專利名稱：一種克隆無(wú)動(dòng)物成分的人胚胎干細(xì)胞的方法
一背景技術(shù)：
狀況第一個(gè)未分化的小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ES細(xì)胞)系是1981年，英國(guó)劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman將延遲附植的胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，從4-6天的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離而得。1994年，Wheeler和Robert等分離獲得了豬的ES細(xì)胞。直到1998年美國(guó)威斯康星大學(xué)Thomson和以色列Rambam醫(yī)學(xué)中心ItskovitxEldor等從人體外受精囊胚中分離到了ES細(xì)胞。同年約翰霍普金斯大學(xué)的Shamblott等從人原始生殖細(xì)胞中分離獲得人的全能性干細(xì)胞。1997年英國(guó)科學(xué)家應(yīng)用核移植克隆胚胎技術(shù)，培育出了世界上第一只體細(xì)胞克隆綿羊-多利。此技術(shù)的成功極大的促進(jìn)了克隆人胚胎干細(xì)胞研究。ES細(xì)胞具有全能性，且增殖能力強(qiáng)、分化潛力巨大，可在體內(nèi)外定向誘導(dǎo)分化為各種細(xì)胞、組織和器官，用于替代、修復(fù)病損的細(xì)胞、組織和器官。治療目前不能治療的許多疾病。近期的美國(guó)《科學(xué)》雜志上列出了2002年值得關(guān)注的六大熱門科技領(lǐng)域，干細(xì)胞研究位于首位，未來(lái)?yè)屨忌茖W(xué)制高點(diǎn)的將會(huì)是干細(xì)胞組織工程技術(shù)。
自上世紀(jì)90年代以來(lái)，科學(xué)家開(kāi)展ES細(xì)胞分離與定向培養(yǎng)方面的研究發(fā)現(xiàn)不論是來(lái)自于動(dòng)物或人類的ES細(xì)胞，在體外都能定向分化為各種細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝臟和胰島細(xì)胞等。ES細(xì)胞可在體內(nèi)外誘導(dǎo)分化為機(jī)體所有的組織和器官需要的干細(xì)胞。干細(xì)胞功能新概念的形成和新技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，將為血液病、心血管病、惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病以及其它需要組織修復(fù)和干細(xì)胞移植治療的疾病帶來(lái)新的治療希望?？墒怯捎贓S細(xì)胞來(lái)源困難及在體外分化誘導(dǎo)中不易控制，因而影響了采用ES細(xì)胞作為細(xì)胞和組織修復(fù)治療的前景。
細(xì)胞、組織、器官移植性治療是個(gè)性治療的原則，異種、同種異體干細(xì)胞用于臨床會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。其主要原因是組織相容性復(fù)合體(MHC)不同。因此干細(xì)胞的來(lái)源與數(shù)量是細(xì)胞治療最關(guān)鍵的問(wèn)題，干細(xì)胞組織工程技術(shù)的發(fā)展和完善，將使人們能用上自己基因的干細(xì)胞或干細(xì)胞衍生的新組織器官，來(lái)替代病變或衰老的組織和器官，治療目前不能治療的多種疾病。所以，目前開(kāi)發(fā)一種能提供相同組織特異性的人胚胎干細(xì)胞的技術(shù)勢(shì)在必行。為此克隆人自體基因的ES細(xì)胞誘導(dǎo)定向目的干細(xì)胞分化移植治療，或克隆人組織、器官工程是解決細(xì)胞、組織移植治療的根本，是21世紀(jì)國(guó)際研究焦點(diǎn)。
目前國(guó)際上有牛、兔、綿羊類ES細(xì)胞系培養(yǎng)成功的報(bào)道。韓國(guó)報(bào)道采用牛卵作為人體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞，可以得到人胚胎干細(xì)胞。我國(guó)的中山醫(yī)科大學(xué)陳系古教授等先后使用“核移植”技術(shù)將人類皮膚細(xì)胞核移植到家兔卵母細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)2000多次試驗(yàn)，成功克隆出100多個(gè)人類胚胎，其中部分發(fā)育到“桑椹胚”階段。采用牛卵和兔卵作為受體細(xì)胞克隆人ES細(xì)胞，雖然存在卵細(xì)胞來(lái)源相對(duì)豐富，易于獲取等優(yōu)點(diǎn)。但用動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞克隆的人胚胎干細(xì)胞含有動(dòng)物成份，用于人類疾病的治療有一定危險(xiǎn)。
本發(fā)明建立了一種用人體細(xì)胞，經(jīng)與人卵母細(xì)胞的核置換構(gòu)建自體基因的人胚胎干細(xì)胞克隆技術(shù)。該方法首先建立人體細(xì)胞系，將體細(xì)胞核移植到去核的人卵母細(xì)胞中，在體外將胚胎細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)育至囊胚。這些胚胎干細(xì)胞及其衍生的細(xì)胞和組織進(jìn)行自體移植，移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。該發(fā)明有助于患者病變組織及其功能的重建，對(duì)人類治療性克隆研究的貢獻(xiàn)將是巨大的。
二、申請(qǐng)專利技術(shù)1、建立克隆人關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)。
2、構(gòu)建人自體基因的胚胎干細(xì)胞克隆技術(shù)平臺(tái)。
三、建立該技術(shù)的目的和意義1、提供構(gòu)建與人個(gè)體基因型相同的人胚胎干細(xì)胞方法，為細(xì)胞及基因治療提供“材料”來(lái)源。人胚胎干細(xì)胞具有全能性，且增殖能力強(qiáng)、分化潛力巨大，可在體內(nèi)外定向誘導(dǎo)分化為各種細(xì)胞、組織和器官，用于替代、修復(fù)病損的細(xì)胞、組織和器官?？梢哉f(shuō)該技術(shù)是一座金橋，只有通過(guò)它，其他技術(shù)才可以通向理想完善的彼岸。該技術(shù)為以下臨床治療性研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)第一人胚胎干細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)分化為所需的特定干細(xì)胞后，直接用于臨床移植治療皮膚病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液病等多種疾病。
第二用干細(xì)胞攜帶治療基因，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化為成體細(xì)胞，用于治療遺傳性疾病。
第三利用干細(xì)胞的跨系統(tǒng)分化潛能，用于自體組織和器官的修復(fù)，可以避免同種異體移植的免疫排斥反應(yīng)。
第四建立經(jīng)遺傳改構(gòu)的通用型MHC基因型胚胎干細(xì)胞系或度身定做一個(gè)與受者M(jìn)HC同型的ES細(xì)胞系。以供患者任意選用。
第五ES細(xì)胞可作為基因打靶的靶細(xì)胞，借助基因打靶技術(shù)，可定點(diǎn)整和外源基因，對(duì)與人類疾病相關(guān)的基因進(jìn)行遺傳改造，尋找治愈疾病的新途徑。
第六建立包含多種MHC基因型的胚胎干細(xì)胞庫(kù)，以滿足不同患者的需求。
第七將干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，與可降解支架材料聯(lián)合培養(yǎng)，在體外構(gòu)建有生命的種植體，修復(fù)組織缺損或再生組織和器官。
第八建立干細(xì)胞庫(kù)，用于將來(lái)自體病損或衰老組織器官的修復(fù)，也可經(jīng)配型后，用于同種異體組織或器官的修復(fù)等。
2、構(gòu)建人胚胎干細(xì)胞為克隆人的關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)以下方法可獲得克隆人(1)獲得所需克隆者的體細(xì)胞，將其作為供體核的來(lái)源；(2)獲得志愿捐獻(xiàn)者的卵母細(xì)胞；(3)去掉卵母細(xì)胞的核；(4)通過(guò)顯微注射的方式將供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至去核卵母細(xì)胞中；(5)經(jīng)電融合、激活融合細(xì)胞；(6)體外培養(yǎng)融合細(xì)胞至桑葚胚(7)將4胚胎細(xì)胞、桑葚胚或囊胚移植到志愿者體內(nèi)，使之發(fā)育成胎兒(倫理、法律允許方可進(jìn)行)。
根據(jù)上述，可以明顯看到本發(fā)明的最大優(yōu)勢(shì)在于采用此技術(shù)可提供自體基因的人胚胎干細(xì)胞，為克隆人組織和器官無(wú)排斥反應(yīng)移植治療技術(shù)奠定基礎(chǔ)。為科研和臨床治療性研究提供充足的材料。在體外ES細(xì)胞可定向誘導(dǎo)分化為人體所需要的全新的、無(wú)免疫異原性的細(xì)胞、組織和器官，用來(lái)取代病變的細(xì)胞、組織、器官，可避免移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，治療目前不能治療的許多疾病，展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。
四、方法步驟克隆人胚胎干細(xì)胞技術(shù)主要包含以下步驟1、制備人供體細(xì)胞，建立細(xì)胞系。用于核移植的體細(xì)胞可獲自供體各種細(xì)胞和組織，制備的供體體細(xì)胞系包括人皮膚細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞、等。體細(xì)胞系是指將體細(xì)胞培養(yǎng)傳代后應(yīng)用。外周血淋巴細(xì)胞是理想的細(xì)胞類型，細(xì)胞易于分離獲得。從外周血分離出的單個(gè)核細(xì)胞可直接用作供體細(xì)胞，也可在體外培養(yǎng)24小時(shí)后，用作供體細(xì)胞體細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)通過(guò)胰蛋白酶處理后，用含10％-15％人臍血血清(AB型)和100U/L青霉素-100μg/L鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
如供體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，則按以下步驟制備供體細(xì)胞。抽取供者外周靜脈血5ml，每毫升血用肝素(500U/ml)30μl抗凝，在抗凝血中加入等量生理鹽水充分混勻，然后用尖吸管沿管壁徐徐加入等量淋巴細(xì)胞分層液(比重為1.077)，離心2000rpm/min，20min，用尖吸管吸取淋巴細(xì)胞層，置于Hank’s液的試管中，混勻后，1000-1500rpm/min，離心10min，棄上清，將細(xì)胞懸浮于2ml Hank’s液中再洗滌2次。用含15％人臍血血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)，作為核供體的來(lái)源。
以表皮細(xì)胞作為供體細(xì)胞時(shí)，取供者皮膚小塊先放置于0.02％EDTA中在室溫條件下作用5分鐘；然后置入0.25％胰蛋白酶中冷消化(4℃)過(guò)夜后，分離皮塊，用鑷子把真皮和表皮分開(kāi)，取出表皮用剪刀剪成小塊，置新的胰蛋白酶中，37℃消化30-60分鐘，用吸管反復(fù)輕輕吹打，使成細(xì)胞懸液，通過(guò)80目不銹鋼沙網(wǎng)過(guò)濾后，低速離心，吸棄上清，沉淀中加入Eagle液和15％臍帶血血清，制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h-72h，也可繼續(xù)傳代后，作為核供體。
2、促排卵，采集人卵母細(xì)胞經(jīng)技術(shù)處理后，獲得去核的卵母細(xì)胞。自愿捐獻(xiàn)卵細(xì)胞者自月經(jīng)周期21天開(kāi)始注射達(dá)必佳0.1mg，注射7天后改半量，直到注射HCG；月經(jīng)來(lái)潮第3-5天(因病人具體情況而定)每天注射果納芬2-3支，直到注射HCG。當(dāng)卵泡發(fā)育至16-18mm，有1-2個(gè)時(shí)，注射HCG1000單位后11-12小時(shí)在陰道B超監(jiān)視下，用15G的穿刺針，從卵巢濾泡中抽吸卵泡液，置于含有IVF2.0培養(yǎng)介質(zhì)的平皿中，培養(yǎng)4-6小時(shí)，使卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。然后優(yōu)選出存在極性小體、胞質(zhì)均勻、周圍有足夠數(shù)量的丘細(xì)胞層的處于分裂中期II階段的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞(因?yàn)榇穗A段的細(xì)胞能被足夠活化，所以可用于核移植)。將優(yōu)選出的細(xì)胞放在35ml平皿內(nèi)，用TCM199清洗介質(zhì)洗3次。
經(jīng)過(guò)用透明質(zhì)酸酶(1毫克/ml)處理后，在TCM199清洗介質(zhì)中通過(guò)用物理方法即反復(fù)用內(nèi)徑為140-180微米玻璃吸管移液的方法，去掉卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，然后用TCM199清洗介質(zhì)清洗剝脫了的卵母細(xì)胞，再將它們移入含TCM199培養(yǎng)介質(zhì)和細(xì)胞松弛素B(7.5ug/ml)溶液中5分鐘后，準(zhǔn)備去核。采用微移液管吸住卵母細(xì)胞，另外用顯微針穿刺透明帶以得到一個(gè)裂口，從此裂口處用微吸管吸取去掉極性小體和周圍的胞質(zhì)。即吸取極體和極體近區(qū)的胞質(zhì)1/5-2/5，以得到去核的卵母細(xì)胞，清洗去核卵母細(xì)胞，并且在含15％臍血血清的TCM199培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。
另外，應(yīng)用偏振光光源，在顯微鏡下去除極體和胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)，可得到去核的受體卵母細(xì)胞。
3、將供體細(xì)胞核移入去核的人卵母細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)激活，在體外發(fā)育成自體基因的胚胎干細(xì)胞。在把供體細(xì)胞核注射進(jìn)受體卵母細(xì)胞前，用含15％臍血血清的TCM199清洗介質(zhì)清洗去核的卵母細(xì)胞后，把它們移到細(xì)胞松弛素B的溶液中，用顯微注射針吸取體細(xì)胞核，從透明帶裂口處，把體細(xì)胞核注入去核的受體卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)邊上。在電融合介質(zhì)(含甘露醇0.3M、0.1mmol/L CaCL2、0.1mmol Mg2SO4、)中使用電融合儀(BTX ECM2001)，用間隔1秒每次80-120微秒的120-140伏/厘米的兩次直流電脈沖使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)電融合，融合后的細(xì)胞通過(guò)在6-DMAP洗2次后，放入6-DMAP(6-DMAP 2.5mmol/L 15％人臍血血清的TCM199)溶液中被激活，在含有15％人臍血血清的TCM199介質(zhì)中37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)激活的細(xì)胞。
4、融合細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育成胚胎、桑椹胚、囊胚。激活后的融合細(xì)胞在體外適宜的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中(TCM-199+15％臍血血清，37℃，5％CO2)培養(yǎng)2-13天，使細(xì)胞分裂成2胚胎細(xì)胞至桑椹胚或囊胚。
5、建立胚胎干細(xì)胞系。將桑椹胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞用2.5％胰蛋白酶在4℃-37℃消化1-6小時(shí)，獲得單個(gè)胚胎干細(xì)胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，建立人ES細(xì)胞系。此干細(xì)胞系可進(jìn)一步定向誘導(dǎo)發(fā)育成人體各種組織干細(xì)胞，用于臨床病人的細(xì)胞生物治療和體內(nèi)外培養(yǎng)克隆細(xì)胞、組織和器官的研究和臨床治療。
6、自體基因胚胎干細(xì)胞的確認(rèn)取人胚胎干細(xì)胞采用PCR-STR9位點(diǎn)測(cè)序分析構(gòu)建的自體基因的胚胎干細(xì)胞與供體基因的差異。
現(xiàn)在提供以下實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1制備供體細(xì)胞。抽取供者外周靜脈血5ml，每毫升血用肝素(500U/m1)30μl抗凝，在抗凝血中加入等量生理鹽水充分混勻，然后用尖吸管沿管壁徐徐加入等量淋巴細(xì)胞分層液(比重為1.077)，離心2000rpm/min，20min，用尖吸管吸取淋巴細(xì)胞層，置于Hank’s液的試管中，混勻后，1000rpm/min，離心10min，棄上清，將細(xì)胞懸浮于2ml Hank’s液中再洗滌2次。用含15％人臍血血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24h，作為核供體的來(lái)源。
制備受體卵母細(xì)胞。自愿捐獻(xiàn)卵細(xì)胞者自月經(jīng)周期21天開(kāi)始注射達(dá)必佳0.1mg，注射7天后改半量，直到注射HCG；月經(jīng)來(lái)潮第3-5天注射果納芬2-3支每天，直到注射HCG。當(dāng)卵泡發(fā)育至16-18mm，有1-2個(gè)時(shí)，于晚上2100時(shí)注射HCG1000單位，隔日上午8點(diǎn)在陰道B超監(jiān)視下，用15G的穿刺針，從卵巢吸取卵泡液，置于含有IVF2.0培養(yǎng)介質(zhì)的平皿中，培養(yǎng)4-6小時(shí)。然后篩選有極體、均勻的胞質(zhì)并且周圍有足夠數(shù)量的丘細(xì)胞層的卵母細(xì)胞，放在35ml平皿內(nèi)，用TCM清洗介質(zhì)洗3次。經(jīng)過(guò)用透明質(zhì)酸酶(1mg/ml)處理后，在TCM199清洗介質(zhì)中通過(guò)用物理方法即反復(fù)用極細(xì)玻璃吸管移液的方法，去掉卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，然后把它們移入含TCM199培養(yǎng)介質(zhì)和細(xì)胞松弛素B的溶液中。采用顯微操作器械吸住卵細(xì)胞，另外用顯微針穿刺透明帶后，從卵母細(xì)胞中去掉部分包括第一極體的胞質(zhì)，即吸取極體和極體近區(qū)的胞質(zhì)1/5-2/5，以得到去核的卵母細(xì)胞，作為受體細(xì)胞。
在把供體細(xì)胞核注射進(jìn)受體卵母細(xì)胞前，用TCM199培養(yǎng)介質(zhì)清洗去核的卵母細(xì)胞后，用顯微注射針吸取體細(xì)胞核，從透明帶裂口處，把體細(xì)胞核注入去核的受體卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)邊上。在電融合介質(zhì)中使用電融合儀(BTX ECM2001)，用間隔1秒每次80-120微秒的140伏/厘米的兩次直流電脈沖使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)電融合，融合后的細(xì)胞在含有10％人臍血血清的TCM199清洗10次，6-DMAP溶液洗2次后，放入6-DMAP(6-DMAP 2.5mmol/L15％人臍血血清的TCM199)溶液中1.5-2小時(shí)被激活，在含有15％人臍血血清的TCM199清洗介質(zhì)中37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)激活的細(xì)胞。融合細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞發(fā)育成2胚胎細(xì)胞、桑椹胚、囊胚。胚胎干細(xì)胞系的建立是將桑葚胚或囊胚的內(nèi)細(xì)胞層用2.5％胰蛋白酶在4℃-37℃消化1-6小時(shí)，獲得單個(gè)胚胎干細(xì)胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
五、使用該專利技術(shù)所能產(chǎn)生的積極效果該發(fā)明提供了成熟的體細(xì)胞核移植構(gòu)建自體基因的胚胎干細(xì)胞技術(shù)。此技術(shù)的成功，為采用自體基因的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行臨床治療性研究提供充足的材料；為克隆人組織和器官無(wú)排斥反應(yīng)移植治療技術(shù)奠定基礎(chǔ)；胚胎干細(xì)胞在體外可定向誘導(dǎo)分化為人體所需要的全新的、無(wú)免疫異原性的各種細(xì)胞、組織和器官，用來(lái)取代病變的細(xì)胞、組織、器官，可避免移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，治療目前不能治療的許多疾病(如血液病、艾滋病、腫瘤等)，展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景，將對(duì)醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生極大的推動(dòng)作用，并且會(huì)產(chǎn)生明顯的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。
權(quán)利要求
1.一種克隆無(wú)動(dòng)物成分的人自體基因胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a、制備人供體細(xì)胞；b、采集卵母細(xì)胞培養(yǎng)；c、去掉卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，穿刺卵母細(xì)胞透明帶以得到裂口，從該裂口處去掉極性小體和周圍的胞質(zhì)，得到去核的卵母細(xì)胞；d、將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞內(nèi)；e、融合細(xì)胞經(jīng)過(guò)激活后體外培養(yǎng)發(fā)育成桑椹胚、囊胚；f、將囊胚細(xì)胞消化獲得單個(gè)胚胎干細(xì)胞，建立胚胎干細(xì)胞系，其特征是所述的卵母細(xì)胞是通過(guò)對(duì)志愿者促排卵，采集人卵母細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是促排卵，采集人卵母細(xì)胞。捐獻(xiàn)者自月經(jīng)周期21天開(kāi)始注射達(dá)必佳0.1毫克，注射7天后改半量，直到注射HCG，月經(jīng)來(lái)潮第3-5天每天注射果納芬2-3支，直到注射HCG，當(dāng)卵泡發(fā)育至16-18毫米，有1-2個(gè)時(shí)，注射HCG1000單位。注射后11-12小時(shí)在陰道B超監(jiān)視下，采用穿刺針，從卵巢濾泡中抽吸卵泡液，置于含有培養(yǎng)介質(zhì)的平皿中，培養(yǎng)4-6小時(shí)，使卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，然后優(yōu)選存在極性小體、胞質(zhì)均勻、周圍有足夠數(shù)量的丘細(xì)胞層的處于分裂中期II階段的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，將優(yōu)選出的細(xì)胞放在平皿內(nèi)，用TCM199清洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是構(gòu)建的人胚胎干細(xì)胞基因完全來(lái)自于供體細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是所述的步驟c卵母細(xì)胞的去核是優(yōu)選的卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)透明質(zhì)酸酶處理，在含10％臍血血清的TCM199清洗介質(zhì)中通過(guò)反復(fù)用內(nèi)徑140-180微米玻璃吸管移液的方法，去掉卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，然后用TCM199清洗介質(zhì)清洗，再將它們移入含TCM199培養(yǎng)介質(zhì)、DMSO和細(xì)胞松弛素B溶液中5分鐘，采用微移液管吸住卵母細(xì)胞，用顯微針穿刺透明帶以得到一個(gè)裂口，從該裂口處用微細(xì)管吸取極性小體和周圍的胞質(zhì)，即吸取極體和極體近區(qū)的胞質(zhì)，以得到去核的卵母細(xì)胞，清洗去核卵母細(xì)胞，并在TCM199培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是吸取的極體近區(qū)胞質(zhì)的為胞質(zhì)總量的20-40％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是步驟a中制備的供體細(xì)胞系主要為外周血中的淋巴細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是優(yōu)選的供體細(xì)胞為在體外分離獲得的淋巴細(xì)胞或經(jīng)過(guò)24小時(shí)1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞。
8.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是體細(xì)胞系通過(guò)傳代培養(yǎng)、冷凍方法儲(chǔ)存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是所述的體細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液中不含動(dòng)物血清，主要為RPMI1640加10％-20％人臍血血清和100U青霉素-鏈霉素，在37℃，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是步驟d中激活是在融合介質(zhì)中使用電融合儀，用間隔1秒每次80-120微秒的120-140伏/厘米的直流電脈沖使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)電融合，融合后的細(xì)胞通過(guò)在6-DMAP洗2次，放入6-DMAP溶液中激活，在含有10％人臍血血清的TCM199清洗介質(zhì)中37℃，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是所述的電融合介質(zhì)中含0.3M/L甘露醇、0.01mmol/L CaCl2、0.1mmol/LMg2SO4。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是融合細(xì)胞的體外培養(yǎng)是在含15-20％人臍血血清和100U青霉素-鏈霉素的TCM199培養(yǎng)介質(zhì)中，置37℃，5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)2-3天，使細(xì)胞分裂成2胚胎細(xì)胞至桑椹胚或囊胚。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆人胚胎干細(xì)胞的方法，其特征是步驟f胚胎干細(xì)胞系的建立是將桑葚胚或囊胚的內(nèi)細(xì)胞層用2.5％胰蛋白酶在4℃-37℃消化1-6小時(shí)，獲得單個(gè)胚胎干細(xì)胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將人體細(xì)胞核與人卵母細(xì)胞核置換克隆胚胎干細(xì)胞技術(shù)，包含以下主要步驟采集制備人供體細(xì)胞；促排卵，取卵；脫卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞；人卵母細(xì)胞核與人體細(xì)胞核置換；核置換后的人卵母細(xì)胞激活和體外培養(yǎng)發(fā)育到囊胚技術(shù)。本發(fā)明是克隆與人供體基因相同的胚胎干細(xì)胞技術(shù)，同時(shí)也是克隆人的關(guān)鍵技術(shù)?？寺〉呐咛ジ杉?xì)胞無(wú)任何動(dòng)物成分，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)可建立胚胎干細(xì)胞系，定向誘導(dǎo)分化為人體各種干細(xì)胞，為應(yīng)用干細(xì)胞治療、克隆組織和器官等臨床治療性研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)控制克隆人技術(shù)的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1483817SQ0213072
公開(kāi)日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2002年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月18日
發(fā)明者李建遠(yuǎn), 王海燕, 劉運(yùn)祥, 劉雪霞, 靳韶華 申請(qǐng)人:李建遠(yuǎn)