專利名稱：棉花幾丁質酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域中幾丁質酶及其編碼基因與應用，特別是來源于棉花的幾丁質酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
植物體能啟動一系列防御基因以抵抗病原的侵害，其中包括一大類能編碼病理(PR)相關蛋白的基因，目前已經證實病理相關蛋白幾乎存在于所有的植物體內，其中幾丁質酶是一個重要的家族。幾丁質酶(EC3.2.1.14)是一種糖苷酶，能夠催化幾丁質的水解反應。研究發(fā)現，幾丁質并不存在于高等植物體內，它是很多真菌細胞壁的主要成分。植物在受到病原菌侵害或者其他因素(如乙烯、水楊酸、重金屬、傷害等等)的激發(fā)后，幾丁質酶的水平和活性會大大提高(Collinge，D.B.，Kragh，K.M.，Mikkelsen，J.D.，Nielsen，K.K.，Rasmussen，U.and Vad，K.(1993)Plant J.3，31-40.；Berglund，L.，Brunstedt，J.，Nielsen，K.K.，Chen，Z.，Mikkelsen，J.D.and Marcker，K.A.(1995)Plant Mol.Biol.27，211-216.；Wu，S.，Kriz，A.L.andWidholm，J.M.(1994)Plant Physiol.105，1097-1105.；Cordero，M.J.，Raventós，D.and Segundo，B.S.(1994)MPMI 7，23-31.；Hong，J.K.，Jung，H.W.，Kim，Y.J.and Hwang B.K.(2000)Plant Sci.159，39-49.)。
通常情況下，這種誘導過程會伴隨著β-1，3-葡聚糖酶和其他一些病理相關蛋白水平和活性的同時提高，從而激發(fā)植物體更有效地進行防御。體外實驗已經證明了純化的幾丁質酶能夠抑止細胞壁含幾丁質的真菌的生長，尤其是與β-1，3-葡聚糖酶協(xié)同作用時效果更明顯(Melchers，L.S.，Groot，M.A.，van der Knaap，J.A.，Ponsyein，A.S.，Sela-Buurlage，M.B.，Bol，J.F.，Cornelissen，B.J.C.，ven den Elzen，P.J.M.and Linthorst，H.J.M.(1994)Plant J.5，469-480.)。在提高幾丁質酶表達量的轉基因植物中也證明了幾丁質酶的抗病作用(Broglie，K.，Chet，I.，Holliday，M.，Cressman，R.，Biddle，P.，Knowlton，S.，Mauvais，C.J.and Broglie，R.(1991)Science 254，1194-1197.；Zhu，Y.，Maher，E.A.，Masoud，S.，Dixon，R.A.and Lamb，C.J.(1994)Bio/technology 12，807-812.)。
迄今為止在植物中已經發(fā)現了很多種幾丁質酶，它們在結構、酶活以及細胞定位上都有很大的區(qū)別。根據它們氨基酸一級結構的特點，它們被分為六類(如圖1中的B部分所示)。Class I幾丁質酶N端含一段幾丁質結合區(qū)(CBD)，緊接著一段富含甘氨酸和脯氨酸的交連區(qū)，以及一段催化區(qū)。多數class I幾丁質酶定位于液泡中。ClassII幾丁質酶與class I幾丁質酶在序列上有60％的同源性，但缺乏CBD區(qū)和交連區(qū)，它們通常是酸性幾丁質酶，定位在細胞間質中。Class III幾丁質酶與class II幾丁質酶結構相似，但與class I和class II沒有同源性。Class VI類似class I，包含CBD、交連區(qū)和催化區(qū)，但序列中在4個位點有缺失，因此比class I短一些。ClassV與class I非常相像，但它N端含2個CBD。Class VI幾丁質酶與其他植物幾丁質酶沒有同源性，相反它與細菌的幾丁質酶同源性較高。
棉花是一種非常重要的經濟作物，但它受很多病害的威脅，其中一個最嚴重的病害是由Verticillium dahliae引起的黃萎病。在棉花中已經克隆到了class I和classII幾丁質酶基因。棉花class I幾丁質酶基因(Goshi；Chil；1，Goshi；Chil；2 andGoshi；Chil；3)能夠被乙烯誘導，而棉花class II幾丁質酶基因(Chi2；1 and Chi2；2)則被水楊酸誘導。本發(fā)明發(fā)明人以前的工作已經發(fā)現，用水楊酸處理棉花幼苗能夠提高棉苗對黃萎病的抗性。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供棉花的一種幾丁質酶及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的棉花幾丁質酶名稱為GhChia7，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由325個氨基酸殘基組成的蛋白質。
本發(fā)明所提供的棉花幾丁質酶GhChia7的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列1的DNA由1469個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第192到第1169位堿基。
利用可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的編碼幾丁質酶GhChia7的基因導入植物細胞，可獲得抗病的轉基因細胞系及轉基因植株。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種組成性啟動子或組織特異性啟動子或誘導型啟動子；為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。攜帶有本發(fā)明幾丁質酶GhChia7基因的表達載體可通過常規(guī)生物技術方法導入植物細胞，被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明基因可應用于植物的抗病育種，特別抗真菌病害的基因工程育種，尤其是棉花抗枯黃萎病的基因工程育種。本發(fā)明基因的發(fā)現不僅對培育抗逆植物品種，特別是培育抗病植物品種，提高農作物產量具有重要意義，而且還為進一步闡明幾丁質酶在植物、特別是棉花中的抗病以及在發(fā)育過程中的作用提供了新線索。
圖1為六類幾丁質酶氨基酸結構示意圖。
圖2為GhChia7的核苷酸和氨基酸序列。
圖3為GhChia7蛋白與已報道的幾丁質酶的多序列比對圖。
圖4為GhChia7蛋白于其他植物幾丁質酶的進化關系。
圖5為Northern雜交結果。
具體實施例方式
實施例1、GhChia7的克隆及一級結構特征將陸地棉(Gossypium hirsutum)的低酚品系(中棉所13)棉種在25℃下培養(yǎng)，待植株的真葉初露時，用不同濃度水楊酸溶液進行噴霧處理，對照組用ddH2O噴灑處理。處理后用塑料薄膜密封以保濕，12小時后再重復處理一次，12小時后取子葉提取總RNA。另一組棉苗用7.5mM水楊酸處理，分別在處理6小時、12小時、18小時、24小時和36小時后摘取子葉提取總RNA。其他材料還包括健康的未處理過的棉苗子葉、莖、根和成株的5天的纖維。
用異硫氰酸胍法(Salzman，R.A.，Fujita，T.，Zhu-Salzman，K.，Hasegawa，P.M.and Bressan，R.A.(1999)Plant Mol.Biol.Rep.17，11-17.)提取總RNA并測量總RNA在260nm和280nm下的吸光度(Gene Spec III，Naka Instruments Co.，Ltd)以確定純度和濃度。
通過差異顯示PCR(DD-PCR)從棉花子葉總RNA中克隆到一系列受水楊酸誘導的cDNA片段，其中一條511bp的cDNA片段編碼的多肽與擬南芥中的class I幾丁質酶有很高的同源性，但5’端缺失。為了克隆這個基因的全長，發(fā)明人采用了普通PCR與生物信息學方法相結合的策略。通過與植物EST數據庫中的序列進行Blast比對，發(fā)現了一段來自于棉花7天纖維的cDNA片段(F1)與已有的片段有95％的同源性。這條837bp片段的5’端比已有的序列更完整。用F1重復比對過程并將得到的來自于棉花的高同源性(＞95％)的cDNA片段繼續(xù)進行比對，拼接出一條包含起始密碼的全長序列。利用這條預計的序列設計了引物并通過常規(guī)PCR克隆到這個基因的全長cDNA，并命名為GhChia7。測序結果表明GhChia7有1469bp，包括5’端非編碼區(qū)(UTR)191bp，開放閱讀框架(ORF)978bp和3’端非編碼區(qū)300bp，最后以poly A結尾。相應的核DNA序列分析結果揭示核基因中含兩個內含子(分別長445bp和521bp)和三個外顯子(1-397bp，843-1002bp和1536-1956bp)，兩個內含子序列均富含A+T(分別為67.9％和63.8％)，5’端和3’端都具有典型的GT和AG序列，其結構如圖1中的A部分及圖2所示，A圖中(1)(2)分別代表GhChia7蛋白和基因的結構。在大多數幾丁質酶中高度保守的并且對催化活性非常重要的NYNYG序列已經用陰影標出，多聚腺苷酸信號序列AATAA位于基因的3’端。圖2中起始密碼和終止密碼用陰影標出，多聚腺苷酸信號序列AATAA用框標出，黑三角所在的位置代表N-信號肽可能的剪切位點。NYNYG序列用黑色方塊標明，其中下劃線注明的是關鍵殘基Y。兩個內含子的位置如箭頭所示。在終止密碼下游56bp處有普遍存在的多聚腺苷酸信號序列(AATAA)。GhChia7編碼的多肽有325aa，預計的分子量為36.2kD，等電點為6.34。與蛋白質數據庫中的序列進行比對，發(fā)現GhChia7與已經報道的Class I和Class II幾丁質酶同源性較低(-30％左右)，但它們的催化區(qū)是高度保守的(如圖3中的A和B部分所示)。GhChia7與Class III植物幾丁質酶同源性相對更低(如圖3中的C部分及圖1的B部分所示)。此外，在GhChia7的催化區(qū)中發(fā)現了一個高度保守的區(qū)域NYNYG，如圖2及圖3的A部分所示。盡管GhChia7的催化區(qū)與Class I和Class II幾丁質酶同源性很高，但它不含Class I幾丁質酶典型的幾丁質結合區(qū)和交連區(qū)，也比Class II幾丁質酶更長(如圖1的B部分所示)，與其他類型的幾丁質酶同源性很低。通過對GhChia7的序列進一步分析發(fā)現，它的N端包含一段24aa長的疏水序列(如圖1的A部分及圖2所示)，在C端它缺少液泡導向肽(如圖1的B部分所示)，而多數class I幾丁質酶是定位于植物細胞的液泡中的。
如圖4所示，進化樹分析更清楚地表明了GhChia7在進化過程中與其他類型幾丁質酶的親緣關系，進化樹所需要的序列全部來自于SWISS-PROT蛋白數據庫中的幾丁質酶蛋白全長序列。圖中，At擬南芥，P19171；At2P19172；Bn蕓苔，Q06209；Bn2Q09023；Bv甜菜，P42820；Bv2P36910；Ca鷹嘴豆，P36908；Cs黃瓜，P17541；Dj山藥，P80052；Gh棉花，Q39799；Hv大麥，P11955；LcLycopersiconchilense(Solanum chilense)，Q40114；Le西紅柿，Q05538；Le2Q05540；Le3Q05539；Nt煙草，P08252；Nt2P29059；Nt3P17514；Nt4P17513；Nt5P29060；Nt6P29061；Os水稻，P25765；Os2P24626；Pa小豆，P29024；Ph矮牽?；?，P29021；Ps豌豆，P36907；Ps2P21226；Pt白楊，P16061；Pv云豆，P06215；Pv2P27054；St馬鈴薯，P05315；Tc可可，Q41596；Vv葡萄，P51613；Vv2P51614；Zm玉米，P29022；從進化樹中可以看出，GhChia7處于一個相對獨立的分枝上。
實施例2、Northern雜交顯示GhChia7 mRNA的組織分布及水楊酸的誘導表達總RNA在65℃下變性后用1.2％甲醛變性膠進行電泳，隨后轉移到尼龍膜上(HybondTM-N+，Amersham Pharmacia Biotech)。雜交在55℃條件下進行(RobbinsScientificModel 1000)，所用的DNA探針用辣根過氧化物酶(HRP)標記(North2SouthDirect HRP Labeling and Detection Kit，Pierce)。雜交完畢后在55℃下用2×SSC，0.1％SDS溶液洗膜3次，每次5分鐘，隨后用在室溫下用2×SSC洗膜3次，每次5分鐘。
Northern雜交結果表明GhChia7 mRNA在健康的未處理過的棉花中的組織分布具有高度特異性，在棉苗的莖中GhChia7 mRNA沒有表達，而在5天纖維和棉苗的根中GhChia7mRNA的水平非常高，相比之下在子葉中GhChia7 mRNA有微量的積累(如圖5中的A部分所示)。幾丁質酶在植物抗病害中的作用已經得到廣泛的認識，它能直接催化水解真菌細胞壁中的幾丁質從而抵御真菌對植物的侵害。由于植物的根暴露在土壤之中，它是植物中最易受到病原菌侵染的器官之一，因此植物的根必須需要一系列復雜的防御機制來保護它們。已有研究發(fā)現在根瘤中幾丁質酶可起到保護受外來病原菌侵染部位的作用，甚至可它可能保護整個根不受根瘤菌的攻擊。此外，在煙草，擬南芥和其他很多植物的根中也發(fā)現了高水平的幾丁質酶mRNA，因此在棉苗的根中檢測到大量GhChia7 mRNA是意料之中的。GhChia7幾丁質酶定位于細胞間質中，它在抵御病原菌侵害的過程中很可能還有另外一個非常重要的作用，即在細胞外建立第一道保護屏障充當早期的防御反應，同時，它還能通過釋放出降解產物幾丁質寡聚體來活化胞內的幾丁質酶以及啟動其他一些防御反應。
在5天棉纖維中也檢測到了高水平的GhChia7 mRNA，是迄今為止首次在棉纖維中發(fā)現的幾丁質酶。已往的研究發(fā)現幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶在一些特定的組織中表達水平很高，例如幾丁質酶SK2在馬鈴薯花柱的子房中富集，水稻中class I幾丁質酶基因OsChial；175也主要在花中表達。GhChia7除了能夠在棉纖維形成關鍵階段保護纖維細胞外，還可能具有在棉纖維形成過程中促進細胞壁松弛的活性。此外deJong曾提出，幾丁質酶的降解產物幾丁質寡聚體很可能也是一種能夠啟動植物發(fā)育過程的信號(de Jong，A.J.，Heidstra，R.，Spanik，H.P.，Hartog，M.V，Meijer，E.A.，Hendriks，T.，Loschiavo，F.，Terzi，M.，Bisseling，T.，van Kammen，A.and de Vries，S.C.(1993)Plant Cell 5,615-620.)。發(fā)明人的實驗結果以及過去的研究都證明，雖然在植物體內幾丁質酶能夠受病原菌侵染或其他條件誘導，但它們在健康的植株中也具有組織分布特異性，說明植物幾丁質酶的作用不僅僅局限于防御反應中，它們很可能也參與了植物的發(fā)育過程。
水楊酸已經被認為可能在植物的系統(tǒng)獲得抗性(SAR)和過敏反應(HR)中扮演信號分子的角色，并且在植物防御反應中起到非常重要的作用。在不同植物中越來越多的實驗證據表明水楊酸與幾丁質酶有著非常密切的關系。如圖5的B部分所示，Northern雜交結果表明水楊酸能夠誘導高水平的GhChia7 mRNA，并且當水楊酸濃度達到7.5mM時GhChia7轉錄物水平最高。當水楊酸濃度從0到7.5mM升高時，誘導的mRNA水平也相應升高；水楊酸濃度超過7.5mM時誘導的mRNA水平迅速下降。說明水楊酸與幾丁質酶之間并不是簡單的對應關系，其中必定有一定的機制來調節(jié)誘導過程。此外，如圖5的C部分所示，在用7.5mM水楊酸處理后，處理18小時后誘導的mRNA水平最高，18小時后開始下降。以上結果充分說明GhChia7基因的表達受水楊酸的誘導，而早期研究又表明水楊酸可誘導棉花幼苗對黃萎病害的抗性，由此可以推斷GhChia7在棉花幼苗抗黃萎病害中發(fā)揮重要作用。
序列表<160>2<210>1<211>1469<212>DNA<213>棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>1catttaacca ttgctcaaaa acacaccact ggcttgtaga acgccatgaa atagaccttc60gatctaacac ctttcctttt catttcccct ttccttaaaa acaagctcaa tcaattcccc120cattaaccct aaacgaaaat cagctgaaaa aaaaaccatt tatttttctt cagctctaag180cgacaacaac aatggctgac ttcaagaaag ccactgcttt gattctcaca gtggctttgc240ttgtgaatct cgctttaatg gttgatgctg atggtgatga tgataagaag attcgagtca300ggaaacataa gggtgagaag cagtgtatac aaggatggga atgttcctac tggtcgaaat360attgttgcaa caaaacggtt tcagatgtct tccaggttta tcaatttgag gacctgtttg420ctaaaaggaa ttcgccggtg gctcatgctg ttggattttg ggattaccat tcttttattt480tggctgcttc catttatgag cctttgggtt ttgggactac tggtggtaag cgtatgcaaa540tgaaggaagt cgcggctttt cttgcacatg tcggcgccaa gacatcttgt ggagatggtg600tcatagacgg aggaccgttg gcatggggtc tttgcttcaa gagagaaatg agtcctagcc660aggattactg tgatgattac tacaaataca tgtatccatg tgcccctgga gctcaatact720atggccgtgg tgctttgcca atttactgga actacaacta tggagctgct ggcgatggta780taaaagttga tttgttgcac caccctgagt atctcgagca gaacgcaact attgctttcc840aggccgccat ctggaggtgg atgaccccaa tcaagaagaa ccaaccttca gcacacgaca900ttttcgtggg caactggaaa ccaaccaaga acgacacaga ggaaaaacgg ggtcctactt960ttggctccac catgaacgtt ctctacggag attacacttg cgggcaaggc gatattgatc1020ccatgaacat catcatctcc cattaccttc attaccttga cttactaggt gtcgggcgag1080aggaagcagg gccacacgag gagctaagct gtgccgagca gaaagcattc aacccaaccc1140cagctccacc tgctgccagt gcttcctaat ctttggttca gccaatttca ttgttaaaat1200gtagttgtca atgaagggta atttaataag agagctggca attaggttgt tgtaaaatca1260tggtctatgt cggtgtgaga aaagggccca tcaatttcat gatattatat atagttatat1320acgtttgatt tgttgctgtt aggcggtctt tattatttgc attttgcgtg cgtgtagatt1380ttgatatatt tgatgcttgt tgtgctgtcc acgacattca tataaaattg tatgtattga1440accaccattt ttattcgaaa aaaaaaaaa 1469<210>2<211>325<212>PRT<213>棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>2Met Ala Asp Phe Lys Lys Ala Thr Ala Leu Ile Leu Thr Val Ala5 10 15Leu Leu Val Asn Leu Ala Leu Met Val Asp Ala Asp Gly Asp Asp20 25 30Asp Lys Lys Ile Arg Val Arg Lys His Lys Gly Glu Lys Gln Cys35 40 45Ile Gln Gly Trp Glu Cys Ser Tyr Trp Ser Lys Tyr Cys Cys Asn50 55 60Lys Thr Val Ser Asp Val Phe Gln Val Tyr Gln Phe Glu Asp Leu65 70 75Phe Ala Lys Arg Asn Ser Pro Val Ala His Ala Val Gly Phe Trp80 85 90Asp Tyr His Ser Phe Ile Leu Ala Ala Ser Ile Tyr Glu Pro Leu95 100 105Gly Phe Gly Thr Thr Gly Gly Lys Arg Met Gln Met Lys Glu Val110 115 120Ala Ala Phe Leu Ala His Val Gly Ala Lys Thr Ser Cys Gly Asp125 130 135Gly Val Ile Asp Gly Gly Pro Leu Ala Trp Gly Leu Cys Phe Lys140 145 150Arg Glu Met Ser Pro Ser Gln Asp Tyr Cys Asp Asp Tyr Tyr Lys155 160 165Tyr Met Tyr Pro Cys Ala Pro Gly Ala Gln Tyr Tyr Gly Arg Gly170 175 180Ala Leu Pro Ile Tyr Trp Asn Tyr Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Asp185 190 195Gly Ile Lys Val Asp Leu Leu His His Pro Glu Tyr Leu Glu Gln200 205 210Asn Ala Thr Ile Ala Phe Gln Ala Ala Ile Trp Arg Trp Met Thr215 220 225Pro Ile Lys Lys Asn Gln Pro Ser Ala His Asp Ile Phe Val Gly230 235 240Asn Trp Lys Pro Thr Lys Asn Asp Thr Glu Glu Lys Arg Gly Pro245 250 255Thr Phe Gly Ser Thr Met Ash Val Leu Tyr Gly Asp Tyr Thr Cys260 265 270Gly Gln Gly Asp Ile Asp Pro Met Asn Ile Ile Ile Ser His Tyr275 280 285Leu His Tyr Leu Asp Leu Leu Gly Val Gly Arg Glu Glu Ala Gly290 295 300Pro His Glu Glu Leu Ser Cys Ala Glu Gln Lys Ala Phe Ash Pro
305 310 315Thr Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ser Ala Ser320 32權利要求
1.棉花幾丁質酶GhChia7，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的幾丁質酶，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質。
3.棉花幾丁質酶GhChia7的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于所述棉花幾丁質酶GhChia7的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框為自5’端第192到第1169位堿基。
6.含有權利要求3所述基因的表達載體。
7.含有權利要求3所述基因的細胞系。
8.權利要求3所述基因在培育抗病植物品種中的應用。
9.權利要求3所述基因在培育抗逆植物品種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棉花幾丁質酶及其編碼基因與應用，本發(fā)明所提供的棉花幾丁質酶名稱為GhChia7，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。本發(fā)明所提供的棉花幾丁質酶GhChia7的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發(fā)明基因的發(fā)現不僅對培育抗逆植物品種，提高農作物產量具有重要意義，而且還為進一步闡明幾丁質酶在植物抗病以及發(fā)育過程中的作用提供了新線索。
文檔編號C12N5/04GK1485425SQ0213126
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月23日 優(yōu)先權日2002年9月23日
發(fā)明者劉進元, 李驥 申請人:清華大學