專利名稱：一種從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物分離技術(shù)，具體地說是一種從海綿細胞分離產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，它是從海洋中獲得新鮮活的海綿多細胞動物，從海綿內(nèi)部細胞中分離能產(chǎn)生較高含量的抗癌、抗腫瘤、抗菌等生物活性物質(zhì)微生物的方法。
背景技術(shù)：
海綿是最原始、最低等的多細胞動物，無組織無器官分化，是地球生命起源與進化的獨立分支，是海洋中的無脊椎動物。國內(nèi)外多年來的研究表明，海綿中超過10％的次生代謝產(chǎn)物都有細胞毒性，為生物活性物質(zhì)，而在海洋的其他海洋生物中這一比例只有2％，在陸地上的植物和微生物則遠低于1％。因此，海綿中活性物質(zhì)的研究，受到世界各國科學(xué)家的重視。但到目前為止，海綿能產(chǎn)生活性物質(zhì)的機制還不清楚，是否與海綿細胞中共生存的微生物有關(guān)，至今也沒有結(jié)論，這種機制是十分復(fù)雜的。據(jù)初步估計，在海綿細胞中的共生存的微生物約占海綿體積的40％，美國馬里蘭大學(xué)發(fā)現(xiàn)海綿中存在復(fù)雜的微生物類群，海綿中的抗癌活性物質(zhì)是由其共生存的微生物所產(chǎn)生，并從海綿中分離得到一株亮桔色微球菌可以發(fā)酵產(chǎn)生與海綿中一樣的活性物質(zhì)(Diketopiperagines)。Althoff等人對DNA的研究還確定了Rhodobacter和海綿Halichondria panicea的共生存關(guān)系。另外，中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所已從渤海膜海綿細胞中獲得多株產(chǎn)農(nóng)用抗菌素及抗腫瘤先導(dǎo)化合物等活性物質(zhì)的微生物菌株。目前，如何從海綿細胞中能分離純化得到其共生的微生物、產(chǎn)生活性物質(zhì)的海綿微生物，并利用這些寶貴資源，研究海洋微生物制藥，農(nóng)用抗菌素等等，已成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點，目前采用傳統(tǒng)常規(guī)分離方法，不加陳海水、海綿，只能得到少部分海綿細胞中的微生物，不能獲得海綿生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的屬種群落。至今國內(nèi)外尚沒有一個理想的分離海綿細胞中微生物的方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從海綿細胞中分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為可按如下步驟操作(1)從海洋中選取健康的、活的海綿有機體(選取健康的、活的、無病蟲害的)，在無菌條件下清洗，取海綿內(nèi)部細胞體切成1～5mm小塊，研磨3～5分鐘，獲得新鮮海綿細胞提取液；；所述清洗采用酒精或無菌生理鹽水；(2)對新鮮海綿細胞提取液，采用平板稀釋法，分別以10-1～10-7濃度稀釋液，在均添加有0.005～0.05％海綿的分離海洋真菌、細菌或放線菌培養(yǎng)基的平皿上，涂刮平板，然后放入到25～30℃保溫箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)1～15天后，對平皿長出單菌落純的(生長一致的)微生物移至斜面保藏，以備進行次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定，鑒定方法采用常規(guī)技術(shù)；所述次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定是在實驗室條件下對是其否產(chǎn)生抗癌、抗腫瘤、抗菌等生物活性物質(zhì)進行檢測驗證；所述用于分離海綿細胞中真菌的平板稀釋液濃度為10-2～10-3；所述用于分離海綿細胞中細菌的平板稀釋液濃度為10-5～10-7；所述用于分離海綿細胞中放線菌的平板稀釋液濃度為10-1～10-2；其中稀釋所用溶液為無菌水；按重量百分比計，所述分離海綿細胞中真菌的培養(yǎng)基成分為葡萄糖1％、可溶性淀粉0.5～2.0％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.1％、蛋白胨0.5～1.0％、海綿0.005～0.05％、瓊脂2％、余量為陳海水或人工海水，pH6.0～6.5；每1000ml所述培養(yǎng)基中，滅菌消毒前加入1％孟加拉紅(RoseBengal)水溶液3.3ml；當(dāng)融化培養(yǎng)基倒在平板上臨用時每100ml培養(yǎng)基中加入0.5～2％鏈霉素溶液0.1～1.0ml，及環(huán)丙沙星100～500μl；按重量百分比計，分離海綿細胞中細菌的培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉0.5～2.0％、牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％、海綿0.005～0.05％、瓊脂2％、余量為陳海水或人工海水，pH7.0～7.2；按重量百分比計，分離海綿細胞中放線菌的培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉0.5～2.0％、蔗糖0.1～1.0％、甘露醇0.5％、KNO30.1％、K2HPO40.5％、MgSO4·7H2O 0.5％、FeSO4·7H2O 0.01％、海綿0.005～0.05％、瓊脂2％、余量為陳海水或人工海水，pH7.0～7.4；臨用時，在已加熱融化的300ml所述培養(yǎng)基中加入3％重鉻酸鉀溶液1ml，再加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星100～500μl。
本發(fā)明具有如下有益效果1.應(yīng)用本發(fā)明從海綿細胞中分離產(chǎn)生物活性物質(zhì)微生物的方法，在分離培養(yǎng)基中均添加了海綿0.005～0.05％，分離效果很好，并且在分離真菌時添加孟加拉紅和鏈霉素，放線菌時添加重鉻酸鉀、鏈霉素及環(huán)丙沙星，所以平均成功率在90％以上。
2.本發(fā)明操作簡單，能得到所需的菌株。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1從海綿細胞中分離產(chǎn)生生物活性物質(zhì)真菌的方法可按照以下步驟操作(1)從海洋中選取健康的活的海綿有機體后立即進行清洗，采用酒精對海綿外表進行消毒；用無菌技術(shù)，切去海綿體外層，取海綿內(nèi)部細胞體切成1～5mm見方小塊，用無菌石英砂研磨，在無菌研碎加入無菌生理鹽水(NaCl 0.85％)，研磨5分鐘，獲得新鮮海綿細胞提取液；(2)對新鮮海綿細胞提取液，采用平板稀釋法，分別以10-2、10-3濃度稀釋液，在下列分離海綿真菌培養(yǎng)基的平皿上涂平板，涂完放25℃保溫箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)1周后挑單菌落分純，而后移殖至斜面上保存，進行次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定；所述次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定是在實驗室條件下其是否產(chǎn)生抗癌、抗腫瘤、抗菌等生物活性物質(zhì)進行檢測驗證；分離海綿真菌培養(yǎng)基按重量百分比其成分如下葡萄糖1％、可溶性淀粉1％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.1％、蛋白胨0.5％、海綿0.05％、瓊脂2％、余量為陳海水，pH6.0；所述陳海水為靜置一段時間的海水；每1000ml此培養(yǎng)基中，滅菌消毒前加入1％Rose Bengal水溶液3.3ml；當(dāng)融化培養(yǎng)基倒在平板上，臨用時每100ml培養(yǎng)基中加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星300μl。
本實施例分離海綿細胞中真菌的成功率為90％以上。
實施例2與實施例1不同之處在于對新鮮海綿細胞提取液，用平板稀釋法，分別以10-5、10-6、10-7濃度稀釋液，在下列分離海綿細菌培養(yǎng)基的平皿上涂平板，涂完放28℃保溫箱中培養(yǎng)3天，挑單菌落分純，而后移殖至斜面上保存，進行次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定。
分離海綿細菌培養(yǎng)基按重量百分比其組成如下可溶性淀粉1％、牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％、海綿0.01％、瓊脂2％、余量為陳海水，pH7.0。
本實施例分離海綿細胞中細菌的成功率為95％以上。
實施例3與實施例1不同之處在于從海洋中選取健康的活的海綿有機體后，采用生理鹽水對海綿外表進行消毒；對新鮮海綿細胞提取液，用平板稀釋法，分別以10-1、10-2濃度稀釋液，在下列分離海綿放線菌培養(yǎng)基的平皿上涂平板，涂完放30℃保溫箱中培養(yǎng)2周后，挑單菌落分純，而后移殖至斜面上保存，進行次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定。
分離海綿放線菌培養(yǎng)基按重量百分比其組成如下可溶性淀粉1％、蔗糖0.5％、甘露醇0.5％、KNO30.1％、K2HPO40.5％、MgSO4·7H2O 0.01％、FeSO4·7H2O 0.01％、海綿0.01％、瓊脂2％、余量為陳海水，pH7.0～7.2；臨用時，在已加熱融化的300ml培養(yǎng)基中加入3％重鉻酸鉀溶液1ml，再加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星500μl。
本實施例分離海綿細胞中放線菌的成功率為70％以上。
本發(fā)明所述陳海水也可用人工海水替代。
權(quán)利要求
1.一種從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于可按如下步驟操作(1)從海洋中選取健康的、活的海綿有機體，在無菌條件下清洗，取海綿內(nèi)部細胞體切成1～5mm小塊，研磨3～5分鐘，獲得新鮮海綿細胞提取液；(2)對新鮮海綿細胞提取液，采用平板稀釋法，以10-1～10-7濃度稀釋液，在均添加有0.005～0.05％海綿的分離海洋真菌、細菌或放線菌培養(yǎng)基的平皿上，涂刮平板，然后放入到25～30℃保溫箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)1～15天后，對平皿長出單菌落純的微生物移至斜面保藏，以備進行次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于所述清洗采用酒精或無菌生理鹽水。
3.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于所述次生代謝產(chǎn)物生物活性的鑒定是在實驗室條件下對是其否產(chǎn)生抗癌、抗腫瘤、抗菌生物活性物質(zhì)進行檢測驗證。
4.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于所述用于分離海綿細胞中真菌的平板稀釋液濃度為10-2～10-3。
5.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于所述用于分離海綿細胞中細菌的平板稀釋液濃度為10-5～10-7。
6.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于所述用于分離海綿細胞中放線菌的平板稀釋液濃度為10-1～10-2。
7.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于按重量百分比計，所述分離海綿細胞中真菌的培養(yǎng)基成分為葡萄糖1％、可溶性淀粉0.5～2.0％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.1％、蛋白胨0.5～1.0％、海綿0.005～0.05％、瓊脂2％、余量為陳海水或人工海水，pH6.0～6.5；每1000ml所述培養(yǎng)基中，滅菌消毒前加入1％孟加拉紅水溶液3.3ml；當(dāng)融化培養(yǎng)基倒在平板上臨用時每100ml培養(yǎng)基中加入0.5～2％鏈霉素溶液0.1～1.0ml，及環(huán)丙沙星100～500μl。
8.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于按重量百分比計，分離海綿細胞中細菌的培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉0.5～2.0％、牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％、海綿0.005～0.05％、瓊脂2％、余量為陳海水或人工海水，pH7.0～7.2。
9.如權(quán)利要求1所述從海綿細胞分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，其特征在于按重量百分比計，分離海綿細胞中放線菌的培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉0.5～2.0％、蔗糖0.1～1.0％、甘露醇0.5％、KNO30.1％、K2HPO40.5％、MgSO4·7H2O 0.5％、FeSO4·7H2O 0.01％、海綿0.005～0.05％、瓊脂2％、余量為陳海水或人工海水，pH 7.0～7.4；臨用時，在已加熱融化的300ml所述培養(yǎng)基中加入3％重鉻酸鉀溶液1ml，再加入1％鏈霉素溶液0.5ml，及環(huán)丙沙星100～500μl。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從海綿細胞中分離能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)微生物的方法，即從海洋中最原始多細胞動物海綿的細胞中分離能產(chǎn)生較高含量的抗癌、抗腫瘤、抗菌等生物活性物質(zhì)微生物的方法。具體操作(1)從海洋中選取健康的、活的海綿有機體，在無菌條件下清洗，取海綿內(nèi)部細胞體切成小塊，研磨，獲得新鮮海綿細胞提取液；(2)對新鮮海綿細胞提取液，采用平板稀釋法，在均添加有0.005～0.05％海綿的分離海洋真菌、細菌或放線菌培養(yǎng)基的平皿上，涂刮平板，然后放入到保溫箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)1～15天后，對平皿長出單菌落純的微生物移至斜面保藏，并對生物活性物質(zhì)進行檢測驗證。本發(fā)明操作簡單，結(jié)果理想，能得到所需的菌株。
文檔編號C12N1/20GK1467289SQ0213256
公開日2004年1月14日 申請日期2002年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月9日
發(fā)明者王書錦, 胡江春, 薛德林, 馬成新, 張衛(wèi), 張海濤 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所