專利名稱：應用pcr－sscp－str技術篩測21三體綜合征的方法
技術領域：
分子生物學背景技術 21三體綜合征(又稱先天愚型或Down綜合征)是人類最常見的染色體病，在活產嬰中其發(fā)病率約為1/600-1/800，我國21三體綜合征的總現患率為0.47‰，城市為0.26‰，農村為0.56‰[1]?；颊咧饕Y狀為先天性智力發(fā)育低下，還常伴有先天性心臟病等疾患。目前尚無有效治療方法，因此對Down綜合征胎兒進行產前診斷具有重要意義，從70年代開始我國開展了對21三體綜合征的產前診斷，主要是用細胞培養(yǎng)，染色體制備的方法，這種方法費時較長，技術要求較高，難于適用大規(guī)模的產前普查。90年代初國外學者報導了通過熒光標記技術，用PCR方法快速診斷Down綜合征[5-10]。人類基因組的STR位點遵循孟德爾的遺傳規(guī)律，STR具有高度的多態(tài)性，80年代后期許多研究開始使用STR作為DNA的標志物，設計引物進行PCR擴增特定染色體序列，應用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性(PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析方法，來檢測DNA中的微小堿基變化。這種方法能快速、靈敏地檢測基因突變和多態(tài)性。正常人DNA的STR位點有2對等位基因，而21三體綜合征患者因為多了一條染色體，所以DNA的STR位點。有6對等位基因。通過引物對進行PCR擴增多態(tài)性的DNA序列后，單鏈DNA在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，DNA構象差異將出現泳動變位，表現出電泳帶位置的差異。發(fā)明目的 本發(fā)明應用短串聯(lián)重復序列(Short tandem repeat，STR)作為遺傳標記，通過聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增，應用單鏈構象多態(tài)性(Single strand conformation polymorphism，SSCP)分析技術，能夠在分子水平上簡便、快速和準確地診斷21三體綜合征。

發(fā)明內容
本發(fā)明應用短串聯(lián)重點序列作遺傳標記，在21三體綜合征的關鍵區(qū)位選擇了2個STR位點，它們分別位于D21S1414和D21S1411位點，與Down綜合征核心區(qū)緊密連鎖[11]。設計2對引物，通過聚合酶鏈反應，對這2對等位基因進行PCR擴增。具體步驟如下1、PCR擴增 采用2針對D21S1411和D21S11的特異引物[3]PCR擴增21號染色體2個短串聯(lián)重復位點(short tandom repeat，STR)，反應體系總體積50μl，含基因組DNA 0.1μg，引物0.5μmol/L，dNTP 100μmol/L，TaqDNA聚合酶2.0U，緩沖液5μl，最后加滅菌蒸餾水使反應體積為50μl。所有樣品統(tǒng)一混合反應液分裝，用滅菌礦物油覆蓋。反應條件為95℃變性5分鐘，接著運行30個循環(huán)(95℃變性45秒鐘-60℃退火35秒鐘-70℃延伸45秒鐘)，最后72℃延伸5分鐘。引物序列為5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’，5’-tat-gtg-agt-caa-ttc-ccc-aag-tga-3’，5’-gtt-gta-tta-gtc-aat-gtt-ctc-cag-3’。2、低離子強度(low ironic strength，LIS)SSCP分析參照文獻[4]LIS-PCR-SSCP方法制備8％聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TBE電泳緩沖液。將擴增產物2ul加入20ul 1×LIS緩沖液混合，98℃變性5min，取10ul上樣，25℃300V電壓，預電泳15分鐘，電泳分離5-9小時。電泳結束后，取下凝膠，放入1％冰乙酸中固定10分鐘，然后放入0.2％硝酸銀中染色20分鐘，最后放入顯色液(1.5氫氧化鈉-0.4％甲醛)中顯色。干膠。觀察結果并照像，本發(fā)明對19例Down綜合征患兒及其父母和3例Down綜合征胎兒及其父母進行了檢測分析。提取基因組DNA，進行PCR擴增，變性為單鏈DNA后，分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳5-9小時。經銀染色后干膠，觀察結果并照像。本發(fā)明對19例Down綜合征患兒及其父母和3例Down綜合征胎兒及其父母進行了檢測分析。提取基因組DNA，進行PCR擴增，變性為單鏈DNA后，分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳6-15小時。經銀染色后干膠，觀察結果并照像。22例21三體綜合征患者及其父母在D21S1414和D21S1414位點經一對引物(5’-aaa-tta-gtg-tct-ggc-acc-cag-ta-3’，5’-caa-ttc-ccc-aag-tga-att-gcc-ttc-3’)擴增后，片段長度約為239bp。21例患者PCR-SSCP構象與母源的構象完全相同，與父源的構象部分相同。一例與母源和父源的構象均相同，父母為純合子。22例患者及其父母在D21S1414和D21S1411位點經一對引物(5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’)擴增后片段長度約為172bp。22例患者PCR-SSCP構象與母源的構象完全相同，與父源的構象部分相同。研究結果表明，21三體綜合征患者因為較正常人多了一條染色體，用PCR擴增DNA上的STR位點，通過SSCP分析技術可明確患兒的染色體數目，并且明確確定多出來的染色體的父母來源。
本發(fā)明的方法采用多個位點的STR作為21三體綜合征的遺傳標記，應用PCR-SSCP分析技術，診斷21三體綜合征是定性方法，敏感性強，準確率較高，且方法簡便、快速，避免了細胞培養(yǎng)、熒光雜交等復雜實驗操作。一次性可同時完成多個標本的檢測，可作為大規(guī)模的產前普查的方法。


圖PCR-SSCP-STR分析21三體綜合癥泳道1-3擴增D21S1411的分析結果，泳道4-6分別擴自D21S11，1和4，2和5，3和6分別擴增自為母親、父親、21三體患兒。Fig.1Analysis trisomy 21 by PCR-SSCP-STR.Lane 1，4 amplifiedfrom the mother of arisomy 21 child，lane2，5 amplified from the father，lane3，6 from trisomy 3，6.LIS-SSCP實施例應用D21S1411和D21S11-SSCP分析結果，PCR擴增產物單鏈DNA構象凝膠電泳檢測結果，22例患者及其父母PCR擴增產物單鏈DNA電泳后，21例Down綜合征患者PCR擴增產物單鏈DNA構象與母源的構象完全相同，與父源的構象部分相同。一例與母源和父源的構象均相同。如圖所示為典型的SSCP分析結果(Fig.l)，LIS-SSCP-STR顯示，21三體患兒的電泳帶型包含母親的全部帶型，而僅含父親的部分帶型，提示在所分析的21號染色體STR位點中，患兒均有母親2個等位STR位點，而僅含1個父親的等位STR位點，即遺傳了母親的2條21號染色體和父親的1條染色體，為21三體患兒。
權利要求
1.一種應用PCR-SSCP-STR技術分子篩查21三體綜合征的方法，其特征是應用短串聯(lián)序列作遺傳標記，在21三體綜合征的關鍵區(qū)位選擇STR位點，設計2對引物，通過聚合酶鏈反應，對這2對等位基因進行PCR擴增。具體步驟如下1)、PCR擴增 采用2針對D21S1411和D21S11的特異引物[3]PCR擴增21號染色體2個短串聯(lián)重復位點(short tandom repeat，STR)，反應體系總體積50μl，含基因組DNA 0.1μg，引物0.5μmol/L，dNTP 100μmol/L，TaqDNA聚合酶2.0U，緩沖液5μl，最后加滅菌蒸餾水使反應體積為50μl。所有樣品統(tǒng)一混合反應液分裝，用滅菌礦物油覆蓋。反應條件為95℃變性5分鐘，接著運行30個循環(huán)(95℃變性45秒鐘-60℃退火35秒鐘-70℃延伸45秒鐘)，最后72℃延伸5分鐘。引物序列為5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’，5’-tat-gtg-agt-caa-ttc-ccc-aag-tga-3’，5’-gtt-gta-tta-gtc-aat-gtt-ctc-cag-3’。2)、低離子強度(low ironic strength，LIS)SSCP分析參照文獻[4]LIS-PCR-SSCP方法制備8％聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TBE電泳緩沖液。將擴增產物2ul加入20ul 1×LIS緩沖液混合，98℃變性5min，取10ul上樣，25℃300V電壓，預電泳15分鐘，電泳分離5-9小時。電泳結束后，取下凝膠，放入1％冰乙酸中固定10分鐘，然后放入0.2％硝酸銀中染色20分鐘，最后放入顯色液(1.5氫氧化鈉-0.4％甲醛)中顯色。干膠。觀察結果并照像。
2.根據權利要求1中所述的方法，其特征在于在21三體綜合征的關鍵區(qū)位，選擇了兩個STR位點，分別位于D21S1411和D21S11，與Down綜合征核心區(qū)緊密連鎖。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學。21三體綜合征(又稱先天愚型綜合征)，是人類最常見的染色體病，現有的檢測方法費時較長，技術要求高，不適合大規(guī)模的產前普查。本發(fā)明提出一種應用PCR－SSCP－STR技術篩查21三體綜合征的方法，該方法敏感性強，準確率較高，且方法簡便、快速，避免了復雜的手續(xù)，可作為大規(guī)模產前普查的方法。
文檔編號C12Q1/16GK1390952SQ02134208
公開日2003年1月15日 申請日期2002年6月18日 優(yōu)先權日2002年6月18日
發(fā)明者楊琳琳 申請人:楊琳琳