專利名稱：用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光pcr檢測的探針序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的擴(kuò)增與檢測。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不斷商品化，其安全性問題一直被世人關(guān)注，并不斷發(fā)生爭議。為了保障人類的身體健康，消除消費(fèi)者顧慮，有利于國際貿(mào)易和商品流通，以歐盟為代表的很多國家，在經(jīng)歷了短暫的爭議后，對此類特殊產(chǎn)品都制定出安全管理?xiàng)l例，以便嚴(yán)格管理。歐洲、日本等多國還制定了相應(yīng)的限量法規(guī)。我國農(nóng)業(yè)部也于今年出臺了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理辦法。然而，要使消費(fèi)者了解或接受轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，各項(xiàng)法規(guī)能得以實(shí)施，除了給以相關(guān)信息及增加透明度外，關(guān)鍵問題是能夠有相應(yīng)的科學(xué)檢測方法來分析與鑒別傳統(tǒng)產(chǎn)品與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。尤其面對國內(nèi)外貿(mào)易中對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的限量要求，更應(yīng)有相應(yīng)的、準(zhǔn)確地定量方法對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，尤其是轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行定性、定量檢測。在目前國內(nèi)外常用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法中，主要是以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測方法。PCR方法又分為定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)已廣泛應(yīng)用于基于核酸的各個研究和臨床診斷等領(lǐng)域，該方法使用兩段(約17～20多個核苷酸)寡核苷酸作為反應(yīng)的引物，這兩段寡核苷酸引物的序列應(yīng)不發(fā)生互補(bǔ)作用。但它們可和稱為模板的待測DNA兩條鏈上在一定的位點(diǎn)分別發(fā)生互補(bǔ)。反應(yīng)液由包括含有鎂離子的反應(yīng)緩沖液、4種單核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通過溫度的變化，DNA變性及退火而合成兩個互補(bǔ)位點(diǎn)之間的DNA片斷。這樣的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，使第一個循環(huán)產(chǎn)生的DNA片斷得以擴(kuò)增。經(jīng)25～30個循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)106。用該方法檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品整個過程繁雜，操作步驟多，而且需要PCR后處理，如瓊脂糖凝膠電脈和溴化乙錠染色，紫外光觀察結(jié)果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或銀染檢測，不僅需要多種儀器，而且費(fèi)時費(fèi)力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實(shí)驗(yàn)過程又給污染和假陽性提供了機(jī)會，嚴(yán)重影響對結(jié)果的正確判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR法原理，即是在定性PCR方法的基礎(chǔ)上，加入了一條熒光標(biāo)記的探針，收集記錄熒光信號，從而可以檢測出待測樣品的初始拷貝數(shù)，判定待測玉米樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成份，從而確定待測玉米樣品及其加工產(chǎn)品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
本發(fā)明的技術(shù)方案是是在常規(guī)PCR檢測基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記了兩個熒光基團(tuán)的探針。熒光報(bào)告基團(tuán)(R)標(biāo)記在探針的5′端，熒光淬滅基團(tuán)(Q)標(biāo)記在探針的3′端，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即熒光報(bào)告基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被熒光淬滅基團(tuán)吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時，抑制作用減弱，報(bào)告基團(tuán)熒光信號增強(qiáng)。在PCR過程中，探針同PCR產(chǎn)物雜交，由于Taq酶具有5′到3′的外切酶活性，在引物延伸階段將探針切斷，熒光淬滅基團(tuán)(Q)抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號增強(qiáng)。伴隨PCR產(chǎn)物的增加，熒光信號隨之增強(qiáng)，第n循環(huán)時的熒光信號增加值ΔRn等于Rn/Qn減去R0/Q0，Rn、R0分別為第n循環(huán)和PCR反應(yīng)開始時的報(bào)告基團(tuán)熒光值，Qn、Q0分別為第n循環(huán)和PCR反應(yīng)開始時的淬滅基團(tuán)熒光值。PCR反應(yīng)的第3-15個循環(huán)的熒光值作為熒光本底信號，3-15個循環(huán)的ΔRn的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍被設(shè)定為熒光閾值(thresho1d)，當(dāng)信號達(dá)到該熒光閾值時的循環(huán)次數(shù)(Ct值)同PCR反應(yīng)的初始模板量成正比。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT11品種，檢測IVS2和PAT基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-cgagggaacacgggagtctg-3’，該探針的最大序列是5’-tgtcgagatccgagggaacacgggagtc tgcccctgagac-3’，該探針的最小序列是5’-ggaacacgggag-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810品種，檢測Maize genome和CaMV35S基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-gcccagctatctgtcacttt-3’ ， 該探針的最大序列是5’-ctttgccattgcccagctatctgtcactttattgtgaaga-3’，該探針的最小序列是5’-agctatctgtca-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810品種，檢測HSP70和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-ccaactgacactatattgct-3’ ， 該探針的最大序列是5’-ctagtatctaccaactgacactatattgcttctctttaca-3’，該探針的最小序列是5’-ctgacactatat-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米176品種，檢測CDPK和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-atggacaacaaccccaacatc-3’，該探針的最大序列是5’-ggatccaacaatggacaacaaccccaacatcaacgagtgca-3’，該探針的最小序列是5’-caacaaccccaa-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14和/或T25品種，檢測PAT和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-atctgggaactactcacaca-3’，該探針的最大序列是5’-taattcccttatctgggaactactcacacattattatagaga-3’，該探針的最小序列是5’-gggaactactca-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14和/或T25品種，檢測CaMV35S和PAT基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-tggctctgtcctaaagttca-3’，該探針的最大序列是5’-tttgtggctctgtcctaaagttcactgtagacgtc-3’，該探針的最小序列是5’-tctgtcctaaag-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米CBH351品種，檢測Cry9C和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-cgtgcccgtgaacccagctc-3’，該探針的最大序列是5’-gatcgtgcccgtgaacccagctcgcgaggccga-3’，該探針的最小序列是5’-cccgtgaaccca-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米GA21品種，檢測OTP和mEPSPS基因的邊界相連基因片段的探針序列是5’-acctgccgccgctgtctatg-3’，該探針的最大序列是5’-cgctgtcgtacctgccgccgctgtctatggcgcccaccgt-3’，該探針的最小序列是5’-gccgccgctgtc-3’。
用于檢測玉米Zein內(nèi)源基因的探針序列是5’-taagatgccagctgcgattg-3’，該探針的最大序列是5’-gggtgataaaggtaagatgccagctgcgattgcctgttggatcc-3’，該探針的最小序列是5’-atgccagctgcg-3’。
按上述探針序列制成的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的試劑盒。
本發(fā)明的有益效果是通過檢測作物本身所具有的內(nèi)源參照基因(Endogenous Reference Gene)，如玉米的醇溶蛋白基因(Zein)，可以測定樣品中轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的總DNA模板量；通過檢測轉(zhuǎn)基因作物中轉(zhuǎn)入的外源基因，如IVS2和PAT基因的邊界相連基因片段等可以測定樣品中轉(zhuǎn)基因作物的DNA模板量，通過建立轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)參照樣品的內(nèi)源參照基因與外源基因Ct值之差(ΔCt)與轉(zhuǎn)基因成分百分含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出樣品及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測的引物和探針也可以對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性檢測，具有靈敏度高、避免交叉污染造成假陽性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)時熒光PCR技術(shù)采用完全閉管檢測，無需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽性。該技術(shù)巧妙地運(yùn)用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、核酸雜交的特異性和熒光檢測技術(shù)的快速和敏感性，使得本方法具有操作簡單、省時省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為實(shí)時熒光PCR檢測原理示意圖。
圖2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)時熒光檢測曲線圖。
(a)外源基因出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，(b)內(nèi)源參照基因出現(xiàn)PCR擴(kuò)增。
圖3非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)時熒光檢測曲線圖。
(a)外源基因未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，(b)內(nèi)源參照基因出現(xiàn)PCR擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測BT11玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因IVS2和PAT基因的邊界相連基因片段。
引物5’-ctgggaggccaaggtatctaat-3’5’-gctgctgtagctggcctaatct-3’。
探針5’-cgagggaacacgggagtctg-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT11品種的試劑盒。
實(shí)施例2用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測MON810玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因Maize genome和CaMV35S基因的邊界相連基因片段。
引物5’-t cgaaggacgaaggactctaacg-3’、5’-tccatctttgggaccactgtcg-3’。
探針5’-gcccagctatctgtcacttt-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810的Maizegenome和CaMV35S基因的邊界相連基因片段的試劑盒。
實(shí)施例3用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測MON810玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因HSP70和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段。
引物5’-agtttcctttttgttgctctcct-3’、5’-gatgtttgggttgttgtccat-3’。
探針5’-ccaactgacactatattgct-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810的HSP70和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段的試劑盒。
實(shí)施例4用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測176玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因CDPK和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段。
引物5’-ctctcgccgttcatgttcgt-3’、5’-ggtcaggctcaggctgatgt-3’。
探針5’-atggacaacaaccccaacatc-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米176的試劑盒。
實(shí)施例5用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測T14/T25玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因PAT和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段。
引物5’-atggtggatggcatgatgttg-3’、5’-tgagcgaaaccctataagaaccc-3’。
探針5’-atctgggaactactcacaca-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14/T25的PAT和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段的試劑盒。
實(shí)施例6用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測T14/T25玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因CaMV35S和PAT基因的邊界相連基因片段。
引物5’-ccttcgcaagacccttcctctata-3、5’-agatcatcaatccactcttgtggtg-3’。
探針5’-tggctctgtcctaaagttca-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14/T25的CaMV35S和PAT基因的邊界相連基因片段的試劑盒。
實(shí)施例7用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測CBH-351玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因Cry9C和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段。
引物5’-tactacatcgaccgcatcga-3’、5’-cctaattcccttatctggga-3’。
探針5’-cgtgcccgtgaacccagctc-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米CBH-351的試劑盒。
實(shí)施例8用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，檢測GA21玉米轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品外源基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因OTP和mEPSPS基因的邊界相連基因片段。
引物5’-acggtggaagagttcaatgtatg-3’、5’-tctccttgatgggctgca-3’。
探針5’-acctgccgccgctgtctatg-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米GA21的試劑盒。
實(shí)施例9用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，用于檢測玉米內(nèi)源基因。
檢測基因zein。
引物5’-cctatagcttcccttcttcc-3’、5’-tgctgtaatagggctgatga-3’。
探針5’-taagatgccagctgcgattg-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針制成的用于檢測玉米和/或轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)源基因的試劑盒。
檢測主要儀器超凈工作臺、消毒滅菌鍋、制冰機(jī)、核酸蛋白分析儀、高速冷凍離心機(jī)，臺式小型離心機(jī)，Mini個人離心機(jī)、低溫冰箱，冷藏冷凍冰箱、純水器、雙蒸水器、旋渦震蕩器、微量進(jìn)樣器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
檢測主要試劑10×PCR緩沖液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、引物和探針(按探針序列制成試劑盒)等。
實(shí)時熒光PCR檢驗(yàn)所用引物和探針序列如實(shí)施例1～9所述。
實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系試劑名稱 貯備液濃度 加入體積(μL)10×PCR緩沖液 5.0MgCl225mol/μL 5.0dNTP 2.5mol/μL 2.0UNG酶 1U/μL 0.5引物 20p mol/μL正0.25反0.25探針 10p mol/μL0.3Taq酶 5U/μL 0.25DNA模板a20ng/μL～30ng/μL 5μLddH2O 補(bǔ)足至反應(yīng)總體積50μL注1a為原料的模板量，加工產(chǎn)品應(yīng)視加工程度增加模板量。
注2不同儀器，PCR反應(yīng)體積不同，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整。
實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)為50℃/2min(使用UNG酶時需此步驟)，預(yù)變性95℃/10min，40個循環(huán)95℃/15s，60℃/1min。
注不同儀器應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。
儀器檢測通道的選擇PCR反應(yīng)管熒光信號收集的設(shè)置，應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。
上機(jī)運(yùn)行按預(yù)先設(shè)定的樣品擺放順序?qū)CR反應(yīng)管依次擺放上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器，開始運(yùn)行進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)。
結(jié)果分析與計(jì)算定性分析基線的設(shè)置實(shí)時熒光PCR反應(yīng)結(jié)束并分析后，應(yīng)設(shè)置無效基線范圍。無論采用任何熒光通道基線范圍選擇在3-20個循環(huán)；閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值＝40為準(zhǔn)。
結(jié)果判斷待測樣品外源基因檢測Ct值≥40，內(nèi)參照基因檢測Ct值23-30者，表明未檢出×××基因；待測樣品外源基因檢測Ct值28-34，內(nèi)參照基因檢測Ct值23-30者。表明檢出×××基因。
定量分析用EXCEL或其它方法計(jì)算數(shù)據(jù)，可以創(chuàng)建以DNA濃度(x)對應(yīng)循環(huán)數(shù)Ct值(Y)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對于樣品DNA的濃度，可以根據(jù)回歸方程logX＝Y(jié)-b/m計(jì)算(b為交叉點(diǎn)值，m為斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-內(nèi)源基因Ct值。將ΔCt值代入方程，即可得出樣品中某一外源基因的相對含量。
如圖2所示，(b)內(nèi)源基因出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，(a)外源基因也出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，表明該樣品檢測出了外源轉(zhuǎn)基因成分，即為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。
如圖3所示，(b)內(nèi)源基因出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增，(a)外源基因未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，表明該樣品未檢測出外源轉(zhuǎn)基因成分。
按常規(guī)探針制備合成方法制造。
權(quán)利要求
1.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT11品種，檢測IVS2和PAT基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-tgtcgagatccgagggaacacgggagtctgcccctgagac-3’，探針的最小序列是5’-ggaacacgggag-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT11品種，檢測IVS2和PAT基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-cgagggaacacgggagtctg-3’。
3.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810品種，檢測Maize genome和CaMV35S基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-ctttgccattgcccagctatctgtcactttattgtgaaga-3’，探針的最小序列是5’-agctatctgtca-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810品種，檢測Maizegenome和CaMV35S基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-gcccagctatctgtcacttt-3’。
5.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810品種，檢測HSP70和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-ctagtatctaccaactgacactatattgcttctctttaca-3’，探針的最小序列是5’-ctgacactatat-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810品種，檢測HSP70和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-ccaactgacactatattgct-3’。
7.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米176品種，檢測CDPK和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-ggatccaacaatggacaacaaccccaacatcaacgagtgca-3’，探針的最小序列是5’-caacaaccccaa-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米176品種，檢測CDPK和CryIA(b)基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-atggacaacaaccccaacatc-3’。
9.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14和/或T25品種，檢測PAT和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-taattcccttatctgggaactactcacacattattatagaga-3’，探針的最小序列是5’-gggaactactca-3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14和/或T25品種，檢測PAT和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-atctgggaactactcacaca-3’。
11.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14和/或T25品種，檢測CaMV35S和PAT基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-tttgtggctctgtcctaaagttcactgtagacgtc-3’，探針的最小序列是5’-tctgtcctaaag-3’。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米T14和/或T25品種，檢測CaMV35S和PAT基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-tggctctgtcctaaagttca-3’。
13.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米CBH351品種，檢測Cry9C和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-gatcgtgcccgtgaacccagctcgcgaggccga-3’，探針的最小序列是5’-cccgtgaaccca-3’。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米CBH351品種，檢測Cry9C和CaMV35S！基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-cgtgcccgtgaacccagctc-3’。
15.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米GA21品種，檢測OTP和mEPSPS基因的邊界相連基因片段的探針的最大序列是5’-cgctgtcgtacctgccgccgctgtctatggcgcccaccgt-3’，探針的最小序列是5’-gccgccgctgtc-3’。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米GA21品種，檢測OTP和mEPSPS基因的邊界相連基因片段的探針優(yōu)選序列是5’-acctgccgccgctgtctatg-3’。
17.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測玉米Zein內(nèi)源基因的探針的最大序列是5’-gggtgataaaggtaagatgccagctgcgattgcctgttggatcc-3’，探針的最小序列是5’-atgccagctgcg-3’。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是用于檢測玉米Zein內(nèi)源基因的探針優(yōu)選序列是5’-taagatgccagctgcgattg-3’。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18所述的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列，其特征是探針的5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，探針的3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。
20.用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的試劑盒，其特征是如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的探針序列制成的用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的試劑盒。
全文摘要
用于轉(zhuǎn)基因玉米實(shí)時熒光PCR檢測的探針序列和試劑盒，給出檢測轉(zhuǎn)基因玉米不同品種，檢測相應(yīng)外源基因、內(nèi)源基因的探針序列，最大、最小及優(yōu)選序列，按探針序列制成的試劑盒，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測和定性檢測，具有靈敏度高、避免交叉污染造成假陽性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)時熒光PCR技術(shù)采用完全閉管檢測，無需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽性。該技術(shù)巧妙地運(yùn)用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、核酸雜交的特異性和熒光檢測技術(shù)的快速和敏感性，使得本方法具有操作簡單、省時省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK1435489SQ02133170
公開日2003年8月13日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者曹際娟, 覃文 申請人:曹際娟, 覃文