專利名稱：熒光pcr定量檢測含有epsps基因轉(zhuǎn)基因大豆探針序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光PCR定量檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆探針序列及試劑盒。
背景技術(shù)：
據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用咨詢服務(wù)中心(ISAAA)統(tǒng)計，2001年全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積為5260萬公頃，十多個國家已種植轉(zhuǎn)基因作物，其中99％的轉(zhuǎn)基因作物種植在美國、阿根廷、加拿大和中國，已批準(zhǔn)商品化轉(zhuǎn)基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、香石竹、矮牽牛、亞麻、煙草、西瓜、菊苣等，已批準(zhǔn)商業(yè)化種植的已近90種。據(jù)估計，用這些轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)加工的食品全世界有近萬種。
對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性，特別是轉(zhuǎn)基因食品對人和動物的健康及對生態(tài)環(huán)境的影響，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)以來，就一直是世界各國及聯(lián)合國等國際組織關(guān)心的焦點問題，2000年聯(lián)合國通過了“生物安全議定書”，該議定書對除了藥物以外的所有進出境活性轉(zhuǎn)基因生物有關(guān)過境、審批、檢測、風(fēng)險評估和管理、賠償責(zé)任等做出了詳細的規(guī)定，其中最重要的措施之一就是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品要進行檢驗，以明確其種類，確定是否為已批準(zhǔn)的或已獲得許可的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，以防止一些具有風(fēng)險的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品任意擴散，造成不可挽回的損失。2001年歐盟要求對轉(zhuǎn)基因食品進行標(biāo)識管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超過1％的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品(閾值)則不用標(biāo)識，這樣轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測不但需要定性，還需要定量檢測。不同國家閾值大小不一樣，從1-5％不等。我國于2001年5月9日公布并實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，并于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、標(biāo)識和進口安全管理三個配套管理辦法。目前全世界36個國家和地區(qū)出臺了各種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品有關(guān)的法律法規(guī)?？傊?，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、銷售都要在政府有關(guān)部門的許可和監(jiān)督下，在特定的環(huán)境和地點進行。
雖然聯(lián)合國所屬機構(gòu)(FAO、WHO等)及一些地區(qū)性國際組織在召集建立世界統(tǒng)一的檢測技術(shù)和方法標(biāo)準(zhǔn)，但由于對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性、風(fēng)險管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各國尚難達成一致的意見。綜合世界各國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)，根據(jù)檢測目標(biāo)主要分成下面三個類型檢測插入的外源基因，檢測外源基因表達物(RNA或蛋白質(zhì))，檢測插入外源基因?qū)κ荏w生物基因表達的影響(主要檢測外源基因?qū)Σ迦胛稽c附近基因影響及對整個代謝產(chǎn)物的影響)。由于第三類型的檢測成本高、所需時間長，并且被認(rèn)為重要性較低，目前對這方面的檢測在實際工作中較少涉及。在前兩種類型的檢測工作中所涉及的檢測目標(biāo)包括三種類型DNA、RNA和蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)的檢測主要用血清學(xué)方法，由于有些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不表達蛋白質(zhì)或表達量不穩(wěn)定，血清學(xué)檢測方法僅在個別轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中應(yīng)用。對于DNA和RNA的檢測主要采用PCR及直接核酸雜交等基因診斷技術(shù)?；驍U增診斷方法到目前為止已經(jīng)歷了以下幾個方面的發(fā)展PCR/電泳檢測、傳統(tǒng)雜交或測序；PCR-ELISA；實時熒光PCR。
目前已商品化的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆中，大部分含有插入的EPSPS基因序列和大豆內(nèi)源基因Lectin序列，可供作為檢測的靶序列。EPSES基因的全稱為5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，帶有EPSES基因的轉(zhuǎn)基因作物具有對除<p>表1

具體實施例方式
引物、探針設(shè)計對GMO中選用的多種EPSPS基因序列(包括EPSPS基因的天然序列以及人工改建序列)、lectin基因序列進行比較，選擇其中缺乏二級結(jié)構(gòu)且保守的基因區(qū)設(shè)計多對引物及探針。引物長度一般為20個堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無互補序列，引物間的熔解溫度(Tm值)相差小于5℃。探針的長度在25個堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。根據(jù)上述原則設(shè)計出的引物、探針如下EPSPS基因上游引物Soybeanpen270u，Soybeanpen463u，Soybeanpen542u，Soybeanpen559u，Soybeanpen708u；下游引物Soybeanpen506r，Soybeanpen536r，Soybeanpen628r，Soybeanpen783r，Soybeanpen829r；探針Soybeanpen390fb，Soybeanpen460fb，Soybeanpen542fb，Soybeanpen579fb，Soybeanpen608fb，Soybeanpen728fblectin基因上游引物687；720；1020；1123；1169；1170；1263；下游引物1119；1137；1166；1296；1312；1366；1375；1441；1612；探針7105；7106；lec1205tet；lec1215tet；lec1230tet；反應(yīng)體系的建立反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得用已購買的Fluka大豆標(biāo)準(zhǔn)品，以Promega提取試劑盒提取基因組核酸，再分別用外源性EPSPS基因和內(nèi)源性lectin基因區(qū)域的最長的擴增片段的引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1×TE進行10倍梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5個稀釋度為系列陽性模板，作為以后反應(yīng)體系優(yōu)化時的模板。
引物、探針的篩選引物篩選實驗中將上述上游引物和下游引物結(jié)合特異的探針，任意配對進行實驗。熒光PCR儀采用PE7700熒光PCR儀。所采用的PCR反應(yīng)體系如下表所示。
PCR反應(yīng)體系

PCR條件的選擇依據(jù)本公司以往的經(jīng)驗，PCR條件的選擇如下
94℃3min；

在同樣的模板量、同樣的反應(yīng)條件下，以外源性EPSPS基因和內(nèi)源性1ectin基因的特異熒光探針信號所獲得的Ct值和Rn值為指標(biāo)(這兩者能反映擴增片斷的量和質(zhì))，比較不同引物對組合的擴增情況。選擇Ct值和Rn值高者，做為待選的DNA/PCR檢測的引物對。
從多次重復(fù)實驗中選定下述最佳引物/探針組合為最佳組合最佳引物/探針組合

EPSPS基因最佳引物/探針序列如下上游引物Soybean pen 559uCCGACGCCGATCACCTA下游引物Soybean pen 628rGATGCCGGGCGTGTTGAG探針Soybean pen 579fbfam-ccgcgtgccgatggcctccgca-tamralectin基因最佳引物/探針序列如下上游引物lec1169ucctcctcgggaaagttacaa下游引物lec1312rgggcatagaaggtgaagtt探針lec1205Tettet-ccctcgtctcttggtcgcgccctct-tamra用選出的最佳上下游引物及探針對進行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。
引物和探針濃度的優(yōu)化實驗中將引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L遞增，探針濃度從0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L遞增。對引物和探針不同濃度的配比進行了比較。最佳引物和探針終濃度結(jié)果如下表最佳引物和探針終濃度

鎂離子濃度和的優(yōu)化實驗中將鎂離子濃度從1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增。從多次重復(fù)實驗中選定2.5mmol/LMgCl2為試劑盒反應(yīng)體系鎂離子濃度。
Taq酶用量的優(yōu)化Taq酶用量(以單位U計)的優(yōu)化實驗結(jié)果，選定2U Taq酶作為試劑盒中使用Taq酶量。
dNTP濃度的優(yōu)化
dNTP濃度的優(yōu)化實驗中選定0.2mmol/L作為試劑盒dNTP的終濃度。綜合以上反應(yīng)體系優(yōu)化實驗結(jié)果，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系見下表。
優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

DNA提取方法的建立推薦使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法CTAB法。也可根據(jù)樣品特性選用方法。
雙檢系統(tǒng)的合一方法先確立外源性EPSPS基因擴增系統(tǒng)(見上述)，然后逐一加入lectin系統(tǒng)的模板、引物和探針，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩系統(tǒng)合并之后，各自的Ct值大約后延一個單位，Rn值有所下降，見下表雙檢系統(tǒng)優(yōu)化表

為觀察兩系統(tǒng)合并后對實際定量的影響，用fluka大豆標(biāo)準(zhǔn)品對外源基因和內(nèi)標(biāo)基因進行測定比較，結(jié)果見下表雙檢合一系統(tǒng)中Fam和Tet通道的Ct值

為減少上樣的DNA模板量的差異，采用以ΔCt值(Fam-Ct值與Tet-Ct值之差)對梯度GMO含量的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)＝-3.5191x+0.37 R2＝0.9773，提示該雙檢合一系統(tǒng)可以用于定量檢測。
反應(yīng)體系的優(yōu)化組合綜上所述，在反應(yīng)體系的建立所進行的各環(huán)節(jié)的優(yōu)化實驗結(jié)果，本熒光檢測試劑盒主要應(yīng)包括以下幾個步驟①大豆DNA的提??；②PCR反應(yīng)；③PCR擴增及熒光信號收集。
以上3個步驟中所涉及到的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果總結(jié)如下。
1.大豆DNA的提取樣本量最小100mg，或者用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定量。
使用CTAB法、磁珠法或其它更有效的辦法。
2.PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系見下表優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下

DNA提取方法的建立推薦使用傳統(tǒng)的植物DNA提取方法CTAB法。也可根據(jù)樣品特性選用方法。
試基盒組成


表中，UNG為一種酶(尿嘧啶-N-糖苷酶Uracil-N-glycosylase)EPSPS定量CTAB法樣本處理試劑配方

純化水的制備用自來水一次蒸餾，經(jīng)過Millipore MILLI-Q PF PLUS純水儀純化，收取電阻率≥18.0MΩ.cm的水，貯于無菌瓶中。
PCR反應(yīng)液配方

4.Lec-PCR反應(yīng)液配方


定量標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照品的制備定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備購買歐盟的Fluka公司的0.1％，0.5％，1.0％，2.0％和5.0％轉(zhuǎn)基因大豆粉(Cat#89305)，用Promega試劑盒(Wizard Magnetic DNA Purification System for Food，Promega Cat#A7710)提取DNA.，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 陰性對照的制備購買市場上的非轉(zhuǎn)基因大豆，洗凈、烘干，磨成粉，用合格的《轉(zhuǎn)基因大豆熒光PCR定量檢測試劑盒(35S啟動子序列檢測)》試劑盒提取基因組DNA，做PCR擴增，平行做3個復(fù)管，如果檢測結(jié)果為35S起動子序列檢測為陰性，GMO含量＜0.1％，視為合格非轉(zhuǎn)基因大豆粉。用CTAB法大量提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 自備設(shè)備及試劑水浴鍋，離心機；氯仿、異丙醇(-20℃預(yù)冷)、70％乙醇(-20℃預(yù)冷)適用儀器PE Gene Amp7700熒光PCR檢測儀或其他合適的熒光PCR儀使用方法1. 樣本核酸提取1.1 CTAB法提取DNA1.1.1 稱取100mg充分粉碎后的大豆樣品放入2ml離心管中，加800ul CTAB緩沖液，混勻后于65℃溫育30分鐘；1.1.2 15500g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上層液至含400ul氯仿的管中，混勻30秒，再以15500g離心10分鐘直至液相分層，吸取上層液至干凈離心管中；1.1.3 加入2V CTAB沉淀緩沖液，室溫下溫育60分鐘；1.1.4 混合液以15500g離心5分鐘，棄上清；1.1.5 加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混勻30秒后以15500g離心10分鐘；1.1.6 轉(zhuǎn)移上清至另一新管中，加入0.6倍體積異丙醇，充分混勻后15500g離心10分鐘，棄上清液；1.1.7 加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混勻洗滌管壁后離心10分鐘(15500g)，棄上清；1.1.8 室溫干燥，然后將DNA溶解在100ul無菌去離子水中(如果樣本DNA當(dāng)天不使用，請于-20℃保存)。
1.2 Promega法提取DNA的步驟(備選)原方法樣本稱取量為200mg。根據(jù)本公司的經(jīng)驗，此量極難混勻，故將樣本稱取量改為100mg，其后的試劑用量和操作則完全按原方法進行(如果樣本DNA當(dāng)天不使用，請于-20℃保存)。
2. 核酸擴增2.1 試劑配制(PCR前準(zhǔn)備區(qū))從試劑盒中取出各管試劑，室溫融化，2000rpm離心5秒。
設(shè)所需要的管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)×3+2管陰性對照+10管定量標(biāo)準(zhǔn)品)。這里每個樣本要做3個平行管，每個定量標(biāo)準(zhǔn)品及1個陰性對照品則只做兩個平行管。每個測試反應(yīng)體系配制如下表反應(yīng)體系 EPS-PCR反應(yīng)液 Lec-PCR反應(yīng)液 Taq酶UNG40ul 17.3ul 17.3ul0.4ul0.06ul計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向設(shè)定的n個PCR反應(yīng)管中分別加入35ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
2.2加樣(樣本處理區(qū))若樣本DNA保存在-20℃，先置室溫解凍。
在設(shè)定的n個PCR反應(yīng)管中，分別加入樣本DNA溶液各5ul；0.1％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％定量標(biāo)準(zhǔn)品以及陰性對照品各5ul；蓋好PCR反應(yīng)管蓋，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)，置于定量PCR檢測儀上并記錄樣本擺放順序。
2.3 PCR擴增(檢測區(qū))2.3.1. 循環(huán)條件設(shè)置37℃5min；95℃4min；95℃15sec，60℃1min，40個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。
(不同的熒光PCR儀循環(huán)條件可能略有調(diào)整)2.3.2. 儀器檢測通道選擇所有PCR反應(yīng)管熒光信號收集分別設(shè)為Fam和Tet熒光通道。
具體設(shè)置方法請參照儀器使用說明書。
3. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)3.1 定量標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照品的lectin基因Tet熒光通道Ct值應(yīng)在18至25之間，否則需重做PCR反應(yīng)。
3.2 待測大豆DNA樣品的lectin基因Tet熒光通道Ct值應(yīng)在18至25之間；否則，樣本DNA提取過程有誤，需從樣本DNA提取開始重做。
3.3 陰性對照品EPSPS基因的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性；否則需重做PCR反應(yīng)。
3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬和度(R平方值)應(yīng)大于等于0.90，否則應(yīng)重做PCR反應(yīng)。
4.結(jié)果分析4.1無論Fam熒光通道或Tet熒光通道，基線都取3～15個循環(huán)的熒光信號；閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，使陰性對照品成陰性結(jié)果為準(zhǔn)。
4.2記錄每個定量標(biāo)準(zhǔn)品以及每個待測樣品的Fam熒光通道的Ct值和Tet熒光通道的Ct值，并分別計算出定量標(biāo)準(zhǔn)品在Fam和Tet熒光通道Ct值的平均值。將各標(biāo)準(zhǔn)品的平均Ct值和各待測樣品的Ct值輸入到所配軟件的相應(yīng)位置，軟件會自動計算出標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本的ΔCt值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的已知GMO含量和所得的ΔCt值之間的對應(yīng)關(guān)系，軟件可計算出回歸曲線方程。
4.3根據(jù)此回歸方程，軟件可通過每個待測樣品的ΔCt值自動計算其GMO的含量，并在表格的對應(yīng)位置顯示結(jié)果。
4.4 GMO含量的報告方式如果某待測樣品的GMO含量計算值在0.1～5.0％之間，按實際值報告；如果某待測樣品的GMO含量計算值小于0.1％，報告GMO低于檢測限；如果某待測樣品的GMO含量計算值大于5.0％，報告GMO大于5.0％；試劑盒使用注意事項有關(guān)實驗室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。
儲存條件及有效期本試劑盒中樣本處理試劑在室溫保存；核酸擴增試劑-20℃保存；避免反復(fù)凍融.有效期為一年，連續(xù)生產(chǎn)的三批試劑盒自檢定合格之日起試劑盒要求的儲存溫度下保存，每個月按成品檢定規(guī)程檢測一次，一直到14個月時，各項指標(biāo)均合格，因此確定試有效期為12個月(請于有效期內(nèi)使用)。
實施例定量檢測選取待檢樣品，以Promega磁珠法提取基因組DNA，具體為稱重100mg植物材料，置于2ml離心管中；加入500ul Lysis Buffer A和5ul RNase A，與材料混勻；加入250ul Lysis Buffer B，混勻，室溫放置10分鐘；加入750ul沉淀緩沖液，混勻后高速離心(13000×g)10分鐘；吸取上清于干凈的2ml離心管中，加入50ul磁粉液，混勻；混合液中加入0.8體積異丙醇，混勻，室溫放置5分鐘；將離心管置于磁架上1分鐘，去澄清液；取出離心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混勻后置于磁架上1分鐘，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分鐘，去澄清液；步驟重復(fù)2次；取出離心管，于65℃干浴鍋中干燥5分鐘或室溫下干燥15-30分鐘；離心管中加入100ul去離子水，混勻后于65℃干浴鍋中孵育5分鐘，再移至磁架上1分鐘，吸取澄清液于0.5ml干凈離心管中，做為DNA模板備用。
用本試劑盒做熒光PCR定量檢測，熒光PCR儀采用PE7700。其結(jié)果如下表用本試劑盒做熒光PCR定量檢測標(biāo)準(zhǔn)品及樣品ct值

從上述數(shù)據(jù)得到的回歸曲線是y＝-0.305x+6.9511；相關(guān)性r2＝0.997；再用1.0％和2.0％的標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)做被測樣品，測得的GMO含量分別為1.03％和2.40％，定量偏差為5％-20％(歐盟的GENESCAN公司同類檢測定量偏差為≤20％)，提示該試劑盒的檢測效率已達到核酸擴增檢測領(lǐng)域里的該項目的國際水平。
試劑盒性能測試試劑盒靈敏度為0.1％GMO大豆。
試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度≥0.95。
試劑盒精密性公司中3位技術(shù)熟練的操作人員在3個不同時間，各做3次精密性檢測實驗(總計9次)，每次平行處理10份精密性參比品。對每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，得出平均值和10個Ct值的CV值，實驗結(jié)果顯示，Ct值的CV值在5。0％以下，表明該試劑盒有良好的精密性，結(jié)果見下表大豆定量結(jié)果表

試劑盒特異性該試劑盒對陰性大豆、玉米、油菜、馬鈴薯標(biāo)本均無非特異性擴增，表明該試劑盒具有良好的特異性。
發(fā)明的效果對經(jīng)過反復(fù)篩選確立的試劑盒進行測試。
以符合國際標(biāo)準(zhǔn)的Fluka大豆標(biāo)準(zhǔn)品0.1％轉(zhuǎn)基因大豆提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之間，這是目前不同熒光測定儀器的可靠檢測下限；而0.1％的檢測靈敏度已經(jīng)達到了目前國際同類產(chǎn)品的檢測標(biāo)準(zhǔn)。
用于作定量檢測，定量偏差為5％-20％(歐盟的GENESCAN公司同類檢測定量偏差為≤20％)，提示本試劑盒的檢測效率已達到核酸擴增檢測領(lǐng)域里的該項目的國際水平。
實施例利用試劑盒中的引物、探針用作雜交探針檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆PCR-ELISA的方法原理簡介該實驗要設(shè)計一對PCR引物和一條探針，它們均與模板DNA鏈互補，且探針的結(jié)合部位在引物結(jié)合部位之間。將PCR的一條引物5’端標(biāo)記上熒光素(Fluorescein)，進行PCR擴增，得到的擴增產(chǎn)物帶有熒光素標(biāo)記。同時將探針的5’端標(biāo)記上生物素(Biotin)，酶聯(lián)板上包被有親和素(Avidin)，通過生物素與親和素的親和作用，將探針包被在酶聯(lián)板上。檢測時，將擴增產(chǎn)物變性成單鏈，在酶聯(lián)板上與探針進行特異的結(jié)合，洗板，再加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的熒光素抗體，通過顯色劑顯色，在酶標(biāo)板上讀取OD值，根據(jù)0D值判斷樣品的陰陽性。
將上述探針Soybean pen 579fb的5’端標(biāo)記生物素，3’端不做標(biāo)記；將引物Soybeanpen 628r的5’端標(biāo)記上熒光素。預(yù)先將探針包被在有親和素的酶聯(lián)板上。
按常規(guī)方法(CTAB法或磁珠法)提取樣本中的DNA。由10×PCR緩沖液、dNTPs、Mg2+、Taq酶、上下游引物、H2O，以及DNA模板組成PCR反應(yīng)體系，進行擴增。
擴增結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物變性成單鏈，加到包被了探針的酶聯(lián)板上，如果有特異性擴增，擴增產(chǎn)物中的一條鏈與探針雜交，洗板，加入酶聯(lián)熒光素抗體，洗板，加入顯色劑，顯色10分鐘，停止顯色，在酶標(biāo)儀上讀取OD值，根據(jù)OD值判斷樣本的陰陽性。下表是一次的實驗結(jié)果下表是一次的實驗結(jié)果樣本 100％GMO5％GMO 2％GMO1％GMO 0.5％GMO 0.1％GMO 0.0％GMO大豆大豆 大豆 大豆 大豆 大豆 大豆OD值 ＞3.000 2.167 1.661 1.2570.847 0.321 0.102結(jié)果判斷 + + + ++ + -樣本 GMO油菜 GMO玉米GMO番茄 土豆 白玉米空白對照OD值 0.113 0.126 0.129 0.1120.131 0.105結(jié)果判斷 - - - --實驗結(jié)果表明只要含有EPSPS基因序列的轉(zhuǎn)基因作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測結(jié)果均為陽性，而不含有EPSPS基因序列的作物經(jīng)該系統(tǒng)檢測均為陰性。
本發(fā)明的優(yōu)點1.本試劑盒對于轉(zhuǎn)入EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因作物檢測靈敏度可達0.1％，說明本試劑盒具有良好的靈敏度。
2.本試劑盒對于非轉(zhuǎn)基因的農(nóng)產(chǎn)品如大豆、玉米等均無擴增信號，說明本試劑盒具有良好的特異性。
3.用本試劑盒做熒光PCR定量檢測，定量偏差為5％-20％(歐盟的GENESCAN公司同類檢測定量偏差為≤20％)，提示該試劑盒的檢測效率已達到核酸擴增檢測領(lǐng)域里的該項目的國際水平。
4.由于本試劑盒采用了熒光PCR作為檢測方法，整個反應(yīng)均閉管進行，避免了其他核酸檢測方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性。
5.由于本試劑盒采用了植物內(nèi)源基因Lectin作為內(nèi)標(biāo)，避免了核酸提取的對定量造成的誤差及假陰性的產(chǎn)生。
6.由于本方法對PCR產(chǎn)物實行了實時監(jiān)測，大大節(jié)省了檢測時間，節(jié)約了人力物力。
備注以英文字母表示的引物探針的名稱、引物探針的序列/基因的名稱等大小寫通用；Ct值的英文全稱“Threshold Cycles”，意指熒光值超過閾值時所處的循環(huán)數(shù)。在不同熒光PCR儀上有不同的名稱，但含意是一樣的。附錄一AAGCCCGCGTTCTCTCCGGCGCTCCGCCCGGAGAGCCGTGGATAGATTAAGGAAGACGCCCATGTCGCACGGTGCAAGCAGCCGGCCCGCAACCGCCCGCAAATCCTCTGGCCTTTCCGGAACCGTCCGCATTCCCGGCGACAAGTCGATCTCCCACCGGTCCTTCATGTTCGGCGGTCTCGCGAGCGGTGAAACGCGCATCACCGGCCTTCTGGAAGGCGAGGACGTCATCAATACGGGCAAGGCCATGCAGGCCATGGGCGCCAGGATCCGTAAGGAAGGCGACACCTGGATCATCGATGGCGTCGGCAATGGCGGCCTCCTGGCGCCTGAGGCGCCGCTCGATTTCGGCAATGCCGCCACGGGCTGCCGCCTGACCATGGGCCTCGTCGGGGTCTACGATTTCGACAGCACCTTCATCGGCGACGCCTCGCTCACAAAGCGCCCGATGGGCCGCGTGTTGAACCCGCTGCGCGAAATGGGCGTGCAGGTGAAATCGGAAGACGGTGACCGTCTTCCCGTTACCTTGCGCGGGCCGAAGACGCCGACGCCGATCACCTA PEN 559USoybean pen 579fb CAGGTGAAGTCCGCCGTGCTGCTCGCCGGCCTCAACACGCCCGGCATCACGPEN 628RACGGTCATCGAGCCGATCATGACGCGCGATCATACGGAAAAGATGCTGCAGGGCTTTGGCGCCAACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGCAAGCTCACCGGCCAAGTCATCGACGTGCCGGGCGACCCGTCCTCGACGGCCTTCCCGCTGGTTGCGGCCCTGCTTGTTCCGGGCTCCGACGTCACCATCCTCAACGTGCTGATGAACCCCACCCGCACCGGCCTCATCCTGACGCTGCAGGAAATGGGCGCCGACATCGAAGTCATCAACCCGCGCCTTGCCGGCGGCGAAGACGTGGCGGACCTGCGCGTTCGCTCCTCCACGCTGAAGGGCGTCACGGTGCCGGAAGACCGCGCGCCTCGATGATCGACGAATATCCGATTCTCGCTGTCGCCGCCGCCTTCGCGGAAGGGGCGACCGTGATGAACGGTCTGGAAGAACTCCGCGTCAAGGAAAGCGACCGCCTCTCGGCCGTCGCCAATGGCCTCAAGCTCAATGGCGTGGATTGCGATGAGGGCGAGACGTCGCTCGTCGTGCGCGGCCGCCCTGACGGCAAGGGGCTCGGCAACGCCTCGGGCGCCGCCGTCGCCACCCATCTGCATCACCGCATCGCCATGAGCTTCCTCGTCATGGGCCTCGTGTCGGAAAACCCTGTCACGGTGGACGATGCCACGATGATCGCCACGATCTTCCCGGAGTTCATGGACCTGATGGCCGGGCTGGGCGCGAAGATCGAACTCTCCGATACGAAGGCTGCCTGATGACCTTCACAATCGCCATCGATGGTCCCGCTGCGGCCGGCAAGGGGACGTCTCGCGCCGTATCGCGGAGGTCTATGGCTTTCATCATCTCGATACGGGCCTGACCTATCGCGCCACGGCCAAAGCGCTGCTCGATCGCGGCCTGTCGCTTGATGACGAGGCGGTTGCGGCCGATGTCGCCCGCAATCTCGATCTTGCCGGGCTCGACCGGTCGGTGCTGTCGGCCCATGCCATCGGCGAGGCGGCTTCGAAGATCGCGGTCATGCCCTCGGTGCGGCGGGCGCTGGTCGAGGCGCAGCGCAGCTTTGCGGCGCGTGAGCCGGGCACGGTGCTGGATGGACGCGATATCGGCACGGTGGTCTGCCCGGATGCGCGTGAGCCGGGCACGGTGCTGGATGGACGCGATATCGGCACGGTGGTCTGCCCGGATGAAATCCTCGGCAATGGCGGGTTGGCCGATTACGGGACGATCCTCGAGGATATCCGCCGCCGCGACGAGCGGGACATGGGTCGGGCGGACAGTCCTTTGAAGCCCGCCGACGATGCGCACTT
序列表&lt;110&gt;國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所深圳市匹基生物工程股份有限公司&lt;120&gt;熒光PCR定量檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆探針序列及試劑盒&lt;130&gt;&lt;160&gt;6&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工合成&lt;400&gt;1ccgcgtgccg atggcctccg ca 22&lt;210&gt;2&lt;211&gt;17&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工合成&lt;400&gt;2ccgacgccga tcaccta 17&lt;210&gt;3&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工合成&lt;400&gt;3gatgccgggc gtgttgag 18&lt;210&gt;4&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工合成&lt;400&gt;4ccctcgtctc ttggtcgcgc cctct 25&lt;210&gt;5&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工合成&lt;400&gt;5cctcctcggg aaagttacaa 20&lt;210&gt;6&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工合成&lt;400&gt;6gggcatagaa ggtgaagtt19
權(quán)利要求
1.一種熒光PCR定量檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆探針序列，其特征在于所述的探針序列包括序列ccgcgtgccgatggcctccgca向上游位移5個堿基、向下游位移5個堿基的區(qū)域內(nèi)形成的探針序列。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光PCR定量檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因大豆探針序列，其特征在于所述的探針序列為ccgcgtgccgatggcctccgca。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定量檢測含有花椰菜花葉病毒35S啟動子轉(zhuǎn)基因大豆探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為核酸提取試劑核酸擴增試劑EPSPS PCR反應(yīng)液lec PCR反應(yīng)液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)定量標(biāo)準(zhǔn)品EPSPS-STND1(5.0％)EPSPS-STND2(2.0％)EPSPS-STND3(1.0％)EPSPS-STND4(0.5％)EPSPS-STND5(0.1％)EPSPS-定量陰性對照其中PCR反應(yīng)液的上游引物序列CCGACGCCGATCACCTA下游引物序列GATGCCGGGCGTGTTGAG所述的lectin基因最佳引物/探針序列如下上游引物序列cctcctcgggaaagttacaa下游引物序列g(shù)ggcatagaaggtgaagtt探針ccctcgtctcttggtcgcgccctct
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光PCR定量檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆探針序列做成的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒的組成為CTAB法核酸提取試劑CTAB緩沖液 40ml×1管CTAB沉淀緩沖液 40ml×1管沉淀溶解液 24ml×1管核酸擴增試劑EPSPS PCR反應(yīng)液 1ml×1管lec PCR反應(yīng)液1ml×1管Taq酶(5U/ul) 20ul×1管UNG(1U/ul) 5ul×1管定量標(biāo)準(zhǔn)品EPSPS-STND1(5.0％) 30ul×1管EPSPS-STND2(2.0％) 30ul×1管EPSPS-STND3(1.0％) 30ul×1管EPSPS-STND4(0.5％) 30ul×1管EPSPS-STND5(0.1％) 30ul×1管EPSPS-定量陰性對照 30ul×1管其中EPSPS定量PCR反應(yīng)液配方試劑成份 終濃度或體積10×buffer 2ul25mM MgCl22ul100mM dATP 0.04ul100mM dCTP 0.04ul100mM dGTP 0.04ul100mM dUTP 0.04ulEPSPS上游引物0.46EPSPS下游引物0.46uMEPSPS探針0.23uM加水至 17.3ulLec-PCR反應(yīng)液配方試劑成份 終濃度或體積10×buffer 2ul25mM MgCl22ul100mM dATP 0.04ul100mM dCTP 0.04ul100mM dGTP 0.04ul100mM dUTP 0.04ulLec上游引物 0.46mMLec下游引物 0.46uMLec探針 0.23uM加水至 17.3ul
5.權(quán)利要求2所述的一種熒光PCR定量檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆探針，其特征在于所述的探針用作雜交探針檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆。
全文摘要
一種熒光PCR定量檢測含有EPSPS基因轉(zhuǎn)基因大豆探針序列及試劑盒，所述的探針序列包括序列ccgcgtgccgatggcctccgca向上游位移5個堿基、向下游位移5個堿基的區(qū)域內(nèi)形成的探針序列。試劑盒包括核酸提取試劑，核酸擴增試劑，定量標(biāo)準(zhǔn)品，其中，核酸擴增試劑包括EPSPSPCR反應(yīng)液、lecPCR反應(yīng)液、Taq酶、UNG等，標(biāo)準(zhǔn)品包括EPSPS不同濃度的陽性品以及陰性對照品。本發(fā)明的優(yōu)點是對轉(zhuǎn)基因作物檢測靈敏度可達0.1％，具有良好的靈敏度和特異性。定量偏差為5％－20％，檢測效率已達核酸擴增檢測領(lǐng)域里的該項目的國際水平。采用了植物內(nèi)源基因Lectin作為內(nèi)標(biāo)，避免核酸提取造成的誤差及假陰性的產(chǎn)生。實行了實時監(jiān)測，大大節(jié)省檢測時間，節(jié)約人力物力。
文檔編號C12Q1/68GK1485444SQ02131299
公開日2004年3月31日 申請日期2002年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月24日
發(fā)明者朱文斯, 朱水芳, 黃茜華 申請人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 國家出入境檢驗檢疫局動植物檢疫實驗所