專利名稱：一種版納鏈霉菌株以及利用該菌株發(fā)酵制備的手霉素及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鏈霉菌屬的新菌株以及該菌株發(fā)酵制備的產(chǎn)物和該產(chǎn)物的用途。
鏈霉菌可以培養(yǎng)發(fā)酵制備出多種抗生素。通過鏈霉菌(Streptomycesparvulus)發(fā)酵培養(yǎng)制備手霉素的方法是已知的(見文獻(xiàn)The Journal of antibiofics1987 Vol 40 No.P1541-48)。
手霉素是1987年由Axel，Zeevk等發(fā)現(xiàn)的具有抗真菌活性的化合物。1993年Hara M等發(fā)現(xiàn)手霉素具有抑制Ras法尼基轉(zhuǎn)移酶的作用。Ras基因被認(rèn)為是人類癌細(xì)胞中的主要原癌基因，Ras主要是通過癌蛋白在質(zhì)膜的錨定而起作用，在此過程中Ras法尼基轉(zhuǎn)移酶起著至關(guān)重要的作用，因此通過抑制該酶的活性來抑制人類癌基因的Ras活性，從而達(dá)到治療癌癥的作用。最近研究結(jié)果表明手霉素具抑制IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)活性，在抑制細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，ICE成為研制治療增殖性疾病的重要藥物靶點。
本發(fā)明的目的就是要提供一種版納鏈霉菌的新菌株，同時提供一種利用該菌株發(fā)酵制備的手霉素，以及該手霉素的用途。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的提供的版納鏈霉菌新菌株為版納鏈霉菌(Streptomyces bannaensis)N98-1272菌株，CGMCC No0762。
該菌株已于2002年7月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No0762。
該菌株通過以下方法分離得到將98年從云南省西雙版納的森林土壤中采集的土樣置于室溫下自然風(fēng)干一周后研成粉末狀，在電熱干燥箱中120℃干熱20分鐘，取干熱土樣1克，用水稀釋到100毫升，混勻，分別取0.2ml均勻涂布于兩種選擇性培養(yǎng)基(228號Bennett，sagar和Composition of HV agar)的雙碟表面，28℃培養(yǎng)2-3周，挑取單菌落，接斜面保存。
版納鏈霉菌N98-1272菌株具有以下微生物學(xué)特性形態(tài)特征版納鏈霉菌N98-1272菌株平板單菌落的直徑約為2厘米，圓型，紅色，邊緣整齊，中間整齊，有3-6條紋線。斜面培養(yǎng)168小時后，顏色為暗灰色，菌絲生長致密，有孢子，背后有紅色水溶性色素，孢子鏈較長，成不規(guī)則螺旋。
培養(yǎng)學(xué)特征版納鏈霉菌N98-1272菌株在六種培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)14天，在無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基上不生長，在其他五種培養(yǎng)基上生長良好，生長特征見表1。
表1版納鏈霉菌N98-1272的培養(yǎng)特征
生理生化特性版納鏈霉菌N98-1272菌株抗微生物活性均為陰性，其他生理生化特性見表2。
表2版納鏈霉菌N98-1272菌株生理生化特性
版納鏈霉菌N98-1272菌株的16S rDNA序列分析版納鏈霉菌N98-1272菌株的16S rDNA核苷酸全序列長度為1499bp。將其與GenBanK數(shù)據(jù)庫中其他放線菌菌株的16S rDNA相應(yīng)序列進(jìn)行比較，以Streptosporangium reoseum為外群(outgroun)，用GenBan軟件進(jìn)行系統(tǒng)化分析。從版納鏈霉菌菌株N98-1272與從GenBanK數(shù)據(jù)庫中相關(guān)聯(lián)菌株共同構(gòu)建的進(jìn)化樹可以看出，版納鏈霉菌N98-1272菌株形成一個明顯的單獨分枝，而且該菌株與其它典型菌株之間序列差異率達(dá)2％以上(即序列同源性不到98％)。版納鏈霉菌N98-1272菌株的16S rDNA的核苷酸全序列見附

圖1。
另外從培養(yǎng)特征和生理生化特性方面來看，版納鏈霉菌N98-1272菌株與鏈霉菌屬的其他種有較大差別。根據(jù)現(xiàn)代微生物的分類標(biāo)準(zhǔn)確定該菌株為鏈霉菌屬的一個新菌株，并將其命名為版納鏈霉菌(Streptomyces bannaensis sp.nov)N98-1272菌株。
利用版納鏈霉菌N98-1272菌株可以發(fā)酵制備的一種手霉素，它含有以下三種結(jié)構(gòu)形式的手霉素 R＝ 手霉素AR＝ 手霉素BR＝ 手霉素C利用版納鏈霉菌N98-1272菌株發(fā)酵制備手霉素的方法是包括在含有碳源、氮源、無機鹽和其它營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)版納鏈霉菌的步驟和從菌絲體中提取手霉素的步驟，可以由鏈霉菌屬放線菌版納鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)。
在本發(fā)明的版納鏈霉菌N98-1272菌株發(fā)酵培養(yǎng)中所使用的碳源可包括但不限于淀粉、葡萄糖。在本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)中所使用的氮源可包括但不限于酵母粉、脫脂豆粉。在本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)中所使用的無機鹽可包括但不限于磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸亞鐵和氯化鈷等。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)可在26-28℃和PH6.0-7.0下，在需氧條件下進(jìn)行8-9天。
由本發(fā)明菌株產(chǎn)生的手霉素主要存在于菌絲體中。通過離心，收集菌體，使用有機溶劑如丙酮或甲醇或乙醇浸泡，蒸去有機溶劑，殘渣用有機溶劑如乙酸乙酯抽提，使用硅膠柱層析法，優(yōu)選使用氯仿-甲醇(100∶0-0∶100)的混合溶劑分離，用高效液相色譜法，優(yōu)選甲醇-水(85-90％)與磷酸(0.1-0.3％)分離手霉素A、B、C組分，洗脫液流速為0.8ml/min，檢測波長為210nm，根據(jù)手霉素A、B、C的保留時間的不同得到手霉素A、B、C單組分。手霉素A、B、C的保留時間分別為10.25min，15.84min和25.68min。
手霉素A、B、C的特征如下1.手霉素A、B、C的分子式和分子量見表3表3手霉素A、B、C的分子式和分子量
版納鏈霉菌N98-1272發(fā)酵制備的手霉素可以在用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物中得到應(yīng)用。它與藥用輔料可制備成各種用于治療阿爾茨海默氏病的藥物制劑。其成人用量為20-150mg/日。
用本發(fā)明版納鏈霉菌N98-1272發(fā)酵制備的手霉素(以下簡稱手霉素)具有抑制乙酰膽堿酯酶(AchE)的作用，故可用于在制備治療阿爾茨海默氏病藥物中應(yīng)用。其藥物活性通過以下試驗得到證實。
手霉素對乙酰膽堿酯酶(AchE)的抑制活性試驗材料1、反應(yīng)底物丁酰硫代膽堿2、顯色劑二硫硝基苯甲酸藥物及配制實驗樣品分別取手霉素A、B和C適量，用50％乙醇溶解，使成0.8mg/ml溶液。
對照品取他克林適量，用50％乙醇溶解，使其成為0.8mg/ml溶液。
實驗方法(1)測定原理以丁酰硫代膽堿為底物，二硫硝基苯甲酸為顯色劑，丁酰硫代膽堿在乙酰膽堿酯酶(AchE)的作用下，丁酰硫代膽堿可被水解為丁酸和巰基膽堿，巰基膽堿與顯色劑二硫硝基苯甲酸反應(yīng)生成2-硝基-5-巰基苯甲酸，2-硝基-5-巰基苯甲酸在410nm處具有特征吸收，以此間接測定乙酰膽堿脂酶(AchE)的活性。
(2)乙酰膽堿酯酶的酶反應(yīng)曲線繪制乙酰膽堿酯酶儲備液配制取乙酰膽堿酯酶0.1mg(369U)溶于150ml的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.7)中，加甘油150m1，白蛋白30mg，混勻，終濃度為1230U/L，于-20℃冰箱內(nèi)保存。
乙酰膽堿酯酶稀釋液配制取乙酰膽堿酯酶儲備液1ml，用磷酸鹽緩沖液(PH＝7.7)稀釋到10ml，使成123U/L。
依次取0ul、25ul、50ul、75ul、100ul和125ul的乙酰膽堿酯酶稀釋液于96孔板中，依次加入磷酸鹽緩沖液(PH7.7)125ul、100ul、75ul、50ul、25ul和0ul，30℃保溫15分鐘，再加入丁酰硫代膽堿液使終濃度為6mmol/L和0.25mmol/L的二硫硝基苯甲酸75ul后，30℃保溫2小時后，在410nm測定吸收度A，以酶含量為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪圖，得到乙酰膽堿酯酶的酶反應(yīng)曲線(見圖2)。當(dāng)乙酰膽堿酯酶的濃度在0-61.5U/L范圍內(nèi)，與反應(yīng)物吸光度之間可呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)r＝0.9997。
手霉素對乙酰膽堿酯酶抑制活性測定方法樣品孔中加入手霉素樣品25ul，乙酰膽堿酯酶稀釋液75ul；對照孔加入50％乙醇25ul，乙酰膽堿酯酶稀釋液75ul；空白孔加入50％乙醇25ul，磷酸鹽緩沖液(pH7.7)75ul；用酶聯(lián)免疫檢測儀在410nm測定每孔吸收度為A本底，30℃保溫15分鐘后，向每孔中分別加入底物和顯色劑，使在每孔中的終濃度分別達(dá)到6mmol/L和0.25mmol/L，30℃保溫2小時，用酶聯(lián)免疫檢測儀在410nm測定每孔吸收度為A，樣品孔、對照孔、空白孔的吸收度分別為A樣品、A對照、A空白，樣品對乙酰膽堿酯酶抑制率計算公式如下 手霉素對乙酰膽堿酯酶的IC50測定對照品他克林(Sigma公司，貨號A3773)為乙酰膽堿酯酶抑制劑，以此為對照測定手霉素對乙酰膽堿酯酶的IC50值。
實驗樣品分別取手霉素A、B和C適量，用50％乙醇溶解，使成0.8mg/ml溶液。然后再逐級稀釋成0.24mg/ml、0.08mg/ml、0.024mg/ml、0.008mg/ml、0.0024mg/ml的樣品溶液。
對照品稱取他克林適量，用50％乙醇溶解，使其成為0.8mg/ml溶液。然后再逐級稀釋成0.24mg/ml、0.08mg/ml、0.024mg/ml、0.008mg/ml、0.0024mg/ml的對照品溶液。
測定方法同手霉素對乙酰膽堿酯酶抑制活性測定方法。
結(jié)果表明手霉素A、B和C對乙酰膽堿酯酶抑制活性與手霉素A、B和C的濃度成線性關(guān)系(見表4)。
表4手霉素A、B、C和他克林對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用
手霉素A IC50＝6.88∫g/ml(12.5μmol/L)手霉素B IC50＝7.65∫g/ml(15μmol/L)手霉素C IC50＝6.16∫g/ml(11.5μmol/L)他克林IC50＝2.6∫g/ml(13μmol/L)本發(fā)明用于制備制備治療阿爾茨海默氏病藥物具有毒副作用小的優(yōu)點。
試驗表明手霉素A和他克林對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶活性抑制的倍數(shù)分別為2.48倍和0.0092倍(以摩爾濃度計)。
丁酰膽堿酯酶和膽堿能傳遞沒有直接關(guān)系，主要分布在血漿、肝臟及腸粘膜上參與體內(nèi)生理活動，當(dāng)乙酰膽堿酯酶抑制劑對丁酰膽堿酯酶活性抑制較強時，可破壞丁酰膽堿酯酶的生理功能，而引起其功能紊亂，產(chǎn)生毒副反應(yīng)。
其實驗方法如下手霉素對丁酰膽堿酯酶的IC50測定其中丁酰膽堿酯酶的配制方法為，取丁酰膽堿脂酶0.3mg溶于200ml 0.02mol/L的磷酸緩沖液(PH7.7)中，加入200ml甘油與30mg白蛋白，混勻，于-20℃冰箱內(nèi)保存，用前稀釋10倍。
實驗樣品、對照品及測定方法同手霉素A、B、C對乙酰膽堿酯酶的IC50測定。實驗結(jié)果見表5。
表5手霉素和他克林對丁酰膽堿酯酶活性的抑制作用
手霉素A IC50＝17.05μg/ml(31umol/L)他克林IC50＝0.024μg/ml(0.12umol/L)手霉素抑制膽堿酯酶的活性位點測定取手霉素22mg溶于5ml甲醇中，加入6.1mg硼氫化鈉，反應(yīng)15分鐘后，向反應(yīng)液中加水150ml，用0.5mol/L草酸調(diào)pH至3.0，用氯仿進(jìn)行分次抽提，合并提取液，蒸去氯仿后得到氫化手霉素粗品，用制備高效液相色譜儀進(jìn)一步純化，用75％甲醇-水與0.1％磷酸混合液進(jìn)行洗脫，得到開環(huán)的氫化手霉素。氫化手霉素結(jié)構(gòu)式如下
用手霉素對乙酰膽堿酯酶活性抑制作用的測定方法測定手霉素和氫化手霉素對乙酰膽堿酯酶的抑制活性。在藥物濃度為1mg/ml時，氫化手霉素未顯示對乙酰膽堿酯酶的抑制活性，而手霉素的抑制率高達(dá)97.5％，手霉素抑制膽堿酯酶的活性位點為其結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧乙烷環(huán)。
本發(fā)明為公眾提供了一種新菌株，該新菌株可以用于制備手霉素，同時還可在制備治療阿爾茨海默氏病藥物中得到應(yīng)用，其毒副作用也較小。
圖1是版納鏈霉菌N98-1272菌株的16SrDNA核苷酸全序列圖。
圖2是乙酰膽堿酯酶反應(yīng)曲線圖。
實施例1版納鏈霉菌N98-1272菌株的分離。
將98年從云南省西雙版納的森林土壤中采集的土樣置于室溫下自然風(fēng)干一周后研成粉末狀，在電熱干燥箱中120℃干熱20分鐘，取干熱土樣1克，用水稀釋到100毫升，混勻，分別取0.2ml均勻涂布于兩種選擇性培養(yǎng)基(228號Bennett，s agar和Composition of HV agar)的雙碟表面，28℃培養(yǎng)2-3周，挑取單菌落，接斜面保存。
實施例2版納鏈霉菌N98-1272菌株發(fā)酵培養(yǎng)制備手霉素。
培養(yǎng)基為1號斜面培養(yǎng)基葡萄糖4％、酵母粉4％、麥芽膏5％、瓊脂粉20％、復(fù)合維生素B 0.035％、微量元素0.001％，PH7.2。
2號種子培養(yǎng)基淀粉24％、葡萄糖1％、蛋白胨3％、酵母粉5％、牛肉膏3％、碳酸鈣4％，PH7.0。
3號發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉4％、脫脂大豆粉2％、FeSO40.05％、NiCl20.05％、CoCl20.05％、K2HPO40.05％、KCl 0.03％、復(fù)合維生素B 0.003％，PH6.5。
用一鉑環(huán)版納鏈霉菌N98-1272給斜面培養(yǎng)基(1號)接種。在28℃下培養(yǎng)7天。將所得斜面培養(yǎng)物接種于750ml的三角瓶內(nèi)的140ml種子培養(yǎng)基(2號)中，該培養(yǎng)基預(yù)先已調(diào)節(jié)到PH7.0并在121℃下滅菌30分鐘。接種后，在旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)機中200轉(zhuǎn)份，28℃下培養(yǎng)2天。發(fā)酵培養(yǎng)基(3號)被調(diào)節(jié)到PH6.5，且在121℃下滅菌30分鐘。將上述種子培養(yǎng)物接種到750ml的三角瓶內(nèi)的140ml的發(fā)酵培養(yǎng)基(3號)中，使種子濃度達(dá)1％。在旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)機中220轉(zhuǎn)/分，28℃的條件下發(fā)酵6天，共得到發(fā)酵培養(yǎng)液5000ml。
將版納鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)液5000ml分次用離心機離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，上清棄掉，收集菌體，用3000ml丙酮分兩次浸泡，經(jīng)過濾，棄掉菌絲體，合并丙酮浸泡液，用旋轉(zhuǎn)濃縮器蒸去丙酮，所得殘渣用3000ml乙酸乙酯分二次進(jìn)行提取，合并乙酸乙酯提取液，加適量無水硫酸鈉脫水，至乙酸乙酯層澄清，將澄清的乙酸乙酯用旋轉(zhuǎn)濃縮器蒸干，得到褐色物。取褐色物1克，用適量甲醇溶解，用φ2.5×25cm的硅膠柱層析，依次用氯仿150ml、氯仿∶甲醇(100∶1)300ml、氯仿∶甲醇(100∶2)150ml、氯仿∶甲醇(10∶1)150ml、甲醇150ml進(jìn)行分布洗脫，流速為3ml/min。收集洗脫液10ml/管，用手霉素對乙酰膽堿脂酶抑制活性測定方法測定洗脫液活性，合并有活性洗脫液，蒸去溶媒，得手霉素混合物。
實施例3分離手霉素A、B、C單組分。
取實施例2中的手霉素混合物150mg，用適量甲醇溶解，使成50mg/ml溶液，用制備高效液相色譜儀分離，流動相為90％甲醇-水，0.1％磷酸，流速為6ml/min，用紫外檢測器，按手霉素A、B、C的保留時間10.25min，15.84mm和25.68min收集活性組分，蒸去甲醇，用乙酸乙酯抽提，抽提液用無水硫酸鈉脫水后，蒸去乙酸乙酯，得手霉素A、B、C單組分。
實施例4用實施例2制備的手霉素混合物與藥用輔料制備成各種用于治療阿爾茨海默氏病的藥物制劑。
實施例5用實施例2制備的手霉素粉25克，加labrafil M 1944 Cs 300克、無水乙醇120克溶解后，橄欖油加至1000ml，制備成用于治療阿爾茨海默氏病的藥用口服制劑，分裝為5ml/支。
實施例6用實施例3制備的用手霉素C粉25克，聚氧乙烯蓖麻油EL35 650克，無水乙醇330克，制備成用于治療阿爾茨海默氏病的藥用注射劑，25mg/ml。
權(quán)利要求
1.一種版納鏈霉菌菌株，其特征在于它為版納鏈霉菌(Streptomycesbannaensis)N98-1272菌株，CGMCC No0762。
2.一種利用版納鏈霉菌N98-1272菌株發(fā)酵制備的手霉素，其特征在于它含有以下三種結(jié)構(gòu)形式的手霉素 R＝ 手霉素AR＝ 手霉素BR＝ 手霉素C
3.版納鏈霉菌N98-1272菌株發(fā)酵制備的手霉素用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的版納鏈霉菌N98-1272菌株發(fā)酵制備的手霉素用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應(yīng)用，其特征在于手霉素的活性位點為其結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧乙烷環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種版納鏈霉菌(Streptomycesbannaensis)N98－1272菌株的新菌株CGMCC NO0762。同時提供了一種利用版納鏈霉菌N98－1272發(fā)酵制備的手霉素，該手霉素含有A、B、C三種結(jié)構(gòu)形式。該手霉素可以在制備治療阿爾茨海默氏病藥物中應(yīng)用，其毒副作用較小。
文檔編號C12N1/20GK1473927SQ0212541
公開日2004年2月11日 申請日期2002年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者呂渭川, 張華 , 董悅生, 姜成林, 鄭智慧, 姜怡, 李文均, 路新華, 李韶菁, 任曉, 崔小龍, 林潔, 楊潔 申請人:華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司, 云南省微生物研究所