專利名稱：經(jīng)修飾的生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于移植物中的生物相容性材料以及該材料的生產(chǎn)及其應用。
在過去四十年中，替換衰退的或有缺陷的動物(尤其是人)組織(包括器官)已成為臨床醫(yī)學中一種常用的部位療法。這些替換療法的例子有使用聚對苯二甲酸乙酯(商標為DACRON，由Dupont公司生產(chǎn))修復有缺陷的血管、將隱靜脈作為自身移植物用于旁路阻塞的動脈以及將心臟從一人移植給另一人。
由于現(xiàn)代免疫抑制劑能夠以相對少量的成本帶來較高的成功率，器官移植已取得顯著發(fā)展。對器官移植的需求已迅速增加。現(xiàn)在全世界每年要完成20,000個以上器官移植物。但是，按照現(xiàn)今的依據(jù)所作的估計這一數(shù)據(jù)僅代表了需要量的約15％。以現(xiàn)存來源并不能滿足各種類型捐獻器官的供/需比。一個最好的例子可能是對心臟移植的需求。由Barnard于1967完成的第一例心臟移植受到新聞界的廣泛報道。在一年的時間內(nèi)，二十二個國家的六十四個不同的外科小組共完成了101個心臟移植物。由于所得結(jié)果很差，使人們的希望成為泡影，因此，到二十世紀七十年代早期，全世界每年完成的移植物還不到30個。但是，隨著環(huán)孢多肽免疫抑制劑的引入使心臟移植產(chǎn)生革命，現(xiàn)在大部分中心進行的心臟移植中其成功率均在80％以上(且患者存活)。隨著專門技能的獲得，人們有理由期望這一存活率可進一步提高。當然，這一方法的成功增加了人們對它的需求，因此醫(yī)學行業(yè)和公共大眾更加意識到心臟移植提供了一種真正的替代死亡的方法，并且越來越多的患者求助于這一方法?，F(xiàn)在每年完成2,000個以上的心臟移植物。
現(xiàn)在，在心臟移植中最大的死亡危險在于等待得到合適的捐獻器官。雖然人工心臟為這些患者提供了短期支持裝置，而長期的需求則是對于更多的心臟移植物中心和更大的捐獻物供應。盡管可能從心臟移植獲益的潛在個體數(shù)從未被科學地建立起來，但是已公布的要求心臟移植的估算數(shù)字則在每年每百萬人50到250人的廣泛范圍內(nèi)變化，它取決于所選樣的依據(jù)、接受者的年齡以及疾病等等。不管實際數(shù)據(jù)如何，但有一點已是很明確的，即現(xiàn)在捐獻者所提供的可選樣之物不能夠滿足需求。對于腎移植和肝臟移植也存在類似情況，一旦胰或胰島細胞移植成為普遍接受的治療糖尿病的方法，則很可能使得該組織的短缺也成為主要問題。
現(xiàn)在移植療法還存在許多其它缺點。捐獻者的器官并不是在所有情況下都適用于移植，這不僅是因為許多器官捐獻者本人是某些事故(如道路事故)的受害者，而這些事故是通過損傷正要被移植的器官之外的某些其他器官而引起死亡；對于被移植的器官還可能有某些其他損傷或與其相關(guān)的困難。
而且，由于從捐獻者獲得器官的不可預測性，對移植物外科手術(shù)常常不能象常規(guī)手術(shù)那樣提前作出安排(包括預定手術(shù)時間)。經(jīng)常是一旦捐獻器官被鑒定外科小組和醫(yī)院管理人員就不得不開始行動，并且工作時間不固定，從而增加了管理困難和個人團難。
在心臟、肝臟和肺移植物的情況下，如果遇到排斥反應，常常不可能進行再移植，除非在很短的時間內(nèi)偶而得到另一個合適的捐獻物。
除了以上醫(yī)學上的困難外，現(xiàn)在的移植實踐在某些情況下還涉及社會問題，首先，從可能的捐獻者身上摘除器官可能遭到宗教上的反對(尤其是在篤信再生的國家)，當然從死人身上摘取器官還會遇到其他倫理和社會問題，尤其在某些國家需要取得允許。最后，活腎臟捐獻商業(yè)交易的出現(xiàn)正引起關(guān)注(尤其在某些第三世界國家)，社會需要抑制或減少這一交易。
具有以上缺點的常規(guī)移植手術(shù)包括從一特定種屬的動物個體(通常是人)向同一種類的另一個體移植，這種移植稱為同種移植。由于常規(guī)的同種移植物供應存在如上所述困難，因此人們已把注意力放到了在移植中使用異種移植物的可能性上。異種移植是通用于組織(包括細胞和器官)移植的通用術(shù)語，它越過了種屬的障礙。
在替換療法中已經(jīng)有幾個使用異種移植物的成功例子。例如，近年已見報道使用豬組織取代主動脈瓣、用豬皮覆蓋嚴重燒傷的患者以及用臍靜脈作為替代靜脈移植物。但是，所有這些異種移植物都有一個共同點它們僅提供了一種機械取代。所用的組織是無生物學功能的，其原因是存在于人體中的免疫過程立即(在幾分鐘或幾小時內(nèi))摧毀了大部分種屬組織的細胞完整性。這類異種移植物就是所知的相異性異種移植物(discordant xenografts)。
這種極強的破壞作用在系統(tǒng)發(fā)育上是相關(guān)的。因此，來自黑猩猩(一種與人類密切相關(guān)的靈長類動物)的組織能夠以和同種移植物相同的方式在人體中存活；這類異種移植物就是已知的一致性異種移植物(concordont xenograft)。
盡管可能有人想到一致性異種移植物可能為同種移植物所遇到的團難提供解決辦法，但實際上情況可能并非如此。黑猩猩比人小得多，因此黑猩猩的器官通常不夠大，不能在人體內(nèi)工作。對于腎臟，可通過移植兩個黑猩猩腎臟，取代受損的人腎而克服這一問題，但對于肝臟和心臟來說這顯然是不可能的。而且黑猩猩在自然狀態(tài)下繁植緩慢，在捕獲狀態(tài)下也很差，并且對于作為實驗動物的黑猩猩的需要(尤其在研究愛滋病的當今時代)意味著需求再一次超過供給。另外，讓公眾接受使用其它靈長類作為異種移植物供體可能存在某些社會問題。
因此，注意力又重新集中到相異性異種移植物上。人們普遍相信相異性異種移植物如此迅速失敗的原因是受體中存在“天然產(chǎn)生的”抗供體種中還未定義的抗原的抗體〔Shons等，Europ.Surq.Res.526-36(1973)〕這些抗體之所以稱作“天然產(chǎn)生的”是因為在沒有來自供體種的任何免疫攻擊的個體中就已發(fā)現(xiàn)它們的存在。
已有許多資料證明了器官移植物的快速排斥反應——即已知的過急抗體介異的排斥反應。在六十年代初期當(同種移植物)腎移植已成為常規(guī)治療方法時，就已觀察到被移植的腎在手術(shù)還在進行時往往受到受體的排斥。在移植手術(shù)進行過程中，作為規(guī)律腎臟將變紅并在受體和供體血管縫合在一起后不久獲得穩(wěn)定。這種移植物常常馬上產(chǎn)尿。在患者仍在手術(shù)臺上而移植物已被破壞的排斥反應情況下(過急排斥反應)，破壞過程常常在移植后的最初幾分鐘開始。當發(fā)生這一情況時，腎臟變?yōu)閹{色和不調(diào)和，然后充血。該器官的相容性也發(fā)生改變。通常，移植物出現(xiàn)水腫并不再產(chǎn)尿，然后新移植的腎被立即除去?，F(xiàn)已清楚它涉及在受體中預先形成的循環(huán)抗體與供體腎中的抗原之間形成體液介導的免疫應答。在同種移植過程中避免其發(fā)生的唯一方式就是在移植前確保受體中不存在抗供體細胞的任何抗體。隨著檢測這種抗體的知識的增加(即已知的定義配血)，現(xiàn)已認識到受體抗體發(fā)揮作用抵抗供體抗原的這一判斷是錯誤的，并且當涉及同一種屬的個體之間的移植物時過急移植物破壞作用僅限于特定種類抗體的存在，這一情況被稱作T-熱陽性交叉配血(T-WarmPositive cross-match)；而且?guī)缀蹩梢钥隙ㄟ@些抗體屬于IgG亞類。還有，這些抗體的存在總是由于以前存在的免疫過程的結(jié)果，這一前期免疫過程則產(chǎn)生于以前的輸血或妊娠，而最常產(chǎn)生于衰退的前期移植物。
大量的看法認為過急異種移植物排斥反應的機制與上面所述的過急同種移植物排斥反應的機制差不多相同。關(guān)于異種移植物排斥反應機制的文獻是非常廣泛的，可追溯到約83年前。在那時，僅有三本刊物提出了異種移植物排斥反應的機制，但不涉及抗體。該意見認為補體激活的交替途徑(盡管不一定使用這一術(shù)語)卷入了異種移植物的排斥反應。該理論首次出現(xiàn)于1976年Schilling等人的論文中〔Surgery，Gynaecology and Obstetrics 14229-32(1976)〕。該理論在1988年和1989年由Miyagawa等再次提出(相同的數(shù)據(jù)被兩次公布)〔Transplantation 46(6)825-830(1988)及Trahsplantation proceedings 21(1)520-521(1989)〕。但是，由于這些實驗實際上存在同樣的錯誤，因此其結(jié)果并不是令人信服的。作者聲稱所選用的模型為其中不存在跨種屬抗體的異種移植物模型。但是，現(xiàn)已知道用于測定跨種屬抗體的檢測方法是不適當?shù)?，因此這些論文中所得出的結(jié)論是建立在不適當?shù)臄?shù)據(jù)之上的。
現(xiàn)在最常采用的避免或減少異種移植物排斥反應的實驗方法是通過血漿取出法、用眼鏡蛇毒液因子處理法、抗體的葡萄球菌蛋白A吸附法等等，干擾受體免疫系統(tǒng)的化學療法，該方法主要以非特異性為基礎(chǔ)，例如使用環(huán)孢多肽A和其它免疫抑制劑，這一方法自然來自支持同種移植物的化學療法。
本發(fā)明采用了一種根本不同的方法本發(fā)明不是非特異性地干擾受體的免疫系統(tǒng)，它能夠使具有供體移植物作用的材料一起施用，而這種供體移植物則被受體免疫系統(tǒng)的某些成分當作為自身的一部分。在一最佳實施方案中，是將供體組織本身進行修飾，以使受體在某些免疫方面將其當作自身組織。
也已發(fā)現(xiàn)過急異種移植物排斥反應并不一定由抗體介導。這一結(jié)論來自兩個觀察結(jié)果。首先，在缺乏抗體但存在補體的情況下，觀察到過急排斥反應；第二，在存在抗體而缺乏補體的情況下未觀察到過急排斥反應。
本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)在異種移植物的過急破壞過程中補體活化作用非常顯著，而不管這一活化作用是否得到合適抗體分子結(jié)合的幫助。補體交替途徑的激活可被各種細胞產(chǎn)物誘導。這些產(chǎn)物并不限于外部侵入的細胞如細菌或異種移植物，而是存在于許多細胞之上。因此從理論上講一個體的許多細胞能夠激活補體的交替途徑，引起大規(guī)模的自動免疫破壞作用。這一情況之所以沒有發(fā)生是由于在血清中和細胞表面天然存在大量的補體下調(diào)蛋白。這些分子(在本文中稱作“同源補體限制因子)防止了自身補體被自身細胞產(chǎn)物通過經(jīng)典途徑或交替途徑完全激活，從而防止了自身的自動免疫破壞作用。這些分子機能的行使在陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥中得到很好的證明。在該疾病中，至少一種這些分子的膜上錨(加速衰變因子)缺乏。因此，該蛋白質(zhì)不能保留在紅細胞膜上，而與細胞分離，從而激活了補體的交替途徑，發(fā)生細胞溶解，引起血紅蛋白尿癥。
本發(fā)明的目的之一是提供了將動物組織移植給受體的方法，其中該組織得自與受體屬于不同種屬的供體。供體種屬相對于受體為相異性種屬，該方法包括將組織移植給受體并隨該移植組織一起提供一種或多種同源補體限制因子，該因子在受體中具有活性，能夠防止補體的完全激活。
本說明書中所用的“組織”一詞意味著任何能夠被移植的生物材料，包括器官(尤其是心、肺、肝、腎、胰和甲狀腺等體內(nèi)重要器官)、角膜、皮膚、血管及其它結(jié)締組織、細胞(包括血液細胞、造血細胞、胰島細胞、腦細胞以及得自內(nèi)分泌和其它器官及體液(如PPF)的細胞)，所有這些均可用來從一個物種向另一物種移植。
“相異物種”是這樣一個物種，當將從其獲得的異種移植物移植給受體時通常產(chǎn)生過急排斥反應，也就是說排斥反應將在幾分鐘或幾小時內(nèi)產(chǎn)生，而不是在幾天內(nèi)產(chǎn)生(Calne Transplant proc2550，1970)。這種過急排斥反應是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的，它會在移植后24小時內(nèi)、6小時內(nèi)、甚至1小時內(nèi)發(fā)生。
補體及其活化現(xiàn)在已為人們所熟知，并且在Roitt的文章中已有論述(Essential Immunology(Fifth Edition1984)，Blackwell Scientific publications，Oxford)。歸功于補體(C′)的活性取決于九個蛋白質(zhì)成分(C1至C9)依次發(fā)揮作用，其中的第一成分由三個分別被稱作為C1q、C1r和C1s的主要亞片段組成。補體可通過經(jīng)典途徑和交替途徑激活，下面對兩種途徑作一簡要敘述。
在經(jīng)典途徑中，抗體與C1結(jié)合，其C1s亞單位獲得酯酶活性，引起活化并轉(zhuǎn)移到膜上的位點或免疫復合物(首先是C4，然后是2)上的位點。這一復合物具有“ C3轉(zhuǎn)化酶”活性，它在溶液中分裂C3從而產(chǎn)生一小肽片段C3a和剩余分子C3b，它們具有特殊作用。C3a具有過敏毒素活性，并在補體放大級聯(lián)中不再進一步發(fā)揮作用。C3b與膜結(jié)合，并能引起抗原-抗體-C3b復合物的免疫吸附，從而促進隨后的吞噬作用。
在交替途徑中，C3轉(zhuǎn)化酶的活性由C3bB完成，其激活可被外部試劑尤其是象內(nèi)毒素等微生物多糖觸發(fā)，其作用與抗體無關(guān)。轉(zhuǎn)化酶是通過D因子作用于C3b和B因子的復合物而形成。以上形成一個正反饋回路其中C3降解產(chǎn)物(C3b)幫助形成更多的裂解酶。
在經(jīng)典途徑和交替途徑這兩種途徑中，C3b的水平是通過C3b滅活性(因子I)的作用而被維持。C3b很容易與H因子結(jié)合，形成復合物，該復合物被因子I破壞，從而喪失其溶血性質(zhì)和免疫粘連性質(zhì)。
在C3期之后經(jīng)典途徑與交替途徑是相同的。C5被切割為C5a和C5b片段。C5a具有過敏毒素活性，導致多形核白細胞的趨化性。C5b以復合物的形式與C6和C7結(jié)合，在膜上形成一個耐熱點，充實最終成分C8和C9以產(chǎn)生膜攻擊復合物(MAC)。這一環(huán)形結(jié)構(gòu)插入到膜中并從膜上凸出，從而形成一個使電解質(zhì)和水能夠完全滲透的跨膜通道。由于內(nèi)部膠體高滲透壓使鈉離子和水凈流入導致細胞溶解。
可用于本發(fā)明的同源補體限制因子(HCRFS)通常可影響補體激活級聯(lián)的任何一部分。HCRF可能僅影響組成徑典途經(jīng)的那一部分，或者僅影響組成交替途徑的那一部分，而最常見的是影響經(jīng)典途徑和交替途徑的共同部分。優(yōu)選HCRF調(diào)節(jié)劑影響途徑的共同部分。該HCRF可能與天然HCRF相同，或簡單地具有適當作用。合成和半合成的HCRFS(包括通過重組DNA技術(shù)制備的HCRFS及其變異物)均包括在術(shù)語HCRF的范圍之內(nèi)。
如上所述，同源補體限制因子是以減少或防止其溶解活性的方式調(diào)節(jié)補體級聯(lián)作用的物質(zhì)。它們被動物體用來標記自身組織以避免自動免疫反應。在本發(fā)明中，從理論上講HCRF可能是與膜結(jié)合的，也可能游離在血清中，但在實踐中優(yōu)選HCRF與異種移植物組織細胞上的膜結(jié)合。按這種方式HCRF容易與移植物組織“相結(jié)合”。優(yōu)選的HCRFS包括推想的細胞因子，例如C3b/C4b受體(CR1)、C3，dg受體(CR2)、加速衰變因子(DAF)、C3b滅活劑和膜輔助因子蛋白(MCP)。推想的血清HCRF包括H因子、加速衰變因子(DAF)和C4結(jié)合蛋白(C4bp)所有這些HCRFS都是通過影響C3階段來下調(diào)補體活性。阻斷C8的同源限制因子(HRF)也是推想的膜因子。
合適HCRFS的許多基因(但不是所有的)位于RCA(補體活化調(diào)節(jié)劑)位點，它位于染色體1的q32帶〔Rey-Campos等，J.Exp.Med.167 664-669(1988)〕。
盡管對于HCRF的命名和定位存在某些混淆，Rey Campus等(在上述引文中)和在他們的早期研究中〔J.Exp.Med.166 246-252(1987)〕對C4Bp因子、CR1、DAF和H因子進行了鑒定。某些工作者認為膜輔助因子蛋白(MCP)是C4結(jié)合蛋白(C4bp)的同義詞，且這兩個因子要么相關(guān)要么相同Rother和Till〔″The ComplementSystem″，Springer＝Verlog，Berlin(1988)〕在1.2.3.2節(jié)綜述了C3轉(zhuǎn)化酶的調(diào)節(jié)因子；他們將C4結(jié)合蛋白(C4bp)等同于加速衰變因子，將H因子等同于B1H-蛋白和C3b滅活劑加速劑。HCRFs的命名、定位和鑒定無疑將繼續(xù)深入，但應當理解，本發(fā)明包括應用所有合適的HCRFs。
有關(guān)HCRFs的其它資料如下I因子(以前也稱作C3b滅活因子或KAF)Tamura & Nelson(J.Immunol.99 582-589(1967))；H因子Pangburn等(J.Exp.Med.146 257-270(1977))；C4結(jié)合蛋白Fujita等(J.Exp.Med.148 1044-1051(1978))；DAF(也被稱作CD55)Nicholson-Weller等(J.Immunol.129 184(1982))；膜輔助因子蛋白(MCP；也被稱作CD46，最早被稱作gp45-70，后來又稱作gp66/56)Seya等(J.Exp.Med.163 837-855(1986))；
CR1(也稱為CD35)Medof等(J.Exp.Med.1561739-1754(1982))及Ross等(J.Immunol.129 2051-2060(1982))；CR2(也稱為CD21，3d/EBV受體和pl40)Iida等(J.Exp.Med.158 1021-1033(1983))及Weis等(PNAS 81 881-885(1984))。
一些RCA蛋白的組織公布如下CR1膜(有限)紅血細胞；單核細胞；大部分B細胞和某些T細胞；濾泡樹突細胞；腎小球足狀突細胞；多形核白細胞；CR2膜(有限)大部分B細胞；濾泡一樹突細胞；某些上皮細胞及少數(shù)T細胞系；MCP膜(廣)所有的外周血細胞(紅細胞除外)；上皮細胞系；內(nèi)皮細胞系；成纖維細胞系；滋養(yǎng)層及精子；DAF膜(廣)所有外周血細胞；上皮細胞系；內(nèi)皮細胞系；成纖維細胞系；滋養(yǎng)層及精子；C4bp血漿肝臟合成；H血漿肝臟合成；成纖維細胞及單核細胞系。
在膜攻擊復合物水平上進行同源限制中所涉及的蛋白質(zhì)也已預想通過本發(fā)明而加以利用，在蛋白質(zhì)序列的形式上已取得基本一致的看法(但無證據(jù))，即下列65KDa(或左右)蛋白質(zhì)是相同的C8結(jié)合蛋白(Schnermark等 J.Immunol.1361772(1986))；同源限制因子(HRF)(Zalman等Immunology 836975(1986))；
MAC抑制蛋白(MIP)(Watt等(1988))。
C8bp/HRF/MIP蛋白是通過糖脂錨狀物吸附到細胞表面，如同CD59和DAF一樣已知這些蛋白質(zhì)在陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿中是缺乏功能的。
18-20KDa蛋白也與MAC水平有關(guān)，據(jù)使下列蛋白質(zhì)是相同的(但可能不同)P-18(Sugita等(J.Biochen 104 633(1988))；HRF-20(OKada等(Intl Immunol 1(1988)))；CO59(Davies等(J.Exp.Med.(Sept 1989)))；反應性細胞溶解的膜抑制因子(MIRL)(Hologuin等J.Clin.Invest 847(1989))。
推想的這些蛋白質(zhì)的一致性的證據(jù)是CD59和HRF-20所顯示出的蛋白質(zhì)和/或CDNA序列相同，也可能與P-18/MIRL相同。應注意到CD59/HRF.20序列與鼠LY-6抗原序列存在某些同源性，而鼠LY-6抗原涉及T-細胞激活(Gronx等(J.Immunot.1423013(1989)))。
SP-40.40也涉及MAC調(diào)節(jié)(Kivszbaum等EMBO8，711(1989))。
HCRF最好在C3階段干擾補體激活。MCP和DAF均在C3激活的交替途徑中阻斷正反饋回路它們構(gòu)成優(yōu)選的HCRFs。
HCRF是與被移植的組織一起提供的。這意味著HCRF是以這樣一種方式施用，即移植組織被標記為自身，而其它外源物質(zhì)如侵入的細菌則沒有這樣明顯地被標記。通過非腸道，而非局部地將一種或多種合適的HCRFs簡單地施用于移植組織是可能的。但是，從理論上講它是不可取的，因為這將為HCRF適當定位在移植組織上帶來困難，進一步的困難還在于移植發(fā)生后不得不給受體反復施用HCRF，但這可通過使用專家藥品輸送系統(tǒng)來克服。
將HCRF以與供體組織的細胞膜整合的方式提供一般是非常便利的。盡管可能存在被移植組織的良性感染(它可引起適當表達)，但達到這一目的的最佳途徑是供體組織為轉(zhuǎn)基因的，在移植到受體后它含有并表達編碼一個或多個在受體物種中有活性的HCRF的核酸。這種轉(zhuǎn)基因組織可能無限制地表達HCRF。HCRF可通過遺傳方法得自受體物種，也可以得自一個密切相關(guān)的物種(盡管不是優(yōu)選的)，從它有可能獲得一致性異種移植物。
盡管從里論上講轉(zhuǎn)基因供體組織可來自細胞培養(yǎng)，但優(yōu)選的供體組織來自轉(zhuǎn)基因動物。這種轉(zhuǎn)基因動物最好應該至少在被移植的組織中表達(或有能力表達)HCRF。但是，甚至連這也不是必需的，因為通過某些結(jié)合劑(如雜交的單克隆抗體)(Milstein&Cuello Nature 305 537(1983))或受體也可能將HCRF結(jié)合到供體組織的細胞膜上。
受體物種主要是人，但不排除其它的。其它的靈長目及經(jīng)濟和論理所允許的任何其它物種都可能是合適的受體。
供體物種可以是不同于受體物種的任何合適的物種，它能夠針對受體物種的生理提供合適的移植組織。對于人受體來說豬供體被認為是合適的，但任何其它物種也可能是合適的。
本發(fā)明涉及的第二個方面是提供可供移植的供體物種的動物細胞或組織，而這些細胞或組織是與一個或多個在預期受體物種中具有活性以防止補體完全激活的同源補體限制因子相結(jié)合的，相對于受體物種來說該供體物種為相異物種。
本發(fā)明涉及的第三個方面是提供具有可移植組織的轉(zhuǎn)基因動物，它不會對移植進或暴露給至少一個相異物種的免疫系統(tǒng)的異種移植物產(chǎn)生排斥反應。相異物種是通常過急排斥異種移植物于動物的物種。
因此本發(fā)明包括在制備可移植進受體物種的組織的過程中應用得自供體物種的動物組織以及一個或多個在受體物種中具有活性的同源補體限制因子，其中供體物種相對于受體物種來說為相異物種。
本發(fā)明涉及的第四個方面是提供含有能表達另一物種的同源補體限制因子的細胞的轉(zhuǎn)基因動物。該同源補體限制因子通常在相異于轉(zhuǎn)基因動物的物種中具有活性，這些細胞可能具有某一特定組織(優(yōu)選的是象本發(fā)明涉及的第一個方面所述的那樣)，或具有一個以上組織或所有組織，在這種情況下該動物可能成為一個以上組織的供體。這種動物可被認為是非轉(zhuǎn)化(在非繁殖意義上)細胞的集合。
本發(fā)明的第五個方面是提供能夠表達一個或多個同源補體限制因子的非轉(zhuǎn)化動物細胞，而這些同源補體限制因子在相對于動物細胞為相異的物種中具有活性。
本發(fā)明的第六個方面是提供重組DNA，它包括編碼至少一種同源補體限制因子的DNA以及保證該編碼DNA被非轉(zhuǎn)化動物細胞表達的一個或多個序列。該動物細胞可以是遺傳上加進了該構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因動物的細胞?；蛘?，該細胞為培養(yǎng)器官或其它組織，如胰島。
本發(fā)明的第七個方面是提供適合于加到動物的遺傳物質(zhì)中去的遺傳構(gòu)建物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。該構(gòu)建物包括編碼至少一種同源補體限制因子的DNA以及保證該編碼DNA在遺傳上加進了該構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因動物的至少某些細胞中被表達的一個或多個序列。這種構(gòu)建物可能是以極微染色體(已知為YAC)的形式存在。同上，同源補體限制因子將在相對于轉(zhuǎn)基因動物為相異的物種中產(chǎn)生活性。
本發(fā)明的第八個方面是提供制備轉(zhuǎn)基因動物的方法，該方法包括將編碼至少一種同源補體限制因子的DNA以及保證該編碼DNA在至少某些轉(zhuǎn)基因動物細胞中表達的一個或多個序列結(jié)合到動物的遺傳物質(zhì)中。
總的來說生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法正變得越來越廣泛，所采用的具體步驟可以是本領(lǐng)域現(xiàn)今所使用的常規(guī)步驟。例如，WO-A-8800239公開了從理論上構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物所需要的步驟。
將構(gòu)建物加到轉(zhuǎn)基因動物的細胞中去的實際方法可以是通過微量注射、精子介導的加入法或任何其它合適的方法。前期遺傳操作最好是在原核生物中進行。
編碼HCRFs的DNA既可以cDNA形式得到也可用常規(guī)克隆技術(shù)推斷出來。編碼衰變加速因子(DAF)的DNA可能被最佳特征化并已由Medof等人所描述(PNAS 84 2007-2011(1987))。Rey-Campos等人(1988)(在上述引文中)給出了RCA基因群的物理圖譜。DAF變體及其通過DNA重組技術(shù)的制備方法公開于EP-A-0244267；這類變體可用于本發(fā)明。
由于DAF較好的遺傳學特征和編碼DAF的cDNA的已知序列，DAF可構(gòu)成一個優(yōu)選同源補體限制因素。
本發(fā)明第二至第七方面的其它優(yōu)選的特征同第一方面，在細節(jié)上已作必要的修正。
本發(fā)明將通過下列實施例加以說明。在這些實施例中，可參照以下附圖

圖1A至1E示出了實施例1所述的移植到乳豬體內(nèi)的兔心臟的連續(xù)ECG示蹤圖；圖2示出放射免疫測定結(jié)果，表明實施例1中所用的豬沒有明顯數(shù)量的抗物種抗體；圖3示出如實施例4所使用的蛋白質(zhì)電泳的某些階段；圖4示出如實施例4所使用的二維交叉電泳的某些階段；圖5示出實施例4所述的“二維火箭”(2D-Rockets)；圖6示出實施例5中鉻釋放溶胞測定結(jié)果；圖7示出如實施例6所述，在移植前(0天)和移植后第5、7和9天，來自倉鼠心臟移植物的大鼠接受體的溶解性抗倉鼠抗體滴度；圖8示出G200級分的OD值；直方圖表明如實施例6所述，來自倉鼠心臟的大鼠接受體的溶解性抗倉鼠抗體的各級分的滴度；圖9示出如實施例7所述，從T5，b10和DB3細胞系提取出的DNA的Southern印跡；圖10示出51Cr釋放圖，表明在豬抗人抗體存在下，T5人細胞系被兔補體而不是人補體所溶解，如實施例7所述；圖11示出51Cr釋放圖，表明人抗體不能溶解具有人或兔補體的T5人細胞系，如實施例7所述；圖12示出51Cr釋放圖，表明在兔補體或人補體存在下，人抗體可溶解小鼠—小鼠雜交瘤(DB3)，如實施例7所述；圖13示出51Cr釋放，表明在兔補體存在下，人—小鼠雜交細胞系B10被人抗體溶解，但在人補體存在下該細胞系不被人抗體溶解，如實施例7所述；圖14示出CHO細胞對3H腺嘌呤的攝取(以每分鐘計數(shù))，表明在人補體或兔補體存在下，這些細胞被免疫大鼠血清殺傷，如實施例8所述；圖15示出3H腺嘌呤被人MCP所轉(zhuǎn)染的CHO細胞的攝取(以每分鐘計數(shù))，表明在兔補體存在下，這些細胞被免疫大鼠血清殺傷，但在人補體存在下不被該免疫大鼠血清殺傷，如實施例8所述；圖16示出“2D火箭”，表明在描述圖15時所述的情況下，人補體的C3成分不會裂解成C3b，如實施例8所述。
圖17示出51Cr釋放圖，表明3T3鼠成纖維細胞在人補體存在下被溶解以及鼠細胞對人MCP表達的保護作用。
圖18表示使用標記的MCP CDNA或標記的DAF CDNA作為探針對第二代轉(zhuǎn)基因小鼠DNA進行狹槽印跡分析(slot blotanalysis)。
實施例1異種移植物排斥在無任何抗物種抗體存在下發(fā)生一般說來，在沒有循環(huán)免疫球蛋白情況下動物無法生存。這些免疫球蛋白是在對抗原刺激應答中由淋巴細胞產(chǎn)生的。然而，在早期的新生兒生命中，被動轉(zhuǎn)移的母體免疫球蛋白可作為這種自身產(chǎn)生的抗體的暫時替代物，這種被動轉(zhuǎn)移的免疫球蛋白在獲得早期免疫經(jīng)歷的同時為幼小動物提供保護。在哺乳動物中，這種母體免疫球蛋白的被動轉(zhuǎn)移通常經(jīng)胎盤和通過初乳發(fā)生。然而，在幾個物種中，胎盤的結(jié)構(gòu)使得母體抗體不能通過這一途徑轉(zhuǎn)移。豬就是這樣的物種之一。所有母體抗體都是從初乳中獲得。因此，新生哺乳前的豬從理論上講無免疫球蛋白。
取剛出生的大白豬，在不給喂奶的情況下將它們置于用熱水袋溫熱的木籠中。每次實驗從每胎小豬中取兩只豬。這些動物出生時體重約為1kg。
重約300g的新西蘭白兔幼崽用作供體。這些供體用海卜那和安定麻醉，打開胸腔并用一19號針經(jīng)靜脈腔插管。灌注冷(+4℃)心麻痹液(Thomas No.2)直到心臟停止跳動并充滿心麻痹液。也用直接來自注射器的冷心麻痹液從外部冷卻。然后采用標準外科技術(shù)取出兔的心臟并在需要前貯存于+4℃的心麻痹溶液中。已發(fā)現(xiàn)采取這些措施是必要的，因為已證明兔的心臟極易患局部缺血性損傷。
通過吸入氟烷/02初步麻醉受體豬。然后將靜脈內(nèi)蝶形(23號)針插入乳房靜脈，通過靜脈內(nèi)氯胺酮維持麻醉。同時用靜脈內(nèi)鹽水使豬保持水合。移植前抽取血清和EDTA血樣。
在Heron的方法(Acta Pathol Microbiol Scand79 366-372(1971))之后將兔的心臟移植到豬的頸部。主動脈從末端至側(cè)面(6-0 Prolene)與頸動脈交織，肺動脈與頸靜脈交織。所有其它心血管都連接起來。在移去夾鉗后幾分鐘內(nèi)心臟開始跳動。在整個過程中通過透皮玻片/ECG監(jiān)測器監(jiān)測心率。在實驗期間未縫合豬的頸部，通過加蓋抗滑薄膜保持心臟濕潤。
圖1A至1E顯示了ECG結(jié)果。圖1A所示的示蹤圖表明移植后即刻開始正常的心臟跳動。大約20分鐘后(圖1B)心跳開始衰退，1小時之內(nèi)(圖1D)無可測的心臟跳動，表明過急排斥。
因此這一實施例說明即使在無抗體存在下也會發(fā)生相異性異種移植物的過急排斥。
實施例2實施例1中所用的乳豬無抗物種抗體用Davies&Howard改進的(未發(fā)表)Greenwood等人的方法(Biochemical Journal 89 114-123(1963))對兔抗豬IgG進行放射性碘標記。
將下列成分迅速連續(xù)地加到聚苯乙烯試管(LP26Cm×1Cm)中25-50μl蛋白質(zhì)(濃度為1mg/ml)3-4μl Na125I(100mCi/ml)10μl氯胺-T(*4mg/5ml；0.5M)磷酸鈉緩沖液(PH7.5)*必須用前新鮮配制將這些成分連續(xù)攪拌30秒鐘使之混合。然后迅速加入下列物質(zhì)50μlDL-酪氨酸(0.5ml磷酸鈉緩沖液(PH7.5)的飽和溶液)300μl2％BSA/PBS/疊氮化物用以PBS/疊氮化物配制的Sephadex G-25(中級)小柱(8Cm×1.0Cm)將標記蛋白與未反應的碘分離。將碘化反應混合物定量轉(zhuǎn)移到制得的G25柱中并用PBS/疊氮化物洗脫。將6滴級分收集到聚苯乙烯試管(LP2)中。洗脫柱直到蛋白和(125I)碘峰均被洗脫下來，測定所有級分的放射性。
摻入蛋白質(zhì)中的放射性可如此計算蛋白質(zhì)的放射性計數(shù)＝原始總計數(shù)-碘峰的計數(shù)在對乳豬抗體的測定中使用放射性標記IgG(稱之為“同位素”)，見下述材料PBS+0.01％疊氮化物-Oxoid
PBS/BSA1％-BSA-Sigma同位素—兔抗豬IgG全分子，12-18×103計數(shù)/分熱失活血清(56℃ 30分鐘)抗凝血樣。
方法1.制備兔紅血細胞的1％PBS懸浮液并將100μl的量加到試管中。將細胞離心成小團，棄去上清液。
2.由成年豬(陽性對照)，乳豬(試樣)或兔(陰性對照)在PBS/BSA中制備失活血清的系列稀釋物。將0.025ml的量加到紅細胞團中，一式兩份。將試管在4℃下保溫4小時。
3.保溫后，用PBS/BSA洗滌試管3次，然后將0.05ml同位素加到各試管中并于4℃保溫過夜。
4.再洗3次試管并用γ計數(shù)器進行1分鐘計數(shù)。
5.將結(jié)果按計數(shù)的的數(shù)目/分對滴度繪圖。
結(jié)果示于圖2。兔血清用作陰性對照，成年豬血清用作陰性對照?？梢钥闯霾溉榍暗呢i2中豬抗體水平可與陰性對照水平相比。
實施例3補體C3與異種移植物破壞相關(guān)聯(lián)的論證將得自于Burger等人所述的品系(Eur.J.Immunol.167-11(1986))的補體缺乏豚鼠進行心臟移植，所用技術(shù)與在實施例1中對兔至豬異種移植所描述的方法基本相同。大鼠經(jīng)吸入醚而麻醉，用心麻痹冷卻心臟并如前所述切除。用靜脈內(nèi)安定和肌肉內(nèi)海卜那麻醉豚鼠供體。如前所述將心臟植入頸內(nèi)。對于對照豚鼠，即補體水平正常的豚鼠，通常在幾分鐘之內(nèi)發(fā)生移植排斥，因而不必縫合頸部，在實驗動物中，將頸部縫合并每日觸診兩次進行監(jiān)測。在手術(shù)后數(shù)小時內(nèi)觀察到正常ECGs，表明無過急排斥。
實施例4A.豬淋巴細胞和腎細胞可經(jīng)交替途徑激活人補體按照Grabar和Williams的技術(shù)(Biochem BiophysActa 10 193(1953))，將瓊脂糖凝膠1倒在8×8Cm的玻璃板上(圖3)。需要10ml凝膠混合物，該混合物由5ml2％瓊脂糖和5ml巴比妥緩沖液(VB)組成。(VB是75mM巴比妥鈉，10mM EDTA，10mM NaN3，PH8.5。)恰在使用前于60℃下將瓊脂糖和VB混在一起。將凝膠倒在一水平臺面上并冷卻。凝固時，凝膠由1％瓊脂糖組成，其深度約為1.5mm。
從離凝膠一端若1Cm處挖直徑為3mm的孔3。每孔能容納大約8μl待測樣品。樣品除加入足夠溴酚蘭使之著色外未進行特殊制備。點樣后，將凝膠小心放到電泳槽的平臺上。然后沿最靠近孔的凝膠一邊輕輕壓上浸在VB(操作緩沖液)中的棉紗布條，將另一紗布條壓到瓊脂糖的對邊。(確保紗布條的兩端浸泡在緩沖液槽內(nèi)是重要的。)然后使25-30mA的電流通過凝膠直到白蛋白(用結(jié)合溴酚蘭顯現(xiàn))到達正極紗布條。該過程需花大約2.5～3小時。若同時平行操作兩塊或多塊凝膠，則所加電流必須相應增加，以致兩塊凝膠需50mA，三塊需75mA等等。
當電泳完全時，如通過用溴酚蘭顯色的白蛋白標志9的移動所示，從電泳槽中取出凝膠。
B.二維交叉免疫電泳(2D-火箭電泳)切下得自(A)的含有電泳后的蛋白質(zhì)的凝膠條并放在一新玻璃板13的一端。然后將含有約1％抗待顯色蛋白質(zhì)的抗血清的2％瓊脂糖∶VB的1∶1混合物15倒在玻璃板上并使之凝固。當其冷卻至大約50℃時將抗血清加到瓊脂糖/VBS混合物中。
然后如上所述用火箭平板進行電泳，含有第一維條帶的凝膠一端通過棉紗布條與負極17相連，另一端與正極19相連。在取決于凝膠大小的電流下使凝膠電泳過夜；每8Cm長度的凝膠需要10mA，因此16Cm長的凝膠需20mA電流等等。
通過第一維電泳分離蛋白質(zhì)，通過第二維電泳對蛋白質(zhì)進行定量和顯色。下面將描述為進行顯色的染色法。
C.碾壓和染色凝膠這一程序與常規(guī)免疫電泳法或火箭電泳法相同。將待染色的凝膠蓋上一層預先用水潤濕的無纖維POSTLIP(商標)紙AdlardEvans&Co)。然后蓋上6層吸水紙。將該組合件碾壓1小時，然后除去所有的紙并重復這一過程。
在第二次碾壓后，在溫熱的氣流下使凝膠干燥，然后將凝膠在PBS中浸泡至少1小時以除去不沉淀的蛋白質(zhì)。然后再使凝膠干燥，并在0.5％W/V考馬斯亮蘭G250，45％H2O，45％甲醇，10％乙酸的溶液中染色10分鐘。
通過在20％甲醇，6％乙酸中連續(xù)漂洗而使凝膠脫色直到背景清晰為止。然后在溫熱的空氣中最后干燥。
圖5是干凝膠的再制?；鸺?是含有50μl正常人血清(HHS)+25μl包括10m MEGTA在內(nèi)的VBS的陰性對照。EGTA是一種除去鈣的螯合劑；鈣是經(jīng)典途徑補體活化所必需的，因此EGTA的存在可確保補體只能經(jīng)交替途徑激活。左手側(cè)(較大的)峰是C3，右手側(cè)(較小的)峰是C3bi，即活化C3的分解產(chǎn)物。在對照中，少量的C3bi表明只有少量的補體活化。
在火箭2中，將75％的豬紅血球(V/V)加到雞尾酒式緩沖液中。C3bi水平稍有增加，但可能不明顯，從而表明豬紅血球只能通過交替途徑勉強激活人補體。反應差的原因還不清楚。
在火箭3和4中，分別將75％豬淋巴細胞(V/V)或75％豬腎細胞(V/V)加到雞尾酒式緩沖液中。在每種情形下，C3bi水平都有明顯提高，這表明人補體被豬淋巴細胞活化。
實施例5豬淋巴細胞在豬補體存在下不被人抗體溶解，但在兔或人補體存在下被溶解用鉻釋放測定法監(jiān)測在豬補體、幼兔補體或人補體存在下由人血介導的細胞溶解。
材料淋巴細胞分離介質(zhì)-FlowlabsRPMI1640+10％失活FCSPBS(無疊氮化物)-OxOid具V型孔的平板-Sterilin幼兔補體淋巴—血清—凝乳酶—成人或豬補體(用RPMI稀釋1+7)熱失活的血清(56℃30分鐘)方法1.在等體積的Ficoll Hypaque淋巴細胞分離介質(zhì)中加一層用PBS以1∶1稀釋的去纖維化的豬全血。在1200g下于20℃將試管離心30分鐘。
2.移出交界處產(chǎn)生的豬淋巴細胞，在PBS中漂洗一次，將細胞團重新懸浮于RPMI1640中并將細胞計數(shù)調(diào)節(jié)到2×107/ml。
3.將200uCi的51Cr加到2×107細胞團中并于室溫下保溫1.5小時。
4.在900g下用5分鐘將標記細胞洗滌兩次并用RPMI將最終細胞計數(shù)調(diào)節(jié)到1×106/ml。
5.將0.05ml量的以系列稀釋物形式用作試驗的失活血清一式兩份以及對照一起進行制板。將稀釋的補體以0.05ml量加到相應的孔中，然后加入0.05ml標記細胞。于30℃在CO2烘箱中將平板保溫1小時。
6.保溫后，將平板在900g下離心15分鐘以使細胞沉降。將100ul上清液移入標記試管并用γ計數(shù)器進行1分鐘計數(shù)。
7.將結(jié)果以原始標記細胞計數(shù)％對滴度繪圖。
對照完全釋放對照(FRC)-50ul細胞+100ulH2O+0.1％Tween陰性對照-50ul細胞+100ul RPMI補體對照(CC)-50ul細胞+50ul稀釋的補體+50ul RPMI結(jié)果結(jié)果示于圖6?？梢钥闯鲐i淋巴細胞只在非豬(即兔或人)補體存在下被人血清溶解，但在豬抗體存在下不被溶解。結(jié)論是存在于豬細胞上的一種或多種同源補體限制因子可成功地抑制豬補體的作用而不能抑制人或兔補體的作用。
實施例6本實施例的目的是證明抗體可引起過急排斥。由于觀察到過急排斥可在無抗移植物抗體存在下發(fā)生，但需要功能性補體，從而產(chǎn)生了這一作為本申請基礎(chǔ)的概念。因為這是一個新發(fā)現(xiàn)，所以在證實抗體可引起異種移植物排斥的文獻中沒有給出實驗。由于在天然存在抗體存在下難于測定這些抗體是否起某種作用，所以這種實驗不易進行。在本實施例中，通過輸入具有適宜特異性的抗體將同相的異種移植物轉(zhuǎn)變成相異的異種移植物已證明了抗體的作用。在這一研究中所用的接受體是3至6月齡，重250-300g的PVG品系的雄性大鼠(RTIC)(Banting&Kingdom，Bicester，Oxon.，UK)。心臟供體是Syrian倉鼠，也得自Banting&Kingdom，重100-150g。按照Heron的方法進行心臟移植(實施例1中所述文獻)。將倉鼠心臟移植到大鼠的頸內(nèi)，用套管技術(shù)使主動脈與頸動脈連接，肺動脈與頸靜脈連接。所有其它血管都連接起來。打開血管鉗后數(shù)分鐘心臟開始跳動，通過外部觸診進行監(jiān)測。為經(jīng)吸入氟烷和氧氣而麻醉的動物施行全部手術(shù)。
抗倉鼠溶解性抗體水平如下測定將50ul1％倉鼠紅血球溶液加到50ul已進行系列稀釋的試驗血清中。加入50ul1/7幼兔抗體稀釋液(Sera Lab，Crawleg Down，Sussex)并于37℃保溫1小時。加入750ul補體結(jié)合稀釋劑并離心(Beckman MICROFUGE，13000rPm，4分鐘)，然后測定上清液的OD415。(MICROFUGE是商標)。陰性和陽性對照分別為加到1％細胞溶液中的CFD和蒸餾水。將OD415讀數(shù)結(jié)果對X軸上的血清滴度繪圖。從圖7可以看出，將倉鼠心臟移植到大鼠體內(nèi)使大鼠產(chǎn)生極高滴度的溶解性抗倉鼠抗體。使用標準柱層析技術(shù)(“The use of SEPHADEX in theSeparation，Purification and Characerisationof biological materials”，Curling in Exp inPhysiol and Biochem 3(1970)417-484(G.A.Kerkut，Ed.)Academic Press，London andNew York，1970)在SEPHADEXG 200(PharmaciaGB Ltd，London)上進行柱層析將取自某些大鼠的血清分離成其成分蛋白級分。(SEPHADEX是商標)。從柱上收集7ml級分，如上所述對溶解性抗倉鼠活性進行測定。圖8表明盡管這些抗體是由心臟移植所誘導的，但抗物種活性幾乎全部存在于IgM級分中，測定活性之后，用C×10超濾器(Pharmacia)將級分濃縮至0.5mg/ml的濃度并在用前貯存于-70℃下。
為了檢驗它們與只溶解紅細胞相反的破壞異種移植物的能力，將倉鼠心臟移植到首次用來作實驗的大鼠中。倉鼠心臟跳動一經(jīng)建立，就將2ml純凈的血清成0.5mg含有溶解性抗倉鼠抗體的純化兔疫球蛋白靜脈輸注到大鼠體內(nèi)。未分離的血清和0.5mg IgM二者都一致引起倉鼠心臟移植物在15分鐘內(nèi)被破壞。輸注IgG的結(jié)果與某些使移植物喪失功能的制劑不一致，即輸注IgG后心臟移植物繼續(xù)跳動。當將來自G200柱的白蛋白作為對照輸入時，心臟移植物一直存活并在該模型的正常時間(3天)內(nèi)發(fā)生排斥。這說明該抗體與移植物的結(jié)合會引起過急破壞。
實施例7到目前為止在本申請中所示的數(shù)據(jù)已證明異種移植物的破壞可包括通過交替途徑或抗體介導的補體活化(經(jīng)典途徑)。此外，在異種移植物靶表面上的補體調(diào)節(jié)劑可使之不被同源而不是異源補體破壞。兩種補體活化途徑所共有的關(guān)鍵活化步驟是補體C3成分的裂解。這一裂解是由C3轉(zhuǎn)化酶，C4b2a(經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶)或轉(zhuǎn)化酶C3bBb(交替途徑C3轉(zhuǎn)化酶)引起的。這些酶可裂解C3為C3b，反過來C3b又可保證交替途徑形成更多的C3轉(zhuǎn)化酶(反饋回路)。結(jié)果補體系統(tǒng)能夠迅速擴大C3b在“外來”靶上的沉積。然而許多C3b不能成功地與外來靶相互作用而殘留在液相，因而可不加選擇地與宿主細胞結(jié)合。為了使這些細胞兔受補體無選擇結(jié)合的進攻，對照蛋白已發(fā)展到使液相中或結(jié)合于自身組織上的補體成分失活。
在控制C3過程中所涉及的糖蛋白都是在人染色體1中被稱作RCA(補體活化調(diào)節(jié)劑)位點的一個區(qū)域內(nèi)在遺傳上相關(guān)。在本實施例中，發(fā)明人證明已通過融合技術(shù)獲得了人染色體1并可表達其表面上RCA部位的蛋白質(zhì)的小鼠細胞在異種移植物破壞的體外測定中表現(xiàn)得好象它們是人細胞而不是小鼠細胞。
細胞系T5是用Bird等人的技術(shù)(Nature289 300-301(1981))生產(chǎn)的EPsfein Barr病毒轉(zhuǎn)化扁桃體B-細胞系。B10是產(chǎn)生人抗破傷風單克隆抗體的雜交瘤，它是由人B淋巴母細胞系(BLL)與小鼠骨髓瘤細胞系X63-AG8.653融合而衍生的(Kierneyet al.(J.Immunol。123.1548-1550(1979))。T5和B10細胞系可得自MSC Carter and Dr N C Hughes-Jones of theMRC MITI Group at Babraham，Cambridge。DB3是可產(chǎn)生抗黃體酮單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞系(Wright et alNature 295 415-417(1982))。獲得了下列特異于人染色體1的寡核苷酸引物(5′-CCACAGGTGTAACATTGTGT-3′)和(5′-GAGATAGTGTGATCTGAGGC-3′)；這些引物分別在人抗凝血酶2(AT3)基因的上游和下游，已知該基因位于人染色體1上(Wuet alNucl Acids Res 17 6433(1989))。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)合成該寡核苷酸。
用Harrmann和Frischauf的方法(MethodsEnzymol 152 180-183(1987))制備高分子量基因組DNA。簡言之，用5ml TNE(100mm Tris pH7.5，100mM NaCl，100mM EDTA 1％ Sarkosyl)溶解來自各培養(yǎng)細胞系的100×106細胞并用新鮮蛋白酶K(100ug/ml)進行處理。用苯酚(用水飽和并用0.1M Tris，PH8平衡)、苯酚∶氯仿(1∶1，V/V)、然后氯仿∶異戊醇(24∶1，V/V)提取該制劑。通過乙醇沉淀獲得DNA，用NaCl調(diào)至100mM的TE(100mM Tris PH8.0，1mM EDTA)和單獨用T E在4℃下透析。用0.5％瓊脂糖凝膠分析所分離的DNA并由在260nm處的光 密度確定其濃度。如Saiki等人所述(Science 239 487-491(1988))對每種細胞系進行聚合酶鏈反應(PCR)。在含有500ng基因組DNA、1、2ng各種引物及2.5單位TagDNA多聚酶(水生物熱菌3型)(Camkio Ltd，Camkzidgeuk)的100ul體積中使用緩沖液提供該酶。核苷酸(dNTPs)(Boehringer Mannheim Diagnosticsand Biochemicals Lal，Lewis，East Sussex，uK)的濃度各自為2mM。使用程控溫度調(diào)節(jié)器(Genetic ResearchInstrunmentation Ltd，Dunmow，Essex UK)93℃下變性1分鐘55℃下退火1分鐘和72℃下伸展2分鐘擴增DNA30次。用在Tris硼酸EDTA緩沖液中操作的2％瓊脂糖凝膠直接分析10ul反應產(chǎn)物，通過與HincII消化的噬菌體X-174-rf DNA(Pharmacia LKB Biotechnology，Upsala，Sweolen)比較確定產(chǎn)物的大小。
用抗-DAF(衰變加速因子)單克隆抗體(Kinoshita etal(J.Exp.Med 162 75-92(1985))和熒光素結(jié)合第二抗體處理培養(yǎng)的T5，B10和DB3細胞。使細胞(1×106)與小鼠抗-DAF單克隆抗體1A10(IgG2a10ug/ml，于100ul10％FCS0.1％疊氮化物中)。從美國紐約紐約大學醫(yī)療中心M Davitz博士那里獲得了1A10(Kinoshita et al(J.Immunol.136 3390-3395(1986)))?？瞻讓φ帐菃为毜木彌_液。在冰上保溫2小時后，在含有1/100FITC結(jié)合山羊F(ab′)2抗小鼠IG(親合純化的重鏈和輕鏈和所吸附的人IG)(TagoImmunochemicals Inc，Burlingame，California，USA)的100ul緩沖液中將細胞洗滌3次，重新懸浮并在冰上保溫1小時。某些細胞只與第二抗體一起保溫以作為染色對照。由于DB3是分泌IgG1的小鼠細胞系，所以為了消除在染色DB3細胞時出現(xiàn)抗IgG1反應性還使用預先用等體積DB3細胞吸附的山羊抗小鼠IG或FITG結(jié)合綿羊抗小鼠IgG2A(1/40)將所有細胞用200ul緩沖液廣泛洗滌并重新懸浮。使用用于熒光激活細胞分類(FACS)分析的Beckton Dickinson FACS-STAR儀檢測DAF陽性細胞。(FACS-STAR是商標。)用PCR法測定人染色體1是否存在于三種不同的培養(yǎng)細胞系，T5(人)，B10(人—小鼠)和DB3(小鼠—小鼠)中。圖9示出擴增后T5和B10二者都有495堿基對的譜帶，而DB3(即小鼠—小鼠雜交細胞)根本無譜帶。根據(jù)導用AT3引物得到的PCR產(chǎn)物由2個等位基因組成，大小為572堿基對(等位基因1)和496堿基對(等位基因2)Wu et al，在上述引文中)。見于T5和B10基因組DNA的譜帶相當于等位基因2。這表明人—小鼠雜交細胞系B10含有人染色體1。
對DAF存在的FACS分析表明大多數(shù)人T5細胞(85.7％)用抗-DAF單克隆抗體染色呈陽性。類似水平(83.1％)的陽性細胞見于小鼠/人雜交B10細胞。小鼠—小鼠雜交DB3細胞對抗—DAF處理的制劑和未處理的制劑顯示出相同的染色圖形。然而，若(1)使用FITC結(jié)合綿羊抗小鼠IgG2a或(2)用DB3細胞預先吸附上述山羊抗小鼠IgG，則可消除這種抗小鼠IgG1反應性。結(jié)果表明人—小鼠雜交細胞系B10可表達細胞膜表面上的人DAF，這可用特異性抗—DAF單克隆抗體加以檢測。其表達水平與人細胞系T5的表達水平相同。小鼠—小鼠雜交瘤細胞系不能表達人DAF。
如上面實施例5所述，對這些細胞系進行鉻釋放胞毒細胞殺傷研究。圖10表明，當將豬抗人抗體與T5人細胞系一起保溫時，加入兔補體后使細胞溶解，而當加入人補體時不發(fā)生細胞溶解，當然，這是因為T5細胞系會具有人HCRFS。這是對實施例5結(jié)果的驗證。當將人抗體用于人細胞系時，用人補體或用兔補體都不發(fā)生細胞溶解，這表明沒有自動抗體。鉻釋放技術(shù)不允許保溫持續(xù)足夠長的時間以檢測任何顯著水平的人細胞對兔補體的交替途徑活化(圖11)。然而，當將人抗體與DB3小鼠—小鼠雜交瘤細胞系一起保溫(圖12)時，用兔補體和人補體均可殺傷細胞，這表明人補體確實可在這種測定中發(fā)揮功能。當使用具有人染色體1并已知至少可表達DAF的B10人—小鼠雜交細胞時，兔補體引起細胞系溶解，而人補體不引起細胞系溶解(圖13)。對此的解釋是由于小鼠—人雜交細胞上具有染色體1而得以表達的人HCRFS抑制了人補體的活性。
實施例8前一實施例表明具有染色體1可防止異種移植細胞破壞。這是強有力的間接證據(jù)以證明可使小鼠細胞免受異種移植物破壞的是CRA部位。本實施例將提供正式證據(jù)。在本實施例中，可證實用人MCP轉(zhuǎn)染非人細胞系并使之經(jīng)受人或兔補體作用的效果。
按Lublin等人所詳述的方法(J.EXP.Med.168181-194(1988))生產(chǎn)MCP的CDNA。用表達質(zhì)粒SFFV neo，按Fuhlbrigge等人所述的技術(shù)(ProcNatl.Acad.Sci.85 5649-5653(1988))進行轉(zhuǎn)染細胞系的構(gòu)建。其包括形成Friend脾病灶病毒5′長末端重復(SFFV.LTR)(Clark and nak(Nucl.Acids.Res 10 3315-3330(1982))和(Proc Natl Acad.Sci.80 5037-5041(1983)))。細胞系得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301Parklanin Drive，Rockville，Maryland，USA)。所用細胞系是CHO-K1(ATCC CCL61)和NIH/3T3(ATCCRL1658)。用抗MCP的單克隆抗體(Andrews et al Ann Hum Genet 49 31-39(1985))和已述的FACS分析證實其基因的表達在某些情況下，用標準技術(shù)通過FACS的細胞分類選出高水平表達MCP的細胞系。
本實施例說明用MCP轉(zhuǎn)染CHO細胞的效果。因為這些細胞系長成單層，所以如de Bono等人所述(Immunology 32221-226(1977))通過末端腺嘌呤攝取測定法對細胞殺傷情況進行估價。簡言之，該測定法包括在平底無菌96孔平孔平板中將細胞培養(yǎng)物與補體和抗體一起保溫。在實驗保溫期末，通過培養(yǎng)物攝取放射性腺嘌呤的能力估價細胞存活性?；钚约毎麑z取腺嘌呤，死細胞則不行；因此活細胞計數(shù)高，死細胞計數(shù)低。
同許多轉(zhuǎn)化細胞一樣，CHO對天然存在的抗體和補體交替途徑的作用不敏感。然而，這些細胞對已證明可引起實施例6所述的倉鼠心臟異種移植物破壞的抗體是敏感的。由于CHO細胞得自于倉鼠，所以這些抗體殺傷具有人和兔補體的CHO細胞(圖14)。當用人MCP轉(zhuǎn)染CHO細胞時，細胞只能在兔補體存在下溶解。由于人MCP存在于倉鼠細胞系的表面而抑制了人補體(圖15)。細胞未被殺傷實際上是由于C3轉(zhuǎn)化酶的缺乏這一看法的證據(jù)是在CHO細胞保溫之后通過如上面實施例4所述的火箭免疫電泳分析人C3的分解所提供的。可以看出，僅在對照水平上補體未發(fā)生裂解(圖16)。
這些資料進一步證實在非入細胞表面上的遺傳工程補體抑制蛋白質(zhì)可使那些細胞不受過急異種移植物破壞機制的影響，該機制的共同特征是需要補體C3成分的裂解。
實施例9
實施例9接實施例8的步驟，用編碼MCP(MCP克隆K5。23)的CDNA轉(zhuǎn)染3T3鼠成纖維細胞。如實施5所述向細胞中加入51Cr ，然后將1份體積的該細胞與1份體積的熱滅活的人補體和1份體積的于4℃被鼠脾細胞預先吸收以從人補體中除去抗鼠抗體的人補體一起保溫，將該混合物及其補體系列稀釋液鋪板，鉻釋放檢測的一般條件和特點如圖5所述。從克隆5.23得到的結(jié)果示于圖17，它也表明，作為對照MCP CDNA的作用從反方向介入(在此情況下它不被轉(zhuǎn)錄)。正確轉(zhuǎn)錄的MCP CDNA保護細胞免受殺傷，這一點由相對低水平的51Cr釋放所證實，而非轉(zhuǎn)錄CDNA不能提供顯著的保護作用，這一點可由相對較高水平的51Cr釋放所證實。
實施例10對于用DAF的CDNA轉(zhuǎn)染的L1/210細胞(小鼠白血病細胞系)可以獲得與上面實施例8所述相似的結(jié)果。DAF的CDNA生產(chǎn)方法如Lublin&Atkinson所述(Ann.Rev Immunol.735-58(1989))。
實施例11如上面實施例8所述，制備MCP的CDNA并與SFFV.neo連接。
使用這種DNA制劑，按Manipulating the MouseEmbryo，A Laboratory Manual by B.Hogan etal Colcl Spring Harbour Laboratory(1986)中所述的方法生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)移小鼠。通過腹膜內(nèi)注射5單位得自妊娠馬的血清促性腺激素(市售產(chǎn)品為Folligon)，48小時后，腹膜內(nèi)注射5單位來自人妊娠尿的絨膜促性腺激素(市售產(chǎn)品為Chorulon)使10～15只3-4周齡雌性小鼠(CBA×B10)f1超數(shù)排卵。在注射Chorulon當天，讓雌鼠與(CBA×B10)F1雄鼠交配，次日用頸部脫位法處死塞有陰道栓的雌鼠并從其輸卵管中分離出受精卵。
用這種方法分離出的300-400個卵含有兩個在放大400倍的Nomarski差示干擾對照鏡片下清晰可見的原核。向兩個原核之一中注射大約2000拷貝濃度為0.5～2ng/ml含有MCPCDNA轉(zhuǎn)移基因的DNA制劑。
將微量注射后存活的卵再植入(CBA×B10)F1雌鼠的輸卵管中，該雌鼠在前一夜已與切除了輸精管的雄鼠交配，因此出現(xiàn)假孕(即，它們已排卵并且其激素狀態(tài)呈妊娠狀態(tài)，但其卵母細胞并未受精)。在微量注射的當天或當卵處于二細胞期時的第二天，將約30個經(jīng)微量注射的卵轉(zhuǎn)移到每只麻醉的假孕雌鼠的輸卵管中，結(jié)果是正常妊娠并由10個母體內(nèi)生出17只小鼠。
通過狹槽吸印法和/或Southern吸印法(見實施例8)，以及PCR，來自尾部皮膚細胞的DNA分析，采用32P-標記的探針和識別轉(zhuǎn)移基因的引物篩選后代。后代之一(雄鼠)證明發(fā)生了MCP DNA序列的基因轉(zhuǎn)移。
實施例12重復實施例11的步驟，所不同的是用如實施例10所述的DAF的CDNA代替MCP的CDNA。從10個母體內(nèi)生出23個后代。其中3只小鼠(兩只雌鼠，一只雄鼠)發(fā)生了DAF基因轉(zhuǎn)移，如Southern吸印法所示。
實施例13將得自實例11含有人MCP CDNA轉(zhuǎn)移基因的雄性鼠培養(yǎng)至成年并與(CBA×B10)F1雄鼠交配，生出11個子鼠。使用標記的人MCP CDNA作為探針通過slot-blot分析法對每個后代的尾部細胞DNA進行篩選，以測定轉(zhuǎn)移基因是否被遺傳。所得結(jié)果示于圖18上半部分?？梢钥闯鲎哟?、1、5、7、8和10已接受遺傳。(使用四個對照人DNA(H)；鼠DNA(M)；與10pg人MCP標記的CDNA混合的鼠DNA；與100pg人MCP標記的CDNA混合的鼠DNA〕。
實施例14.
將得自實例12含有人DAF CDNA轉(zhuǎn)移基因的雄性小鼠培養(yǎng)至成年，并與(CBA×B10)F1雄鼠交配，便用標記的人DAF CDNA作為探針通過slot-blot分析法對每一個產(chǎn)生的子代進行尾部細胞DNA進行篩選，以測定轉(zhuǎn)移基因是否被遺傳。所得結(jié)果示于圖18的下半部分。可以看出，子代13.3(雌性)接受遺傳〔采用四個對照人DNA(H)；鼠DNA(M)；與10pg人DAF標記的CDNA混合的鼠DNA；與100pg人DAF標記的CDNA混合的鼠DNA〕
權(quán)利要求
1.一種將動物組織移植到接受體中的方法，其中該組織得自于不同于接受體物種的供體，供體物種是與接受體相異的物種，該方法包括將組織移植到接受體中，與所移植的組織聯(lián)合提供一種或多種在受體物種中有活性的同源補體限制因子(HCRFS)以防止補體的完全活化。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中組織是一種器官。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中器官是心、肺、肝、腎，胰或甲狀腺。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中組織包括血液或造血細胞，胰島，腦細胞或來自內(nèi)分泌器官的細胞。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中HCRF可干擾經(jīng)典和交替途徑二者所共有的補體活化級聯(lián)的那部分。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中HCRF是天然HCRF。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中HCRF可調(diào)控C3處的補體活化。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中HCRF是或具有下列物質(zhì)的活性因子I(以前也稱為C3b失活劑或KAF)，因子H；C4結(jié)合蛋白；DAF(也稱為CD55)；膜輔助因子蛋白(MCP，也稱為CD46，首次描述為gp45-70，進而稱為gp66/56)；CR1(也稱為C36/C46受體或CD35)；和/或CR2(也稱為CD21，C3.dg受體，3d/EBU受體和p140)。
9.權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其中HCRF具有天然HCRF的活性，天然HCRF的基因位于RCA(補體活化調(diào)節(jié)劑劑)部位，即染色體1圖譜的g32帶處。
10.權(quán)利要求5所述的方法，其中HCRF可調(diào)控C8和/或C9處的補體活化。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中HCRF是或具有下列物質(zhì)的活性C8bP(也稱為HRF或MIP)；P-18(也稱為HRF-20，CD59或MIRL)；或SP40.40。
12.權(quán)利要求1-11任一項所述的方法，其中HCRF是與膜結(jié)合的。
13.權(quán)利要求1-12任一項所述的方法，其中以將其與供體組織上的細胞膜相結(jié)合的方式提供HCRF。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中供體組織是發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的，它含有并當植入接受體時，表達編碼一種或多種在受體物種中有活性的HCRF的核酸。
15.權(quán)利要求1-14任一項所述的方法，其中接受體物種是人。
16.權(quán)利要求1-15任一項所述的方法，其中供體物種是豬。
17.得自于供體物種的動物組織和一種或多種在接受體物種中有活性的同源體補限制因子在制備可植入接受體物種的組織中的應用，其中供體物種是與接受體物種相異的物種。
18.一種制備基因轉(zhuǎn)移動物的方法，該方法包括將編碼至少一種同源補體限制因子的DNA和一種或多種能使編碼DNA得以在基因轉(zhuǎn)移動物的至少某些細胞中表達的序列摻入某種動物的遺傳物質(zhì)中。
全文摘要
一般說來，來自一個物種的動物組織只能在兩個物種同相時移植到另一物種中；否則，會發(fā)生超免疫排斥，在本發(fā)明中，供體組織被修飾，例如經(jīng)基因轉(zhuǎn)移，以表達或與一種或多種稱為同源補體限制因子(HCRFS)的物質(zhì)結(jié)合，這些物質(zhì)在接受體物種中有活性以防止補體的完全活化和因之發(fā)生的排斥。本發(fā)明部分基于補體活化交替途徑，而不是經(jīng)典途徑負責過急相異異種移植物排斥的發(fā)現(xiàn)。
文檔編號C12R1/91GK1491624SQ02130249
公開日2004年4月28日 申請日期1990年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月12日
發(fā)明者戴維·詹姆斯·吉拉哈姆·懷特, 阿蘭·弗萊德里克·威廉姆斯, 弗萊德里克 威廉姆斯, 戴維 詹姆斯 吉拉哈姆 懷特 申請人:艾姆特蘭有限公司