專利名稱：在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)耐熱植酸酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物來(lái)產(chǎn)生一種耐熱性的植酸酶，這種植酸酶可耐受飼料加工的制粒高溫，用于單位動(dòng)物和魚(yú)類的飼料中。
植酸磷不能被單胃動(dòng)物有效利用，從而在飼喂過(guò)程中造成了許多問(wèn)題，第一、造成磷源浪費(fèi)。一方面飼料中的磷源不能得到有效利用，另一方面為了滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求，又必須在飼料中額外添加無(wú)機(jī)磷，提高了飼料成本。第二、形成高磷糞便而污染環(huán)境。飼料中85％左右的植酸磷會(huì)被動(dòng)物直接排出體外，糞便中大量的磷使水和土壤受到嚴(yán)重污染。第三、植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動(dòng)物腸胃道的消化吸收過(guò)程中會(huì)與多種金屬離子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，從而降低了動(dòng)物對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)元素的有效利用(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17201-204，1978)。
植酸酶(EC.3.1.3.8)是一種能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷酸。植酸酶廣泛存在于微生物中，如枯草芽孢桿菌(Paver，V.K.J.，Bac teriol.1511102-1108，1982)，假單孢桿菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.231207-1220，1970)，乳酸桿菌(Shirai K.，Letters Appl.Biol.Sci.19366-369，1994)，大腸桿菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.1724-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.321275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US PatentNo.5436156，1995)。
植酸酶的飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了確證(Ware J.H.et al.，USPatent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60％，糞便中磷排泄量減少40％，還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此對(duì)提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對(duì)環(huán)境的污染有重要意義。
隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，植酸酶已經(jīng)成為飼料添加劑和酶制劑研究的熱點(diǎn)。重點(diǎn)的研究方向之一就是解決在天然微生物中植酸酶的表達(dá)量太低，不能大量獲得廉價(jià)的植酸酶產(chǎn)品，難以滿足飼料工業(yè)發(fā)展的需求。隨著生物技術(shù)、基因工程等高新技術(shù)的發(fā)展，人們意識(shí)到通過(guò)基因工程的手段，利用生物反應(yīng)器來(lái)高效表達(dá)植酸酶基因可望達(dá)到大幅度提高植酸酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的。
在利用微生物做為生物反應(yīng)器來(lái)高效表達(dá)生產(chǎn)植酸酶已取得了較大的突破。1993年在A.niger ALK02268中表達(dá)了源于A.niger var.awamori的植酸酶基因phyA，其表達(dá)量比原菌株提高了幾倍(Piddington C.S.，Gene.13355-59，1993；)。同年，將來(lái)源于A.ficumm NRRL3135的phyA基因?qū)Щ卦?，使phyA基因的拷貝數(shù)增加到15個(gè)以上，從而使植酸酶的表達(dá)量提高到7600U/mL(Van Hartingsveldt W.et al.，Gene，12787-94，1993)。Moore E.等在A.oryzae中表達(dá)來(lái)源于酵母Saccharomyces cerevisiae的植酸酶基因和來(lái)源于A.niger 762的phyB基因，其結(jié)果也是使表達(dá)量分別提高到840U/mL和750U/mL(Moore E.etal.J Ind Microbiol，14396-420，1995)。以上的這些表達(dá)研究，從總體上看，其表達(dá)水平還較低，但卻證實(shí)了利用基因工程手段來(lái)提高植酸酶的表達(dá)、生產(chǎn)量這一途徑的有效性。1995年Van Gorcomd等(VanGorcom R.F.M.et al.，1995)將酸性植酸酶基因phyA重組到黑曲霉中，使植酸酶在重組菌株中的表達(dá)量達(dá)到了2.8×105U/mL，與天然植酸酶產(chǎn)生菌株相比有了大幅度的提高，大大降低了植酸酶的生產(chǎn)成本。這是目前國(guó)外報(bào)道的植酸酶最高表達(dá)水平，也是國(guó)外目前植酸酶工業(yè)生產(chǎn)所采用的菌株。1997年姚斌等構(gòu)建的基因工程酵母在小試水平上其酸性植酸酶的表達(dá)量達(dá)到5×105U/mL(相當(dāng)于每毫升發(fā)酵液中表達(dá)5mg植酸酶蛋白)(姚斌等，中國(guó)發(fā)明專利97121731.9，2000)，中試水平上將表達(dá)量提高到1×106U/mL發(fā)酵液，比原始的天然菌株Aspergillus niger 963中的植酸酶表達(dá)量高3000倍，比國(guó)外正在用于商品化生產(chǎn)酸性植酸酶的基因工程曲霉(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent 5436156，1995)高一倍以上。
另一條更為簡(jiǎn)便而有效的利用植酸酶的方法是直接利用基因工程技術(shù)來(lái)培育富含植酸酶的飼料專用作物，使其本身就包含足量而有效的植酸酶，植酸酶在動(dòng)物的胃中釋放出來(lái)而降解飼料中的植酸磷，這樣比利用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)植酸酶作為添加劑將更為經(jīng)濟(jì)、有效。國(guó)外近年來(lái)開(kāi)始進(jìn)行了這方面的嘗試，1993年Jan Pen等(Bio/Technol，1993，11811～814)將來(lái)源于黑曲霉的植酸酶基因轉(zhuǎn)移到植物煙草中，在煙草種子中檢測(cè)到了植酸酶活性，其表達(dá)量可達(dá)到種子中可溶性蛋白的1％，飼喂試驗(yàn)表明其飼喂效果與在飼料中直接添加等量的植酸酶相當(dāng)。1995年Theo C.Verwoerd等(Plant Physiol，1995，1091199～1205)也做了類似的工作，由于是利用非組織特異性啟動(dòng)子組成型表達(dá)植酸酶，所以在轉(zhuǎn)基因煙草整個(gè)植株中檢測(cè)到了植酸酶，其中在葉子中植酸酶的表達(dá)量最高，達(dá)到可溶性蛋白的14.4％。1999年和2002年Ullah等(BiochemBiophys Res Commun.1999，264201～206；2002，2901343～1348)分別在煙草和三葉草中表達(dá)了真菌來(lái)源的植酸酶，并對(duì)表達(dá)的植酸酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，表明植酸酶有正常的生物學(xué)活性。還有一些類似的工作，如1998年Koegel等(US patent 5824779，1998)在綠色植物中表達(dá)植酸酶，可從中得到包含植酸酶的植物漿汁；Ooijen等(US patent6022846，2000)和Sandra等(US patent 6248938，2001)均在三葉草中成功地表達(dá)了植酸酶。研究結(jié)果表明，植酸酶在植物中表達(dá)，似乎并不影響植物的形態(tài)、生長(zhǎng)、及種子的萌發(fā)。這些研究結(jié)果證實(shí)了植酸酶轉(zhuǎn)基因植物的可行性。
但以上工作中使用的植酸酶均是熱穩(wěn)定性較差的植酸酶，而要培育出種子中富含植酸酶的等飼料作物，首先必須采用性能優(yōu)良、耐熱性好的植酸酶基因，因?yàn)橹参锓N子在加工成飼料的過(guò)程中有一個(gè)高溫制粒過(guò)程，溫度一般在75～93℃，持續(xù)時(shí)間為數(shù)分鐘，種子中的植酸酶必須要能經(jīng)受住此溫度。植酸酶作為一種酶制劑形式的飼料添加劑可通過(guò)變通的方法回避耐高溫問(wèn)題，如包被酶顆?；蛟陲暳现屏＜庸ず笤偬砑舆M(jìn)去，而存在于植物種子中的植酸酶卻無(wú)法回避飼料制粒高溫的問(wèn)題，這也是目前培育富含植酸酶的轉(zhuǎn)基因飼料作物的根本問(wèn)題所在。
我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)明了一種耐高溫、可同時(shí)適用于單胃動(dòng)物和淡水魚(yú)類飼料的廣譜植酸酶及其編碼基因(中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?1142162.2)，利用此基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物可使轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的植酸酶耐飼料制粒高溫，從而有望在生產(chǎn)實(shí)踐中實(shí)際應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種使植酸酶基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)的具體方法。用基因重組技術(shù)，將來(lái)源于各種微生物(如黑曲霉、煙曲霉、酵母等真菌，大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌等細(xì)菌)、植物(玉米、大豆、水稻等)的植酸酶基因，尤其是耐熱性好的植酸酶編碼基因如phyA3(中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?1142162.2)，構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，采用在植物中有高活性的組成型或時(shí)空特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)植酸酶基因，通過(guò)轉(zhuǎn)化整合到植物染色體上，構(gòu)建高效表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法等，植物可以是煙草及農(nóng)作物玉米、大豆、水稻等。
轉(zhuǎn)植酸酶基因的植物表達(dá)的植酸酶可直接用于單胃動(dòng)物和魚(yú)類的飼料中。
2.酶與試劑盒 限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶、Mung bean酶為Boehringer公司產(chǎn)品。T7DNA sequence kit購(gòu)于Pharmacia公司。In vitromutagenesis systems Kit、隨機(jī)引物標(biāo)記Kit和PCR Kit均購(gòu)于Promega公司。
3.生化試劑DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。
4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB(5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母提取物、5g/L蔗糖、0.5g/L MgSO4·7H2O，pH7.2～7.5)；煙草轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基MS(1L中含有6.2mg硼酸，22.3mg硫酸錳，8.6mg硫酸鋅，0.25mg鉬酸納，0.025mg硫酸銅，0.025mg氯化鈷，100mg肌醇，1mg煙酸，1mg鹽酸吡哆素，10mg鹽酸硫胺素，1.65g硝酸胺，1.9g硝酸鉀，0.37g硫酸鎂，0.17g磷酸二氫鉀，0.04g Fe-330，0.4g氯化鈣，0.83mg碘化鉀)。
克隆在質(zhì)粒pYB2中的耐熱植酸酶編碼基因phyA3是一已切除信號(hào)肽編碼序列的植酸酶成熟蛋白編碼基因(中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?1142162.2)，將pYB2質(zhì)粒用SphI酶切，抹平，再用XbaI酶切，電泳回收1.35kb片段，同時(shí)將植物載體pBI525用BamHI酶切，補(bǔ)平，再用XbaI酶切，回收產(chǎn)物與植酸酶片段相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得重組質(zhì)粒pBI525phy。重組質(zhì)粒經(jīng)XbaI酶切鑒定大小約為5.2kb，再用植酸酶基因內(nèi)部495bp處的BamHI酶切，結(jié)果得到0.9kb和4.3kb左右兩條帶，認(rèn)為克隆正確。進(jìn)一步將pBI525phy用EcoRI和HindIII雙酶切，回收大小為2.25kb的片段，即為含有雙35S啟動(dòng)子和Ω序列、植酸酶基因以及NOS終止子的表達(dá)盒，將此表達(dá)盒與同樣雙酶切的pBINPLUS質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組雙源載體pBINPLUSphy，重組雙源載體經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切鑒定證實(shí)植酸酶基因表達(dá)盒被正確構(gòu)建到雙元載體pBINPLUS上。
1)農(nóng)桿菌活化將含有pBINPLUSphy的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種于5ml YEB(含Kan50mg/l)中，28℃培養(yǎng)過(guò)夜，取2ml菌液接種于50ml YEB(含Kan50mg/l)中，培養(yǎng)至OD值約為0.8，離心收集菌體，用等體積MS液體培養(yǎng)基重懸后，即成為侵染液。
2)葉盤法轉(zhuǎn)化將煙草栽培品種NC89種子，用自來(lái)水沖洗干凈，置于70％乙醇1分鐘，2％次氯酸鈉中浸泡20分鐘后，用大量無(wú)菌水沖洗干凈，置于MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，1個(gè)月后，生長(zhǎng)至3cm高，葉片即可用于實(shí)驗(yàn)。將煙草無(wú)菌苗葉片切成0.5cm2大小的方塊(葉盤)，在農(nóng)桿菌侵染液中侵染5分鐘，用鑷子將葉盤夾到無(wú)菌濾紙上，吸去殘留的菌液，然后置于鋪有無(wú)菌濾紙的MS平板(含2mg/ml 6-BA，0.1mg/ml IAA)上，28℃黑暗下培養(yǎng)3天。同時(shí)將未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的葉盤放入同樣的MS平板上作為陰性對(duì)照。3天后將轉(zhuǎn)化處理的葉盤浸于MS液體培養(yǎng)基中3-5分鐘后，放無(wú)菌濾紙上吸去殘留液，轉(zhuǎn)到MS平板(含2mg/ml 6-BA，0.1mg/ml IAA，500mg/ml CB，200mg/ml Kan)上，同時(shí)將對(duì)照葉盤也進(jìn)行同樣的處理，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為24℃光照16小時(shí)，兩星期換一次培養(yǎng)基，直至分化出芽。
3)轉(zhuǎn)化后根的再生轉(zhuǎn)化約6周后，將分化的抗性芽切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS+500mg/ml CB+100mg/ml Kan)上，10天后可見(jiàn)生根。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，用含有植酸酶基因的LBA4404工程菌株侵染煙草葉盤。經(jīng)過(guò)7天左右，篩選培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染的煙草葉盤傷口周圍長(zhǎng)出許多小的愈傷點(diǎn)，隨著時(shí)間的推移，產(chǎn)生的芽點(diǎn)逐漸分化形成綠色的小芽。而未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染過(guò)的煙草葉盤周圍則未見(jiàn)任何愈傷的分化以及芽的形成，而是逐漸變黃、死亡。待綠色小芽長(zhǎng)至約1cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有卡那霉素的生根培養(yǎng)基上，7-15天可見(jiàn)根的產(chǎn)生，而超過(guò)15天未見(jiàn)生根的小芽則視為假陽(yáng)性，棄之。經(jīng)過(guò)先后幾次轉(zhuǎn)化，共獲得卡那霉素抗性煙草植株250株，用于進(jìn)一步的檢測(cè)。
本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草中植酸酶基因PCR產(chǎn)物的Southern分析方法。
為了證實(shí)在轉(zhuǎn)基因煙草中植酸酶基因已整合到了煙草基因組中，我們通過(guò)PCR和Southen blotting的方法進(jìn)行確證。
取0.1g左右的煙草葉片，用CTAB法提取其基因組DNA。用植酸酶基因兩端序列作引物(P35’GCGAATTCATGTCCAAGTCCTGC 3’和P25’TCGAATTCTCAACTAAAGCACTC 3’)，以未轉(zhuǎn)化煙草做陰性對(duì)照，以質(zhì)粒pGEMTphy作陽(yáng)性對(duì)照，PCR擴(kuò)增植酸酶基因全長(zhǎng)。結(jié)果在檢測(cè)的144株植株中，有92株呈PCR陽(yáng)性，擴(kuò)增出1.35Kb的DNA片段，與植酸酶基因大小相符，而未轉(zhuǎn)化植株沒(méi)有此條帶。圖2示部分再生植株的PCR擴(kuò)增結(jié)果。將92株P(guān)CR陽(yáng)性植株分別命名為植株P(guān)1-P92。
為確證PCR擴(kuò)增出的DNA條帶為植酸酶基因，將其轉(zhuǎn)到尼龍膜上，與32P標(biāo)記的植酸酶基因進(jìn)行了Southern雜交。結(jié)果可見(jiàn)明顯清晰的雜交帶。圖3示部分轉(zhuǎn)化植株的PCR-Southern雜交結(jié)果。
這些結(jié)果證實(shí)植酸酶基因已正確整合到轉(zhuǎn)基因煙草的染色體上。
為驗(yàn)證轉(zhuǎn)化植株中植酸酶是否得到了表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行了Western-blot檢測(cè)。稱取基本在同一生長(zhǎng)周期的PCR陽(yáng)性植株與未轉(zhuǎn)化植株葉片各100mg，分別加入500μl冰預(yù)冷的樣品抽提緩沖液研磨，離心收集上清，即為葉片中的可溶性蛋白液。
為獲得清晰的條帶，保證較低的背景，做了多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終決定將一抗稀釋5000倍使用，轉(zhuǎn)化植株葉片的蛋白液樣品取5μl用于上樣。同時(shí)以未轉(zhuǎn)化煙草葉片蛋白為陰性對(duì)照，以純化的植酸酶純品為陽(yáng)性對(duì)照，以中等大小蛋白為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳、轉(zhuǎn)膜、與抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)以及ECL顯色。
結(jié)果表明，部分轉(zhuǎn)基因煙草在55kD左右處可見(jiàn)一明顯、清晰的條帶，大小與純品植酸酶基本一致(圖4)，而對(duì)于未轉(zhuǎn)化植株則未見(jiàn)任何條帶出現(xiàn)，由此表明在部分轉(zhuǎn)化煙草中，植酸酶基因得到了表達(dá)。
總共對(duì)70株P(guān)CR陽(yáng)性植株進(jìn)行了Western檢測(cè)，結(jié)果有41株可見(jiàn)特異性陽(yáng)性條帶，也就是在轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株中植酸酶的表達(dá)率約為58.6％。
Western-blot檢測(cè)呈陽(yáng)性的41株轉(zhuǎn)化植株為P1，P2，P5，P6，P8，P11，P12，P13，P14，P15，P16，P20，P21，P23，P26，P28，P29，P30，P31，P33，P34，P36，P38，P40，P43，P45，P48，P49，P50，P51，P52，P54，P56，P57，P60，P61，P63，P64，P65，P68，P70。
在所檢測(cè)植株中，P11和P34的OD450值較高，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其表達(dá)量為每100mg新鮮葉片中分別有植酸酶3.75μg和3.20μg，分別占葉片總可溶性蛋白的0.38％和0.32％。
對(duì)通過(guò)ELISA檢測(cè)植酸酶表達(dá)量相對(duì)較高的植株，用葉片蛋白提取液進(jìn)行了酶活分析。以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照。
酶活性測(cè)定方法為0.2mL的酶稀釋液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 10％TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入2mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量。對(duì)照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 10％TCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。一個(gè)酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1nmol無(wú)機(jī)磷所需酶量為一個(gè)酶活性單位。
測(cè)定結(jié)果(表1)表明，P11植株中的植酸酶活性為385U/100g鮮葉片，P34植株為330U/100g鮮葉片。
表1.轉(zhuǎn)基因煙草中的植酸酶活性

權(quán)利要求
1.一種在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)植酸酶的方法，其特征在于，利用基因重組技術(shù)將來(lái)源于各種微生物、植物的植酸酶基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，采用在植物中有高活性的組成型或時(shí)空特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)植酸酶基因，通過(guò)轉(zhuǎn)化整合到植物染色體上，構(gòu)建高效表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物包括黑曲霉、煙曲霉、酵母、大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括煙草、玉米、大豆、水稻。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的植酸酶基因指耐熱性好的植酸酶編碼基因。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用耐熱性好的植酸酶編碼基因來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法，植物中表達(dá)的植酸酶可經(jīng)受飼料制粒高溫。在植物中表達(dá)的植酸酶可直接用于單胃動(dòng)物和魚(yú)類的飼料中。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1473934SQ02125940
公開(kāi)日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2002年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月5日
發(fā)明者姚斌, 范云六, 朱莉, 斌 姚 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所