涉及到一種能夠發(fā)酵原植物三七的真菌微生物。本所述的菌種命名為淄曲霉菌云南變種Ym3221Aspergillus tamariivar.Yunnanensis n.var chen et a1.Ym3221，該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2002年3月27日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 202015。本發(fā)明所述的菌種是發(fā)酵轉(zhuǎn)化三七皂甙，篩選抗人類心血管疾病或抗腫瘤藥用成分的又一天然微生物藥源。
文檔編號C12N15/31GK1467288SQ0212507
公開日2004年1月14日 申請日期2002年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月9日
發(fā)明者陳有為, 李治瀅, 楊麗源, 李紹蘭, 周斌, 張琦 申請人:云南省微生物研究所