專利名稱：用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)的探針序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的擴(kuò)增與檢測(cè)。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不斷商品化，其安全性問(wèn)題一直被世人關(guān)注，并不斷發(fā)生爭(zhēng)議。為了保障人類的身體健康，消除消費(fèi)者顧慮，有利于國(guó)際貿(mào)易和商品流通，以歐盟為代表的很多國(guó)家，在經(jīng)歷了短暫的爭(zhēng)議后，對(duì)此類特殊產(chǎn)品都制定出安全管理?xiàng)l例，以便嚴(yán)格管理。歐洲、日本等多國(guó)還制定了相應(yīng)的限量法規(guī)。我國(guó)農(nóng)業(yè)部也于今年出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理辦法。然而，要使消費(fèi)者了解或接受轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，各項(xiàng)法規(guī)能得以實(shí)施，除了給以相關(guān)信息及增加透明度外，關(guān)鍵問(wèn)題是能夠有相應(yīng)的科學(xué)檢測(cè)方法來(lái)分析與鑒別傳統(tǒng)產(chǎn)品與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。尤其面對(duì)國(guó)內(nèi)外貿(mào)易中對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的限量要求，更應(yīng)有相應(yīng)的、準(zhǔn)確地定量方法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，尤其是轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。在目前國(guó)內(nèi)外常用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法中，主要是以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法。PCR方法又分為定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR已廣泛應(yīng)用于基于核酸的各個(gè)研究和臨床診斷等領(lǐng)域，該方法使用兩段(約17～20多個(gè)核苷酸)寡核苷酸作為反應(yīng)的引物，這兩段寡核苷酸引物的序列應(yīng)不發(fā)生互補(bǔ)作用。但它們可和稱為模板的待測(cè)DNA兩條鏈上在一定的位點(diǎn)分別發(fā)生互補(bǔ)。反應(yīng)液由包括含有鎂離子的反應(yīng)緩沖液、4種單核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通過(guò)溫度的變化，DNA變性及退火，而合成兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)之間的DNA片斷。這樣的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，使第一個(gè)循環(huán)產(chǎn)生的DNA片斷得以擴(kuò)增。經(jīng)25～30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)106。用該方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品整個(gè)過(guò)程繁雜，操作步驟多，而且需要PCR后處理，如瓊脂糖凝膠電脈和溴化乙錠染色，紫外光觀察結(jié)果或通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳或銀染檢測(cè)，不僅需要多種儀器，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所使用的染色劑溴化乙錠對(duì)人體又有害，這些繁雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程又給污染和假陽(yáng)性提供了機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響對(duì)結(jié)果的正確判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法原理，即是在定性PCR方法的基礎(chǔ)上，加入了一條熒光標(biāo)記的探針，收集記錄熒光信號(hào)，從而可以檢測(cè)出待測(cè)樣品的初始拷貝數(shù)，判定待測(cè)馬鈴薯樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成份，從而確定待測(cè)馬鈴薯樣品及其加工產(chǎn)品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
本發(fā)明的技術(shù)方案是是在常規(guī)PCR檢測(cè)基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記了兩個(gè)熒光基團(tuán)的探針。熒光報(bào)告基團(tuán)(R)標(biāo)記在探針的5′端，熒光淬滅基團(tuán)(Q)標(biāo)記在探針的3′端，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即熒光報(bào)告基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被熒光淬滅基團(tuán)吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用減弱，報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)增強(qiáng)。在PCR過(guò)程中，探針同PCR產(chǎn)物雜交，由于Taq酶具有5′到3′的外切酶活性，在引物延伸階段將探針切斷，熒光淬滅基團(tuán)(Q)抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)增強(qiáng)。伴隨PCR產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)隨之增強(qiáng)，第n循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)增加值ΔRn等于Rn/Qn減去R0/Q0，Rn、R0分別為第n循環(huán)和PCR反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的報(bào)告基團(tuán)熒光值，Qn、Q0分別為第n循環(huán)和PCR反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的淬滅基團(tuán)熒光值。PCR反應(yīng)的第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值作為熒光本底信號(hào)，3-15個(gè)循環(huán)的ΔRn的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍被設(shè)定為熒光閾值(threshold)，當(dāng)信號(hào)達(dá)到該熒光閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)(Ct值)同PCR反應(yīng)的初始模板量成正比。
用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯PVY-cp基因的探針序列是5’-aaaatgagaatgcccaaaag-3’，該探針的最大序列是5’-aaaatgagaa tgcccaaaagcaagggagcaaccgt-3’，該探針的最小序列是5’-tgagaatgccca-3’。
用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯PLRVrep基因的探針序列是5’-ccaaccaccgccgctgctta-3’，該探針的最大序列是5’-ccaaccaccg ccgctgcttacagatcggagctacta-3’，該探針的最小序列是5’-ccaccgccgctg-3’。
用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Cry3A基因的探針序列是5’-cgctgtgtggccatccgca-3’，該探針的最大序列是5’-ctcgctgtgtggccatccgcagtttactcaggcg-3’，該探針的最小序列是5’-gtgtggccatcc-3’。
用于檢測(cè)馬鈴薯patatin內(nèi)源基因的探針序列是5’-ggatcgaaagccacggaaaa-3’，該探針的最大序列是5’-tggttattac aggatcgaaagccacggaaaagggatattga-3’，該探針的最小序列是5’-cgaaagccacgg-3’。
按上述探針序列制成的用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒。
本發(fā)明的有益效果是通過(guò)檢測(cè)作物本身所具有的內(nèi)源參照基因(Endogenous Reference Gene)，如馬鈴薯patatin內(nèi)源基因，可以測(cè)定樣品中轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的總DNA模板量；通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中轉(zhuǎn)入的外源基因，如馬鈴薯PVY-cp基因、馬鈴薯PLRVrep基因等可以測(cè)定樣品中轉(zhuǎn)基因作物的DNA模板量，通過(guò)建立轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)參照樣品的內(nèi)源參照基因與外源基因Ct值之差(ΔCt)與轉(zhuǎn)基因成分百分含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出樣品及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測(cè)的引物和探針也可以對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性檢測(cè)，具有靈敏度高、避免交叉污染造成假陽(yáng)性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)采用完全閉管檢測(cè)，無(wú)需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽(yáng)性。該技術(shù)巧妙地運(yùn)用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、核酸雜交的特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速和敏感性，使得本方法具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)原理示意圖。
圖2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)曲線圖。
(a)外源基因出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，(b)內(nèi)源參照基因出現(xiàn)PCR擴(kuò)增。
圖3非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)曲線圖。
(a)外源基因未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，(b)內(nèi)源參照基因出現(xiàn)PCR擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列和試劑盒，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測(cè)基因PVY-cp基因。
引物5’-gaatcaaggctatcacgtcc-3’、5’-catccgcactgcctcatacc-3’。
探針5’-aaaatgagaatgcccaaaag-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針序列制成的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的PVY-cp基因的試劑盒。
實(shí)施例2用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列和試劑盒，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測(cè)基因PLRVrep基因。
引物5’-tcgtcattaaacttgacgac-3’、5’-cttctttcacggagttccag-3’。
探針5’-ccaaccaccgccgctgctta-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針序列制成的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的PLRVrep基因的試劑盒。
實(shí)施例3用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列和試劑盒，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測(cè)基因Cry3A基因。
引物5’-agagccgtcgcaaacaccaatc-3’、5’-tctgggtgctggcctcatcg-3’。
探針5’-cgctgtgtggccatccgca-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針序列制成的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的Cry3A基因的試劑盒。
實(shí)施例4用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列和試劑盒，檢測(cè)馬鈴薯內(nèi)源基因。
檢測(cè)基因patatin。
引物5’-tgacctggacaccacagttat-3’、5’-gtggatttcaggagttcttcga-3’。
探針5’-ggatcgaaagccacggaaaa-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針序列制成的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯內(nèi)源基因patatin的試劑盒。
檢測(cè)主要儀器超凈工作臺(tái)、消毒滅菌鍋、制冰機(jī)、核酸蛋白分析儀、高速冷凍離心機(jī)，臺(tái)式小型離心機(jī)，Mini個(gè)人離心機(jī)、低溫冰箱，冷藏冷凍冰箱、純水器、雙蒸水器、旋渦震蕩器、微量進(jìn)樣器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
檢測(cè)主要試劑10×PCR緩沖液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、引物和探針(按探針序列制成試劑盒)等。
實(shí)時(shí)熒光PCR檢驗(yàn)所用引物和探針序列如實(shí)施例1～4所述。
實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系試劑名稱 貯備液濃度加入體積(μL)10×PCR緩沖液 5.0MgCl225mol/μL 5.0dNTP 2.5mol/μL 2.0UNG酶 1U/μL 0.5引物 20p mol/μL 正0.25反0.25探針 10p mol/μL0.3Taq酶 5U/μL 0.25DNA模板a20ng/μL～30ng/μL 5μLddH2O 補(bǔ)足至反應(yīng)總體積50μL注1a為原料的模板量，加工產(chǎn)品應(yīng)視加工程度增加模板量。
注2不同儀器，PCR反應(yīng)體積不同，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)為50℃/2min(使用UNG酶時(shí)需此步驟)，預(yù)變性95℃/10min，40個(gè)循環(huán)95℃/15s，60℃/1min。
注不同儀器應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。
儀器檢測(cè)通道的選擇PCR反應(yīng)管熒光信號(hào)收集的設(shè)置，應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說(shuō)明書(shū)。
上機(jī)運(yùn)行按預(yù)先設(shè)定的樣品擺放順序?qū)CR反應(yīng)管依次擺放，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器，開(kāi)始運(yùn)行進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
結(jié)果分析與計(jì)算定性分析基線的設(shè)置實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束并分析后，應(yīng)設(shè)置無(wú)效基線范圍。無(wú)論采用任何熒光通道基線范圍選擇在3-20個(gè)循環(huán)；閾值設(shè)置原則以基線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值＝40為準(zhǔn)。
結(jié)果判斷待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值≥40，內(nèi)參照基因檢測(cè)Ct值23-30者，表明未檢出×××基因；待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值28-34，內(nèi)參照基因檢測(cè)Ct值23-30者。表明檢出×××基因。
定量分析用EXCEL或其它方法計(jì)算數(shù)據(jù)，可以創(chuàng)建以DNA濃度(x)對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)Ct值(Y)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于樣品DNA的濃度，可以根據(jù)回歸方程logX＝Y(jié)-b/m計(jì)算(b為交叉點(diǎn)值，m為斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-內(nèi)源基因Ct值。將ΔCt值代入方程，即可得出樣品中某一外源基因的相對(duì)含量。
如圖2所示，(b)內(nèi)源基因出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，(a)外源基因也出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，表明該樣品檢測(cè)出了外源轉(zhuǎn)基因成分，即為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
如圖3所示，(b)內(nèi)源基因出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，(a)外源基因未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，表明該樣品未檢測(cè)出外源轉(zhuǎn)基因成分。
按常規(guī)探針制備合成方法制造。
權(quán)利要求
1.用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯PVY-cp基因的探針的最大序列是5’-aaaatgagaatgcccaaaagcaagggagcaaccgt-3’，探針的最小序列是5’-tgagaatgccca-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯PVY-cp基因的探針優(yōu)選序列是5’-aaaatgagaatgcccaaaag-3’。
3.用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯PLRVrep基因的探針的最大序列是5’-ccaaccaccgccgctgcttacagatcggagctacta-3’，探針的最小序列是5’-ccaccgccgctg-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯PLRVrep基因的探針優(yōu)選序列是5’-ccaaccaccgccgctgctta-3’。
5.用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Cry3A基因的探針的最大序列是5’-ctcgctgtgtggccatccgcagtttactcaggcg-3’，探針的最小序列是5’-gtgtggccatcc-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Cry3A基因的探針優(yōu)選序列是5’-cgctgtgtggccatccgca-3’。
7.用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)馬鈴薯patatin基因的探針的最大序列是5’-tggttattacaggatcgaaagccacggaaaagggatattga-3’，探針的最小序列是5’-cgaaagccacgg-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是用于檢測(cè)馬鈴薯patatin基因的探針優(yōu)選序列是5’-ggatcgaaagccacggaaaa-3’。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在探針的5′端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在探針的3′端，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。
10.用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，其特征是如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的探針序列制成的用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒。
全文摘要
用于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列和試劑盒，給出檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯PVY－cp基因、PLRVrep基因、Cry3A基因和patatin內(nèi)源基因的探針序列，最大、最小及優(yōu)選序列，按探針序列制成的試劑盒，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測(cè)和定性檢測(cè)，具有靈敏度高、避免交叉污染造成假陽(yáng)性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)采用完全閉管檢測(cè)，無(wú)需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽(yáng)性。該技術(shù)巧妙地運(yùn)用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、核酸雜交的特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速和敏感性，使得本方法具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1420182SQ02133169
公開(kāi)日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者覃文, 曹際娟 申請(qǐng)人:覃文, 曹際娟