專利名稱：一種新的基因芯片固相載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的基因芯片固相載體的制備方法。
本發(fā)明的目的在于開發(fā)新的基因芯片固相載體，即基因芯片的片基。
基因芯片的發(fā)展現(xiàn)狀生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學(xué)技術(shù)革命。它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。常用的生物芯片分為三大類即基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實驗室。
基因芯片是生物芯片中研究最早、應(yīng)用最廣泛、最先實現(xiàn)商品化的芯片。
基因芯片(又稱DNA芯片)是通過微陣列技術(shù)，將高密度的DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。目前，該技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域主要包括基因表達譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、疾病診斷和預(yù)測、藥物篩選、基因測序等諸多方面。
基因芯片產(chǎn)業(yè)是大有發(fā)展前景的世界高科技前沿產(chǎn)業(yè)。據(jù)專家預(yù)測，在未來幾年里，世界基因芯片產(chǎn)業(yè)將以每年增長30％的速度發(fā)展，2005年全球基因芯片總營業(yè)額將從1998年的180億美元增長到400億美元，診斷的疾病種類可望從目前的100多種擴大到5000種，它的發(fā)展將帶來醫(yī)療技術(shù)革命，并為互聯(lián)網(wǎng)上遠程醫(yī)療打開新的天地。
國外情況美國繼開展人類基因組計劃以后，美國政府于1998年正式啟動基因芯片計劃，聯(lián)合私人投資機構(gòu)投入20億美元以上的研究經(jīng)費。美國國立衛(wèi)生研究院、美國能源部、商業(yè)部、司法部、國防部和中央情報局參與了此項目，同時斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國立實驗室如Argonne、Oakridge等國家實驗室也參與了該項目的開發(fā)和研究。美國政府和產(chǎn)業(yè)界在過去的10年共投入近20億美元用于以基因芯片為主的生物芯片研究開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化。
目前，國際上已經(jīng)有許多從事生物芯片研究的公司，每家公司的芯片技術(shù)都各具特色，應(yīng)用目的也不盡相同，如加利福尼亞州森尼維爾的Hyseq公司，聲稱擁有最快的基因分析器，它們由機器人制造，機器人把DNA探針滴到過濾紙上，其DNA陣具有優(yōu)勢，破譯DNA的速度最快。帕洛阿爾托的Syntenl公司聲稱它的芯片衡量細胞中基因活動最有效，公司正在利用基因芯片研究前列腺癌等疾病。圣迭戈的Nanogen公司計劃進入診斷艾滋病毒和其它傳染病的市場。Incyte制藥公司與Affymetrix公司合作生產(chǎn)針對各種疾病的基因分析芯片供藥品研究使用。
美國Affymetrix公司是世界上最有影響的基因芯片開發(fā)制造商，該公司聚集有多位計算機、數(shù)學(xué)和分子生物學(xué)專家，其每年的研究經(jīng)費在一千萬美元以上，且已歷時六七年之久，擁有多項專例。公司的第一種產(chǎn)品用于研究艾滋病毒的抗藥性，第二種產(chǎn)品將檢查在多種癌癥中發(fā)生突變的一種基因，1998年生產(chǎn)出帶有13.5萬個基因探針的芯片，使人類DNA解碼速度提高了25倍。目前，該公司正在努力提高其芯片探針陣列的“密集度”，它的原型芯片能容納6.5萬個探針，最近又推出了有40萬個探針的芯片。公司總裁希望能生產(chǎn)出有100萬個探針的DNA芯片。該公司的基因組研究主任正在設(shè)計能夠同時監(jiān)測5萬個人體基因的芯片。Affymetrix公司已開發(fā)出的判斷是否攜帶艾滋病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶基因HIV芯片；確定有無癌癥可能的P53基因芯片以及診斷藥物代謝缺乏癥的細胞色素P450芯片，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床。
英國劍橋大學(xué)、歐亞各國的跨國公司如摩托羅拉、惠普、IBM以及目立公司也正在從事基因芯片的研究。一些具有實力的大型制藥公司對基因芯片用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域都非常感興趣。相繼投入巨資開發(fā)基因芯片技術(shù)和相應(yīng)的設(shè)備，嘗試利用基因芯片技術(shù)開展新藥的超高量篩選和進行藥理遺傳學(xué)、藥理基因組學(xué)的研究。
一項為期三年、耗資九百萬美元的計劃由摩托羅拉在坦佩的物理科學(xué)實驗室承擔(dān)，由亞利桑那州立大學(xué)、Hun tsville的CFD研究組和摩托羅拉生物芯片系統(tǒng)組共同研究，目的要研制出一種便宜、快速診斷傳染疾病的基因芯片，以加快對致命的病毒感染的診斷。
國內(nèi)研究進展從我國的情況來看，作為人類基因組工程的參與國之一，雖然我國還處于初級階段，與發(fā)達國家水平還有差距，但有差距并不意味著沒有機會，挑戰(zhàn)與機遇并存。從整個高科技領(lǐng)域來講，生物技術(shù)是我國與國際先進國家水平差距最小的，故優(yōu)先發(fā)展生物信息產(chǎn)業(yè)是一種運用智慧超越先進大國的戰(zhàn)略。
我國在99年3月國家科學(xué)技術(shù)部起草《醫(yī)藥生物技術(shù)“十五”及2015年規(guī)劃》所列十五個關(guān)鍵技術(shù)項目中，就有八個項目(基因組學(xué)技術(shù)、重大疾病相關(guān)基因的分離和功能研究、基因藥物工程、基因治療技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、組合生物合成技術(shù)、新型診斷技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物芯片技術(shù))要使用生物芯片，其中，生物芯片技術(shù)還被單列為一個專門項目進行規(guī)劃，可見生物芯片在我國的重要性。
中國工程院2000年1月6日在京舉辦首次工程科技論壇，專題就是″生物芯片技術(shù)″，科學(xué)家提出以生物芯片技術(shù)為核心的各相關(guān)產(chǎn)業(yè)正在全球崛起，世界工業(yè)發(fā)達國家已開始有計劃、大投入、爭先恐后地對該領(lǐng)域知識產(chǎn)權(quán)進行保護。我國應(yīng)迅速制定適合中國國情的對策，以避免出現(xiàn)像計算機產(chǎn)業(yè)那樣因沒有自己的芯片專利和技術(shù)而受制于人的被動局面。最近國務(wù)院已決定成立國家生物芯片工程中心，對生物芯片的系統(tǒng)研發(fā)作傾斜性支持。
我國科學(xué)家從1998年開始正式涉及基因芯片領(lǐng)域以來，已有多家大學(xué)和研究院所以及高新技術(shù)公司開始生物芯片的研發(fā)工作，主要有復(fù)旦大學(xué)、中科院上海冶金所、中科院上海細胞所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、清華大學(xué)等高校和科研單位以及諸多的公司企業(yè)。國家級研究經(jīng)費從1998年至今共投入約700萬元人民幣。清華大學(xué)從1999年開始成立專門研究基因芯片的博奧公司，3年內(nèi)共獲得國家資助3億元。全國范圍內(nèi)用于生物芯片研發(fā)的民間風(fēng)險資本投入約為1.6億元人民幣，并在以很快的幅度增加。
基因芯片的制備基因芯片作為一項新興的技術(shù)，是將特異性寡核苷酸探針固定在俗稱為片基的固相支撐物上的。支持物分為很多種，如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，均需經(jīng)過特殊處理，才能將探針固定在上面。
用于連接、吸附或包埋各種生物分子使其以水不溶性狀態(tài)行使功能的固相材料統(tǒng)稱為載體。這種用于色譜填料的載體，同樣也適用于生物芯片的載體。用作色譜填料的載體絕大多數(shù)是以固體顆粒的形式填充到色譜柱中，而生物芯片所用的載體必須是固體片狀或者是薄膜類，而且片狀或薄膜類材料的表面和色譜顆粒填料表面一樣應(yīng)當(dāng)具有各種不同的活性基因，以便與各種生物分子連接。除此之外，制作生物芯片的材料應(yīng)當(dāng)具有良好的光學(xué)性質(zhì)，能適應(yīng)透射或反射光的測量。制作生物芯片的片(板)狀透明材料與用做色譜填料的不透明固體顆粒有著根本的區(qū)別。但是制作生物芯片的載體材料必須符合下列的要求(a)載體表面必須具有可以進行化學(xué)反應(yīng)的活性基團，以便與生物分子進行偶聯(lián)；(b)使單位載體上結(jié)合的生物分子達到最佳容量；(c)載體應(yīng)當(dāng)是惰性的和有足夠的穩(wěn)定性，包括機械的、物理的和化學(xué)穩(wěn)定性。所謂惰性的，就是說載體其他性能或特異性吸附都不應(yīng)該干擾生物分子的功能。穩(wěn)定性是在進行分子雜交或結(jié)合時，可能遭受一定的壓力或酸、堿條件而不發(fā)生變化；(d)載體具有良好的生物兼容性，人們在從事科學(xué)研究和生物芯片的制作時，必須要全面衡量其利弊，選擇適合于自己的研究體系，兼顧其他要求。
在制作生物芯片是，載體材料很多，大致可分為4類無機材料、天然有機聚合物、人工合成的有機高分子聚合物、各種高分子聚合物制成的各種膜?？傮w來說有幾十種甚至上百種載體材料。目前使用于制作生物芯片的載體材料只有少數(shù)幾種，象玻璃片、金屬片、各種有機高分子制作的薄膜等。其中玻璃片受到各國研究者的重視，其研究可能是來源方便，表面羥基可以用N，N-二乙氧基氨丙基三乙氧基硅烷作表面處理，然后能夠偶聯(lián)核酸、酶、抗體(抗原)、蛋白質(zhì)多肽等各種生物分子。也可以用巰基標(biāo)記的生物分子直接和玻璃表面作用等。另一個原因是大多數(shù)生物芯片采用了發(fā)光檢測的方法，不管透射光或反射光它均合適。第三個原因是可以用光刻的方法在玻璃芯片上刻出微流路，或者它與刻好微流路的硅橡膠壓緊聯(lián)合使用的微流路，通過微量注射泵在載體上進行生物分子的連接，DNA雜交，清洗和檢測等。
活化定義為載體的修飾過程，即通過化學(xué)反應(yīng)用各種不同的活化試劑在載體表面健合上各種各樣的活性基團，以便與配基共價結(jié)合，形成具不同的生物特異性的親合載體，用來固定各種不同的活性生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸、酶、多肽、抗原、抗體等。
活化的方法有很多種，但到目前為止沒有一種活化方法能夠適合所有的載體的活化和配基的偶聯(lián)，所以在活化開始的時候，應(yīng)當(dāng)有一個基本的估計，即活化的載體在偶聯(lián)試劑作用與配基的偶聯(lián)應(yīng)當(dāng)是容易進行的。不同載體可以用不同的活化試劑把載體表面活化，例如表面為羧基的載體，用EDC和NHS把表面變成活潑酯，然后再同各種不同的生物分子偶聯(lián)。采用類似的方法，可以分別把羥基、氨基、醛基、巰基等的載體表面活化成活性基團，然后再進行不同的鍵合反應(yīng)。值得提出的是，在金箔表面進行分子自組裝也不難。用DTT還原DNA中的二硫鍵變成巰基或者直接利用DNA分子中的(-S-S-)二硫鍵，都可以把DNA探針特異的結(jié)合在金的表面。
我們的基因芯片固相載體的制備方法本發(fā)明的基因芯片固相載體的制備方法，所用的材料包括，但不限于，普通玻璃片、石英片和硅片等，通過表面化學(xué)修飾，使這些材料表面帶有巰基(-SH)而完成的。
采用本發(fā)明的基因芯片固相載體的制備方法，可制備出帶有活性巰基(-SH)的基因芯片片基?；蛐酒系幕钚詭€基(-SH)可以與在5’端或3’端被修飾(連接)有活性巰基(-SH)的寡核苷酸的巰基(-SH)反應(yīng)，生成二硫鍵(-S-S-)，從而將寡核苷酸通過二硫鍵(-S-S-)固定(連接)在基因芯片片基上。這些固定在基因芯片片基上的寡核苷酸通常是作為分子探針，它們與某些基因的DNA序列互補或高度同源，可以與這些序列互補的DNA單鏈通過退火而形成雜交分子，從而將這些序列互補的DNA單鏈捕捉、固定在基因芯片上。這些被捕捉、固定的DNA單鏈被人為標(biāo)記上熒光素、同位素或酶，可以在基因芯片上顯現(xiàn)出來，人們據(jù)此就可判斷出被捕捉的基因。
采用本發(fā)明的基因芯片固相載體的制備方法，制備出帶有活性巰基(-SH)的基因芯片片基后，利用微排序法按照設(shè)計將所述的被修飾有活性巰基(-SH)的核酸探針有序地點樣到載體上，通過核酸探針末端修飾的活性基團與載體表面相應(yīng)的活性基團反應(yīng)，形成二硫鍵(-S-S-)，將探針固定于載體上，從而制成基因芯片。同時，在所制備的基因芯片上，每一種核酸探針都有固定的位置，因此在與樣品雜交后，通過對所捕獲陽性信號的尋址即可明確其對應(yīng)的特定核酸探針，從而確定與其對應(yīng)的目標(biāo)DNA序列。
采用本發(fā)明的基因芯片固相載體的制備方法所制備的基因芯片，可以用于醫(yī)療(診斷、治療、療效判斷)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、軍方生物戰(zhàn)劑的快速檢定傳感器等應(yīng)用領(lǐng)域。
本發(fā)明通過以下實施例對本發(fā)明的基因芯片固相載體的制備方法及其應(yīng)用進行描述。需說明的是，下述實施例只是用來說明而非限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的、其他通過采用本發(fā)明的基因芯片固相載體的制備方法而制備的基因芯片的應(yīng)用均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1、基因芯片玻璃固相載體的制備方法材料1、普通載玻片2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巰丙基)三甲氧硅烷(ACROS)3、氬氣北京氧氣廠方法載玻片用強酸浸泡后，用去離子水反復(fù)洗滌，用無水乙醇洗滌并浸泡48小時。
將載玻片取出，浸于25％氨水中48小時，取出后，用去離子水沖洗，然后用無水乙醇洗滌。
洗滌結(jié)束后，將載玻片浸于以下溶液中一小時，進行硅化1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。
配制方法取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶于50ml去離子水中，加入1L容量瓶中，用無水乙醇加至1000ml刻度，測其pH為4.5。取5.8ml 85％的(3-巰丙基)三甲氧硅烷于1L的燒杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。
將載玻片逐片放入“3”的溶液中，室溫放置1小時。
將載玻片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然后將載玻片再浸泡入1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然后取出，每片單獨碼放于支架上。
將支架移入真空干燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氬氣再抽真空至-0.75mPa，放入氬氣至與大氣等壓，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氬氣，如此，可將真空干燥起器中的空氣都置換掉。
置室溫(20℃)至少48小時。
用1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷浸泡后，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍后，于氬氣中放置48小時，取出。
置于陰涼閉光處保存。基因芯片玻璃固相載體即制備完成。實施例2、基因芯片石英固相載體的制備方法材料1、石英片2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巰丙基)三甲氧硅烷(ACROS)3、氬氣北京氧氣廠方法石英片用強酸浸泡后，用去離子水反復(fù)洗滌，用無水乙醇洗滌并浸泡48小時。
將石英片取出，浸于25％氨水中48小時，取出后，用去離子水沖洗，然后用無水乙醇洗滌。
洗滌結(jié)束后，將石英片浸于以下溶液中一小時，進行硅化1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。
配制方法取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶于50ml去離子水中，加入1L容量瓶中，用無水乙醇加至1000ml刻度，測其pH為4.5。取5.8ml 85％的(3-巰丙基)三甲氧硅烷于1L的燒杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。
將石英片逐片放入“3”的溶液中，室溫放置1小時。
將石英片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然后將石英片再浸泡入1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然后取出，每片單獨碼放于支架上。
將支架移入真空干燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氬氣再抽真空至-0.75mPa，放入氬氣至與大氣等壓，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氬氣，如此，可將真空干燥起器中的空氣都置換掉。
置室溫(20℃)至少48小時。
用1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷浸泡后，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍后，于氬氣中放置48小時，取出。
置于陰涼閉光處保存?；蛐酒⒐滔噍d體即制備完成。實施例3、基因芯片硅片固相載體的制備方法材料1、硅片2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巰丙基)三甲氧硅烷(ACROS)3、氬氣北京氧氣廠方法硅片用強酸浸泡后，用去離子水反復(fù)洗滌，用無水乙醇洗滌并浸泡48小時。
將硅片取出，浸于25％氨水中48小時，取出后，用去離子水沖洗，然后用無水乙醇洗滌。
洗滌結(jié)束后，將硅片浸于以下溶液中一小時，進行硅化1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。
配制方法取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶于50ml去離子水中，加入1L容量瓶中，用無水乙醇加至1000ml刻度，測其pH為4.5。取5.8ml 85％的(3-巰丙基)三甲氧硅烷于1L的燒杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。
將硅片逐片放入“3”的溶液中，室溫放置1小時。
將硅片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然后將硅片再浸泡入1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然后取出，每片單獨碼放于支架上。
將支架移入真空干燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氬氣再抽真空至-0.75mPa，放入氬氣至與大氣等壓，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氬氣，如此，可將真空干燥起器中的空氣都置換掉。
置室溫(20℃)至少48小時。
用1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷浸泡后，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍后，于氬氣中放置48小時，取出。
置于陰涼閉光處保存。基因芯片硅片固相載體即制備完成。實施例4、用帶有活性巰基(-SH)的基因芯片玻璃片基制備基因芯片利用微排序法，將被修飾有活性巰基(-SH)的核酸探針有序地點樣到所述的“實施例1”、“實施例2”、“實施例3”所制備的基因芯片固相載體上，通過核酸探針末端修飾的活性基團與載體表面相應(yīng)的活性基團反應(yīng)，形成二硫鍵(-S-S-)，將探針固定于載體上，從而制成基因芯片。
同時，在所制備的基因芯片上，每一種核酸探針都有固定的位置，因此在與樣品雜交后，通過對所捕獲陽性信號的尋址即可明確其對應(yīng)的特定核酸探針，從而確定與其對應(yīng)的目標(biāo)DNA序列。實施例5、將本發(fā)明的基因芯片固相載體用于臨床病原微生物診斷在“實施例4”中，如果所述的核酸探針是針對某種病原微生物的，則使用所述的“實施例4”所制備的基因芯片就可以檢測出該病原微生物。如肝炎病毒、性病病原微生物、腹瀉病原微生物、呼吸道致病微生物、耐藥細菌的耐藥基因等。實施例6、將本發(fā)明的基因芯片固相載體用于食品、衛(wèi)生防疫在“實施例4”中，如果所述的核酸探針是針對某種通過消化道傳播的病原微生物的，則使用所述的“實施例4”所制備的基因芯片就可以檢測出該通過消化道傳播的病原微生物。如大腸桿菌、霍亂弧菌、傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌等。實施例6、將本發(fā)明的基因芯片固相載體用于癌癥診斷在“實施例4”中，如果所述的核酸探針是針對癌基因的，則使用所述的“實施例4”所制備的基因芯片就可以診斷出癌癥。實施例7、將本發(fā)明的基因芯片固相載體用于其他疾病診斷在“實施例4”中，如果所述的核酸探針是針對遺傳病基因的，則使用所述的“實施例4”所制備的基因芯片就可以診斷出該遺傳病，如血友病、先天性心臟病等。
權(quán)利要求
1.基因芯片固相載體的制備方法，其特征在于用1％(3-巰丙基)三甲氧硅烷對洗滌干凈的玻璃片、硅片和石英片進行硅化。
2.權(quán)利要求1的基因芯片固相載體的制備方法，其特征在于所制備出的基因芯片固相載體的表面帶有活性巰基(-SH)。
3.按權(quán)利要求1所制備出的、具備權(quán)利要求2所述特征的基因芯片固相載體，通過其表面的活性巰基(-SH)與被修飾有活性巰基(-SH)的核酸探針通過形成二硫鍵(-S-S-)，將核酸探針固定于載體上，從而制成基因芯片。
4.將權(quán)利要求3所述的基因芯片用于臨床病原微生物診斷、食品衛(wèi)生防疫、癌癥和其他疾病的診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的基因芯片固相載體的制備方法。其要點是用一種化學(xué)物質(zhì)對玻璃片、石英片和硅片進行處理，使玻璃片、石英片和硅片表面帶有活性基團，此活性基團與核酸探針上的活性基團反應(yīng)，通過形成二硫鍵將核酸探針固定于固相載體從而制成基因芯片。按本方法制備出的基因芯片可用于臨床病原微生物診斷、食品衛(wèi)生防疫、癌癥和其他疾病的診斷。
文檔編號C12Q1/68GK1475578SQ0212604
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月12日
發(fā)明者王鶴堯, 鄭文婕 申請人:王鶴堯, 鄭文婕