專利名稱：重組人白細(xì)胞介素－2的三突變體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人白細(xì)胞介素-2的突變體及制備方法
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素-2(hIL-2)有三個半胱氨酸殘基，其中58位和105位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵，而125位的巰基游離，通過定點突變的方法用絲氨酸或丙氨酸取代125位的半胱氨酸，其活性升高。用其他的氨基酸取代125位的半胱氨酸的取代物活性幾乎都不變。雖然58位或105位半胱氨酸的取代物的塵物活性下降，然而58位半胱氨酸取代物的突變體與105位半胱氨酸取代物的突變體相比，活力下降20多倍。有可能58位半胱氨酸周圍的氨基酸序列起著重要作用。相比之下，在hIL-2的結(jié)構(gòu)功能中105位附近的氨基酸重要性差得多。另一方面，58位半胱氨酸取代物的突變體之所以失去活性可能是由于105和125位半胱氨酸之間形成錯配的分子內(nèi)二硫鍵。為了評價二硫鍵正確的重要性，分別用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成丙氨酸取代半胱氨酸的三位和二位的突變蛋白，取名A58/105/125和A58/125，在CTLL-2細(xì)胞上用胸苷法摻入分析顯示。雖然這兩個突變體與野生型hIL-2的活力相比只有0.5-2％，但它們比A58的活力多50-200倍，A58就是在58位用丙氨酸取代半胱氨酸的突變體。受體競爭結(jié)合實驗表明突變體A58/125和A58/105/125對于高親和力的IL-2受體比A58高5-25倍。這些結(jié)果表明突變體A58活力急劇下降，可能是因為105和125位半胱氨酸形成錯誤的二硫鍵(Rang Y，Lee N，Liang S.M.Analysis of IL-2 functional structure by multiplecysteine substitutions.Biochem.Biophys.Res.1992；188(2)945-955)。由于天然hIL-2中125Cys點突變?yōu)锳la或Ser得到的Ala125IL-2和Ser125IL-2具有不會形成二聚體，比活性高，熱穩(wěn)定性好，體內(nèi)半衰期延長等優(yōu)點。目前，兩種新型IL-2現(xiàn)已通過中試，進(jìn)入臨床試驗階段(唐建偉，劉愛萍，虞建良.兩種新型白細(xì)胞介素-2的熱穩(wěn)定優(yōu)越性.生物工程學(xué)報1996，12(4)，448-454.)。另外，hIL-2相鄰兩個位點的突變體(L18M/L19S)，又名2D1，在結(jié)構(gòu)完整性和與高親和力IL-2受體結(jié)合能力兩方面，都與野生型hIL-2相同。一般hIL-2/IL-2受體復(fù)合物通過受體介導(dǎo)的胞吞作用內(nèi)化進(jìn)入酸性胞內(nèi)小體(acidic endosomalcompartment)后，野生型hIL-2連同IL-2Rβγ往往被分選進(jìn)入溶酶體中降解，而釋放的α亞基返回到細(xì)胞表面重新進(jìn)入再循環(huán)(Fallon E.M，Liparoto S.F，Lee K.J et al.Increasedendosomal sorting of ligand to recycling enhances potency of an interleukin-2 analog.J.Biol.Chem.2000；275(10)6790-6797.)。但是2D1通過高親和力hIL-2受體介導(dǎo)內(nèi)化進(jìn)入酸性胞內(nèi)小體后，由突變蛋白帶來的胞內(nèi)小體中pH值的微小變化干擾了配體—受體相互作用，導(dǎo)致變異IL-2和IL-2受體復(fù)合物在胞內(nèi)的分選運輸過程改變，內(nèi)化的2D1中有一部分未被分選入溶酶體中降解而存留下來，且被分選進(jìn)入重新再循環(huán)。表現(xiàn)出經(jīng)測定的2D1半衰期比野生型hIL-2長36小時，因此2D1變異蛋白的促細(xì)胞分裂增殖作用得到很大增強(qiáng)，生物學(xué)活性提高2倍多(Hemar A，Subtil A，Lieb，M.J et al.Endocytosis ofinterleukin-2 receptors in human T lymphocytesdistinct intracellular localizationand fate of the receptor alpha，beta and gamma chains.J.Cell.Biol.1995；129(1)55-64.)。
長期以來，人們用大腸桿菌作為宿主表達(dá)了多種蛋白，其中包括IL-2。但這一系統(tǒng)本身也存在著若干缺陷①作為一種原核表達(dá)系統(tǒng)，缺少真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工，如剪切、糖基化，形成二硫鍵等；②表達(dá)的蛋白多以包含體形式存在，需要經(jīng)過復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性；③背景蛋白很多，純化麻煩；④表達(dá)量一般不是很高。從1997年開始，發(fā)展了酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。最先使用的是釀酒酵母，并且也用于表達(dá)了IL-2，但此系統(tǒng)也有其局限性，并不是理想宿主。如缺乏強(qiáng)有力的啟動子，分泌效率差，表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等。有鑒于此，人們發(fā)展了新一代的酵母表達(dá)系統(tǒng)-Pichia Pastoris巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)，即甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，甲醇酵母具有許多其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)所不具備的優(yōu)點①具有特有的強(qiáng)有力的醇氧化酶基因(AOXI)啟動子，用甲醇可以嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；②作為真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白可以進(jìn)行翻譯后的加工和修飾(如糖基化)，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性，③有完備的發(fā)酵方法，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重甚至可達(dá)120g/L以上；④營養(yǎng)要求低，生長快，可以在廉價的非選擇性培養(yǎng)基中生長，補(bǔ)充鹽、維生素即可，便于工業(yè)化生產(chǎn)；⑤表達(dá)量高，許多蛋白可達(dá)到每升克以上水平；⑥在Pichia Pastoris中表達(dá)的蛋白既可存在于胞內(nèi)，又可分泌至胞外。分泌的目的蛋白質(zhì)占所有被分泌蛋白的30％以上，并且Pichia自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于純化；⑦糖基化程度低。因此，這是一種非常先進(jìn)的表達(dá)系統(tǒng)。由此看來，利用分泌型巴斯德畢赤酵母來表達(dá)IL-2，是非常有效的。

發(fā)明內(nèi)容
由于IL-2在實際純化中二硫鍵的錯配，純化的IL-2不夠穩(wěn)定，終產(chǎn)率很低，所以本發(fā)明通過改變IL-2的結(jié)構(gòu)和更換表達(dá)載體及系統(tǒng)來克服這些缺點。
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人白細(xì)胞介素-2的三位點突變體及制備方法，提高人白細(xì)胞介素-2的產(chǎn)量和活性。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是將人天然IL-2的18位Leu換成Met，19位Leu換成Ser，125位Cys換成Ala，得到一個三位點突變重組人白細(xì)胞介素-2，如圖2和圖3所示。
三位點突變重組人白細(xì)胞介素-2其制備方法是設(shè)計4條核苷酸引物(1)引物1，5′GCGAATTCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGCAAAGG 3′(2)引物2，3′CTGTAAATCAGACAATTAAATG 5′(3)引物3，5′GCACGTTACGTAAGCACCTACTTCAAGTTCTAC 3(4)引物4，5′GCATTTAATGTCTGATTTACAG 3′其中引物1和引物4為一組，引物2和引物3為一組，以天然人白細(xì)胞介素-2cDNA為模板進(jìn)行PCR，將前兩組的PCR產(chǎn)物合并，以引物1和引物3對合并的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第3次PCR。引物1(L2TM3)中含EcoR I酶切位點，終止密碼，125位Cys換成Ala和成熟人IL-23′末端部分氨基酸編碼基因的一互補(bǔ)序列，引物2(L2TMAS)，引物3(L2TM5)含SnaB I酶切位點，起始密碼和成熟人IL-25′末端部分氨基酸編碼序列，引物4(L2TMS)為突變引物，其中18位、19位亮氨酸分別突變成18位Met和19位Ser。經(jīng)過3次PCR后，獲得三位點突變?nèi)税准?xì)胞介素-2的DNA片段，低熔點瓊脂糖電泳回收0.4kb帶。最終得到的PCR產(chǎn)物為含有SnaBI和EcoR I酶切位點及18位、19位和125位突變的IL-2DNA片段，回收，用SnaB I和EcoRI酶切酶切，回收，然后克隆到pPIC9K真核表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化TOP10F‘菌株，鑒定后擴(kuò)增。得到pPIC9K-18Met-19Ser-125Ala-rhIL-2質(zhì)粒，測序結(jié)果如圖2所示。證明18位CTG換成了ATG，19位CTG換成了TCT，125位TGT換成了GCG，是我們需要的三位點突變?nèi)税准?xì)胞介素-2。然后將pPIC9K-18Met-19Ser-125Ala-rhIL-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化KM71巴斯德畢赤酵母，得到宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母KM71/pPIC9K-18Met-19Ser-125Ala-rhIL-2，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，從其發(fā)酵上清液中獲得三位點突變?nèi)税准?xì)胞介素-2蛋白，通過WESTERN BLOT檢測(圖4)和N端測序證明是我們的突變蛋白。通過選用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂及凝膠柱純化分離三位點突變重組人白細(xì)胞介素-2，可得到95％以上純度的目的產(chǎn)物。用CTLL-2細(xì)胞對三位點突變重組人白細(xì)胞介素-2進(jìn)行測活，其活性比標(biāo)準(zhǔn)品高4.3倍。
通過結(jié)構(gòu)改變和更換表達(dá)載體及系統(tǒng)的IL-2至少有以下幾個優(yōu)點第一，提高白細(xì)胞介素-2的活性，比標(biāo)準(zhǔn)品高4.3倍左右。
第二，提高白細(xì)胞介素-2的穩(wěn)定性。由于野生型白細(xì)胞介素-2分子中125位半胱氨酸是游離的，易于與58位或105位的半胱氨酸形成錯配的二硫鍵、或分子間形成二硫鍵導(dǎo)致二聚體的形成，不利于白細(xì)胞介素-2的穩(wěn)定，125位丙氨酸型白細(xì)胞介素-2則不存在二硫鍵錯配的問題。此外，由于酵母對白細(xì)胞介素-2進(jìn)行的糖基化修飾作用，使白細(xì)胞介素-2不易聚集沉淀。
第三，易于純化，在重組白細(xì)胞介素-2的純化過程中，白細(xì)胞介素-2要被還原劑還原為一級結(jié)構(gòu)，然后再氧化為有活性的白細(xì)胞介素-2，由于125位半胱氨酸是游離的，易于與58位或105位的半胱氨酸形成錯配的二硫鍵導(dǎo)致異構(gòu)體的形成或分子間形成二硫鍵導(dǎo)致二聚體的形成，這些形成的異構(gòu)體和二聚體一方面給純化帶來麻煩/另一方面比活性低。125位半胱氨酸被丙氨酸取代的白細(xì)胞介素-2則不存在二硫鍵錯配的問題，因而有利于白細(xì)胞介素-2的純化。另外，由分泌型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)分泌白細(xì)胞介素-2，背景蛋白非常少，很易于純化。
第四，翻譯后加工修飾能力強(qiáng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾，從而得到更接近于人體內(nèi)源性IL-2的產(chǎn)物。
通過本發(fā)明的特別設(shè)計，充分體現(xiàn)出本發(fā)明IL-2的高活性和表達(dá)載體和/或工程菌的高效性。


圖1是pPIC9K-18Met-19Ser-125Ala-rhIL-2質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
圖2是天然hIL-2和三位點突變rhIL-2基因的序列比較。
圖3是人IL-2的氨基酸序列與三位點突變rhIL-2氨基酸序列的比較。
圖4是三位點突變rhIL-2表達(dá)產(chǎn)物印跡分析圖。
圖5是MTT法測定三位點突變rhIL-2活性6是三位點突變rhlL-2活性單位的直接作圖法
1將篩選出His+Muts單克隆(三位點突變rhIL-2)接種于2mL YPD試管，30℃ 300rpm培養(yǎng)過夜，以1％接種入含100mL BMGY的500三角瓶。30℃ 300rpm培養(yǎng)至OD600＝3～6(大約16～18小時)。
2室溫下1500～3000xg離心5min收集菌體細(xì)胞。誘導(dǎo)表達(dá)，棄去上清液并將菌體細(xì)胞沉淀懸浮在BMMY培養(yǎng)基中，用1/5到1/10的原初始培養(yǎng)液體積(大約10～20mL)。
3將菌體懸浮液置于100mL三角瓶中，用2層滅菌的紗布或沙罩蓋上三角瓶，再放回培養(yǎng)箱繼續(xù)生長。
4每24小時加100％甲醇至終濃度為0.5％，保持誘導(dǎo)。
5下列的每個時間都要轉(zhuǎn)移1mL表達(dá)液到1.5mL離心管中，時間點(小時)為0，24(1天)，48(2天)，72(3天)，96(4天)，120(5天)和144(6天)。這些樣品將用來分析表達(dá)水平并確定誘導(dǎo)后最合適的時間來收獲上清液。室溫下用臺式離心機(jī)以最大速度離心2～3min。
6轉(zhuǎn)移上清液到不同的管子里，-80℃貯存上清液和細(xì)胞沉淀直至準(zhǔn)備分析。液氮或干冰/乙醇浴快速冷凍。
7 SDS-PAGE用銀染或考馬斯亮藍(lán)染色和Western-blot活性分析來分析三位點突變rhIL-2的表達(dá)。
8按照SDS-PAGE要求對三位點突變rhIL-2進(jìn)行電泳分離。
9電轉(zhuǎn)移通過電流使凝膠相中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜(NC膜)上。將凝膠從玻璃板內(nèi)取出后，將凝膠緊貼于硝酸纖維素薄膜上(先用電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡硝酸纖維素薄膜30分鐘)，用夾心方法把濾紙、凝膠、硝酸纖維素薄膜、濾紙依順序放好，然后用海綿布、篩孔板固定好，插入電轉(zhuǎn)移槽中，并加入轉(zhuǎn)移緩沖液，保證凝膠在陰極、NC膜在陽極方向。電轉(zhuǎn)移條件為90伏，2小時，4℃。電轉(zhuǎn)移操作不要有氣泡出現(xiàn)在里面。
10電轉(zhuǎn)移完畢后，將NC膜置于10mL對NC膜合適的封閉液中，放在塑料盤里，置于搖床上旋轉(zhuǎn)，大約1次/秒，搖動30min。這一步封閉后，棄去封閉液。
11用20mL雙蒸水漂洗膜5min，然后棄去水，重復(fù)操作一次。
12將膜放在10mL一抗緩沖液，37℃孵育1小時與第一抗體反應(yīng)，然后棄去溶液。
13用20mL稀釋的抗體洗液洗膜5min，棄去洗液，重復(fù)操作三次。
14將膜放在10mL二抗緩沖液，37℃孵育30min，與酶標(biāo)記第二抗體反應(yīng)，然后棄去溶液。
15用20mL抗體洗液洗膜5min，棄去洗液，重復(fù)操作三次以上。
16用20mL雙蒸水漂洗膜2min，然后棄去水。重復(fù)兩次。
17將膜放在5mL顯色底物緩沖液里孵育直到紫色條帶出現(xiàn)在膜上。這種變化可以在1～60min內(nèi)完成。
18用20mL雙蒸水漂洗膜2min，然后棄去水。重復(fù)兩次。
19將膜放在一張干凈的濾紙上在空氣中吹干，也可以通過一束經(jīng)微的熱空氣吹干或置于紅外燈下干燥(圖4)。
實施例II一、三位點突變rhIL-2的純化及活性測定有關(guān)rhIL-2的純化多限于從大腸桿菌中提取，用巴斯德畢赤酵母表達(dá)及純化分泌型天然及突變型rhIL-2還是首次，從該表達(dá)系統(tǒng)中純化三位點突變rhIL-2是一個全新的探索過程。我們摸索了一套最簡單，快速的純化步驟。
甲醇誘導(dǎo)3天后，4℃，15000rpm離心10min，上清液立即加入PMSF(絲氨酸蛋白酶的抑制劑)至1mmol/L或者5～10mmol/L EDTANa2，防止蛋白酶的作用，-20℃凍存。分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液的體積很大，但濃度較低，因此必須在純化前進(jìn)行濃縮，純化時在冷柜操作，上清液用0.45μm膜過濾以防微小顆粒對濾膜堵塞。過濾后得到備好的發(fā)酵上清液200mL，用MW＝30000的膜截流，加雙蒸水(相當(dāng)于5個體積的發(fā)酵液)，循環(huán)濾過，最后棄去杯中濃縮液(很少)。除去MW大于30000的雜質(zhì)。收集過濾液(含有三位點突變rhIL-2)，冷凍干燥濃縮至200mL，電泳檢測。
再用MW＝10000的膜截流，加50mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH3.5)約5～10個體積(將杯內(nèi)的濾過液替換成緩沖液)，濃縮成約200mL(或更少)，除去MW小于10000的雜質(zhì)并濃縮，取微量進(jìn)行電泳檢測。余下的用于離子交換。離子交換柱層析我們選用強(qiáng)陽離子交換柱，pH3.5，在這個pH下三位點突變rhIL-2是可溶的，而且大多數(shù)畢赤酵母蛋白不會吸附到這種樹脂上，可以獲得很好的純化效果，洗脫后可以得到85％純度的三位點突變rhIL-2。凝膠排阻色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后，這樣可以提高分離效果。凝膠過濾色譜放在最后一步不僅起到進(jìn)一步純化的結(jié)果，而且可以直接過渡到適當(dāng)?shù)木彌_體系中，以利于產(chǎn)品成形保存。我們選用SephadexG-100分子篩柱層析作為純化三位點突變rhIL-2的最后一步，根據(jù)分子量的大小進(jìn)行分離純化，經(jīng)凝膠過濾層析可以得到95％以上純度的三位點突變rhIL-2(圖4)。其操作過程如下1處理好的發(fā)酵液(其中含三位點突變rhIL-2)2選用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(Bio-Rad公司提供的Macro-PrepS Support，作用基團(tuán)-SO3-)50mmol/L乙酸乙酸鈉緩沖液(PH3.5)平衡柱體，柱體大小2.5×30cm3上處理好的發(fā)酵液(其中含三位點突變rhIL-2)，50mmol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液(PH3.5)沖洗，同時使三位點突變rhIL-2結(jié)合S柱。
4用50mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(含0～1mol/L NaCL)進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫5收集含三位點突變rhIL-2洗脫液(電泳檢測其存在部位)6脫鹽，冷凍干燥后的樣品溶于少量pH7.0(0.1mol/L)乙酸銨緩沖液7上SephadexG-100層析柱(1.5×80cm)8柱子經(jīng)平衡液(0.1mol/L N4HAC緩沖液pH7.0，內(nèi)含5mmol/LEDTANa2，2mmol/L巰基乙醇)平衡過夜。上樣后，用上述平衡液進(jìn)行洗脫。
9收集含三位點突變rhIL-2洗脫液(電泳檢測其存在部位)10取適量Eppendof管，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等做相應(yīng)標(biāo)記。
11制備細(xì)胞懸液收集CTLL-2細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液{1640培養(yǎng)液加10％小牛血清(V/V，GIBCO 26140-079)或新生小牛血清(無支原體)。4℃條件下保存}洗3次，每次2000rpm離心5min。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液配成5.0×6.0×105/mL的細(xì)胞懸液，置于37℃條件下保存?zhèn)溆谩?br> 12制備樣品溶液取一支標(biāo)準(zhǔn)品按說明書配成標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。取規(guī)定數(shù)量的待檢測樣品按說明書配成待檢樣品溶液。
13制備樣本溶液用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液稀釋至200IU/mL。根據(jù)情況用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將待檢三位點突變rhIL-2溶液稀釋至約200IU/mL，每步稀釋不得超過10倍。按以上預(yù)稀釋程序制備的溶液稱為樣本溶液。
14制備樣本梯度在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50μL完全培養(yǎng)液。在A4～6各孔加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在A1～3，A7～9，A10～12各孔中每孔加入50μL三位點突變rhIL-2溶液，每個待檢樣品做3個復(fù)孔，自A行到H行作對倍稀釋，每孔留50μL余液。其中H4～6三孔留作空白。
15加入細(xì)胞懸液并培養(yǎng)每孔加入50μL細(xì)胞懸液，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)18～24小時(至第H4～6各孔存活細(xì)胞不足A4～6各孔的110％)。
(第二天)16加入MTT溶液并培養(yǎng)每孔加入20μL MTT溶液，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)4～6小時。
17加入裂解液(十二烷基磺酸鈉SDS，分析純產(chǎn)品，用蒸餾水配成15％的溶液。使用期限不得超過12個月)并保溫。每孔加入150μL裂解液，37℃條件下保溫18～24小時。
(第三天)18測定OD值在酶標(biāo)儀上比色，測定波長570nm，參比波長690 nm，記錄測定結(jié)果(圖5)。
19生物學(xué)活性檢測法的結(jié)果可用能誘導(dǎo)50％最大反應(yīng)的待測樣品最高稀釋濃度作為參考效價(或滴度)，或者以此稀釋度中所包含細(xì)胞因子的量為1單位(U)，即以此稀釋度的倒數(shù)為待測樣品中所含細(xì)胞因子所含的單位數(shù)。通常用直接作圖法來計算待測樣品的活性單位或濃度。用IL-2標(biāo)準(zhǔn)品和三位點突變rhIL-2待測樣品的稀釋度為橫坐標(biāo)，MTT的測定值(OD值)為縱坐標(biāo)作圖。在IL-2標(biāo)準(zhǔn)品最大OD值的50％處作一條與橫坐標(biāo)平行的直線，此直線與各曲線有相交點，分別相交點向橫坐標(biāo)作垂線，得到IL-2標(biāo)準(zhǔn)品和各三位點突變rhIL-2待測樣品的與50％最大OD值相對應(yīng)的稀釋度。測定的三位點突變rhIL-2活性比天然IL-2活性高4.3倍左右(圖6)。
權(quán)利要求
1.一種重組人白細(xì)胞介素-2的三突變體，其特征在于將天然人白細(xì)胞介素-2(hIL-2)的18位亮氨酸(Leu)換成蛋氨酸(Met)，19位亮氨酸換成絲氨酸(Ser)、125位半胱氨酸(Cys)換成丙氨酸(Ala)。
2.一種重組人白細(xì)胞介素-2的三突變體制備方法，其特征在于(1)引物設(shè)計設(shè)計4條核苷酸引物引物1，5′GCGAATTCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGCAAAGG 3′引物2，3′CTGTAAATCAGACAATTAAATG5′，引物3，5′GCACGTTACGTAAGCACCTACTTCAAGTTCTAC 3，引物4，5′GCATTTAATGTCTGATTTACAG 3′。其中引物1和引物4為一組，引物2和引物3為一組，以天然人白細(xì)胞介素-2cDNA為模板進(jìn)行PCR，將前兩組的PCR產(chǎn)物合并，以引物1和引物3對合并的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第3次PCR，引物1(L2TM3)中含EcoR I酶切位點，終止密碼，125位Cys變?yōu)锳la和成熟人IL-23′末端部分氨基酸編碼基因的一互補(bǔ)序列，引物2(L2TMAS)，引物3(L2TM5)含SnaB I酶切位點，起始密碼和成熟人IL-25′末端部分氨基酸編碼序列，引物4(L2TMS)為突變引物，其中18位、19位亮氨酸分別突變成18位Met和19位Ser。經(jīng)過3次PCR后，獲得三位點突變?nèi)税准?xì)胞介素-2的DNA片段，低熔點瓊脂糖電泳回收0.4kb帶，最終得到的PCR產(chǎn)物為含有SnaB I和EcoR I酶切位點及18位、19位和125位突變的IL-2DNA片段；(2)亞克隆將三位點突變?nèi)税准?xì)胞介素-2的DNA片段用SnaB I和EcoR I酶切，回收，然后克隆到pPIC9K真核表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化TOP10F‘菌株，鑒定后擴(kuò)增。得到pPIC9K-18Met-19Ser-125Ala-rhIL-2質(zhì)粒。測序結(jié)果如圖2所示。證明18位CTG換成了ATG，19位CTG換成了TCT，125位TGT換成了GCG，是我們需要的三位點突變?nèi)税准?xì)胞介素-2；(3)轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)然后將pPIC9K-18Met-19Ser-125Ala-rhIL-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化KM71巴斯德畢赤酵母，得到宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母KM71/pPIC9K-18Met-19Ser-125Ala-rhIL-2，通過誘導(dǎo)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，從其發(fā)酵上清液中獲得三位點突變?nèi)税准?xì)胞介素-2蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人白細(xì)胞介素－2的三突變體及制備方法，目的是利用基因工程手段對人白細(xì)胞介素－2(hIL－2)進(jìn)行改造，制備的三位點突變白細(xì)胞介素－2證明比天然人白細(xì)胞介素－活性高4.3倍。通過獲得三位點突變白細(xì)胞介素－2cDNA，構(gòu)建pPIC9K－IL－2－3m質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入KM71巴斯德畢赤酵母，從pPIC9K－IL－2－3m KM71酵母發(fā)酵上清液中獲得三位點突變白細(xì)胞介素－2蛋白。即將天然白細(xì)胞介素－2的18位、19位和125位氨基酸分別換成蛋氨酸、絲氨酸和丙氨酸。
文檔編號C12N15/19GK1442427SQ0213353
公開日2003年9月17日 申請日期2002年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月23日
發(fā)明者歐陽克清, 胡應(yīng)和, 蔣紅詩, 李新平, 劉堰, 蔡紹皙, 陳榮高, 唐宜國 申請人:重慶大學(xué), 四川成都榮高實業(yè)集團(tuán)有限公司