專利名稱：一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性的檢測方法，更具體地說是一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法。
促進肝細胞再生是防治肝損傷的關(guān)鍵，而肝細胞的再生受多種細胞因子的調(diào)控，其中肝細胞生長素(hepatocyte stimulatory substance，HSS)是促進肝細胞增殖、修復(fù)肝損傷的一個重要因子。HSS的研究成為近十年肝病防治領(lǐng)域研究的一個熱點，已有多家單位研制出了重組人肝細胞生長素(recombinant human hepatocyte stimulatorysubstance，rhHSS)，rhHSS有希望開發(fā)成治療肝病的新生物制品藥物。
與化學(xué)藥物不同，蛋白質(zhì)類藥物的藥效體現(xiàn)于細胞因子的生物活性，具有生物活性的細胞因子才會有藥效，同時生物活性的大小也影響藥效的大小，所以細胞因子類藥物的活性檢測是藥物質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。目前已報道的rhHSS活性檢測方法主要包括(1)體內(nèi)檢測方法制作小鼠CCL4肝損傷模型。分組給藥后觀察動物病死率、血液生化改變及肝臟病理改變，需耗時二周以上；(2)體外細胞同位素檢測方法制備原代培養(yǎng)的肝細胞或傳代HTC(hepatocyte cancer)肝癌細胞，分組加藥培養(yǎng)后，加入H3-胸腺嘧啶(H3-TdR)進行液閃計數(shù)。上述方法主要存在以下不足(1)體內(nèi)檢測方法操作復(fù)雜、結(jié)果變異大、耗時長，不宜作為藥品活性檢測的常規(guī)方法；(2)體外細胞同位素檢測方法存在放射線污染、變異大等不足，操作也較復(fù)雜。
本發(fā)明的目的采所用的技術(shù)方案是以巰基氧化酶活性檢測rhHSS產(chǎn)品的生物學(xué)活性。
本發(fā)明的技術(shù)方案為arhHSS與過量黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleofide，F(xiàn)AD)混合，至二者充分結(jié)合，除去剩余的FAD；b將含有游離巰基的底物溶于緩沖液中，然后調(diào)節(jié)pH值至酸性；c.上述底物與rhHSS溶于緩沖液中，迅速取出部分樣品，加入緩沖液與5，5，-二硫基雙-2-硝基苯甲酸(dithio-bis-(nitrobenzoic acid，DTNB)定空白；取出部分樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔固定時間測定一次；作出時間/巰基含量圖，計算巰基的含量。
作為改進，本發(fā)明的技術(shù)方案為arhHSS與過量FAD混合至二者充分結(jié)合，透析或者凝膠層析除去剩余的FAD；b將含有游離巰基的底物溶于緩沖液中，然后調(diào)節(jié)pH值至酸性；c上述底物與rhHSS溶于緩沖液中，迅速取出部分樣品，加入緩沖液與5，5，-二硫基雙-2-硝基苯甲酸(dithio-bis-(nitrobenzoic acid，DTNB)定空白；取出部分樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔固定時間測定一次；作出時間/巰基含量圖，計算巰基的含量。
本發(fā)明實施優(yōu)選的技術(shù)方案為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，凝膠層析除去剩余的FAD；b還原型溶菌酶的制備溶菌酶溶于Tris緩沖液中，緩沖液包含鹽酸胍和EDTA，加入DTT(dithiotheitol)。過夜。然后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值，以含醋酸、EDTA和尿素的脫氧緩沖液平衡、洗脫，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱除去DTT。crhHSS氧化巰基活性的測定上述還原型溶菌酶與a步驟所得的rhHSS溶于含有尿素和EDTA的磷酸緩沖液中，迅速取出部份樣品，加入含尿素和EDTA的磷酸緩沖液與DTNB定空白。兩分鐘后，再取出部分樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔60分鐘測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
作為進一步的改進，本發(fā)明的技術(shù)方案為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，以SephadexG-25凝膠柱除去剩余的FAD；b還原型溶菌酶的制備20mg溶菌酶溶于1ml 100mM Tris緩沖液(含6M鹽酸胍+0.3mMEDTA)中，加入DTT至終濃度為6mM。在pH8.0，37℃下過夜。然后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.5，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱除去DTT，平衡、洗脫脫氧緩沖液為含0.1％醋酸(v/v)和0.3mM EDTA的8M尿素。crhHSS氧化巰基活性的測定75nmol上述還原型溶菌酶與從a步驟所得的200pmol rhHSS溶于1.2ml pH7.5的磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)中，迅速取出200μl，加入790μl磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)與10μl 1mmol/L DTNB于412nm處定空白。兩分鐘后，再取出200μl樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔60分鐘測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
本發(fā)明實施另一優(yōu)選的技術(shù)方案為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，凝膠層析除去剩余的FAD；brhHSS氧化巰基活性的測定還原型谷胱甘肽與a步驟所得的rhHSS溶于含有尿素和EDTA的磷酸緩沖液中，迅速取出部份樣品，加入含尿素和EDTA的磷酸緩沖液與DTNB定空白。兩分鐘后，再取出部分樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔5h測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
作為進一步的改進，本發(fā)明的技術(shù)方案為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，以SephadexG-25凝膠柱除去剩余的FAD；brhHSS氧化巰基活性的測定100nmol還原型谷胱甘肽與從a步驟所得的200pmol rhHSS溶于1.2ml pH7.5的磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)中，迅速取出200μl，加入790μl磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)與10μl 1mmol/L DTNB于412nm處定空白。兩分鐘后，再取出200μl樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔5h測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
采用本發(fā)明的檢測方法，具有操作簡單，無放射性污染，省時，變異小，重復(fù)性好，不需特殊儀器設(shè)備等特點，克服了現(xiàn)存方法的不足。
圖2是與FAD結(jié)合的rhHSS對還原型谷胱甘肽的影響。
具體實施例2arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，以SephadexG-25凝膠柱除去剩余的FAD；brhHSS氧化巰基活性的測定100nmol還原型谷胱甘肽與從a步驟所得的200pmol rhHSS溶于1.2ml pH7.5的磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)中，迅速取出200μl，加入790μl磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)與10μl 1mmol/L DTNB于412nm處定空白。其它對照組加等量或等體積的相應(yīng)對照物，以磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)作空白對照。兩分鐘后，再取出200μl樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔5h測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。結(jié)果見表2、圖2。表2 rhHSS對還原型谷胱甘肽的影響(n＝6，x±s)A412Group0h 5h10h15h20hPBS 75.6±9.7 71.8±9.6 65.7±6.8 63.5±7.3 62.4±6.9rhHSS 74.8±8.9 73.8±6.7 66.7±5.9 62.9±9.6 61.3±5.3*FAD 73.9±7.6 74.0±8.5 66.3±5.2 61.7±8.4 60.5±4.6*rhHSS-FAD 74.2±9.4 61.7±6.4 56.3±4.8 52.9±5.1 44.2±4.9***P＞0.05，**P＜0.01 vs PBS
權(quán)利要求
1.一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法，其特征在于步驟為arhHSS與過量黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleofide，F(xiàn)AD)混合，至二者充分結(jié)合，除去剩余的FAD；b將含有游離巰基的底物溶于緩沖液中，然后調(diào)節(jié)pH值至酸性；c.上述底物與rhHSS溶于緩沖液中，迅速取出部分樣品，加入緩沖液與5，5，-二硫基雙-2-硝基苯甲酸(dithio-bis-(nitrobenzoic acid，DTNB)定空白；取出部分樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔固定時間測定一次；作出時間/巰基含量圖，計算巰基的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法，其特征在于除去剩余的FAD采用透析或者凝膠層析；
3.如權(quán)利要求2所述的一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法，其特征在于步驟為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，凝膠層析除去剩余的FAD；b還原型溶菌酶的制備溶菌酶溶于Tris緩沖液中，緩沖液包含鹽酸胍和EDTA，加入DTT(dithiotheitol)。過夜。然后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值，以含醋酸、EDTA和尿素的脫氧緩沖液平衡、洗脫，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱除去DTT。crhHSS氧化巰基活性的測定上述還原型溶菌酶與a步驟所得的rhHSS溶于含有尿素和EDTA的磷酸緩沖液中，迅速取出部份樣品，加入含尿素和EDTA的磷酸緩沖液與DTNB定空白。兩分鐘后，再取出部分樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔60分鐘測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
4.如權(quán)利要求3所述的一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法，其特征在于步驟為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，以SephadexG-25凝膠柱除去剩余的FAD；b還原型溶菌酶的制備20mg溶菌酶溶于1ml 100mM Tris緩沖液(含6M鹽酸胍+0.3mM EDTA)中，加入DTT至終濃度為6mM。在pH8.0，37℃下過夜。然后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.5，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱除去DTT，平衡、洗脫脫氧緩沖液為含0.1％醋酸(v/v)和0.3mM EDTA的8M尿素。crhHSS氧化巰基活性的測定75nmol上述還原型溶菌酶與從a步驟所得的200pmol rhHSS溶于1.2ml pH7.5的磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)中，迅速取出200μl，加入790μl磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)與10μl 1mmol/L DTNB于412nm處定空白。兩分鐘后，再取出200μl樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔30分鐘測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
5.如權(quán)利要求1所述的一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法，其特征在于步驟為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，凝膠層析除去剩余的FAD；brhHSS氧化巰基活性的測定還原型谷胱甘肽與a步驟所得的rhHSS溶于含有尿素和EDTA的磷酸緩沖液中，迅速取出部份樣品，加入含尿素和EDTA的磷酸緩沖液與DTNB定空白。兩分鐘后，再取出部分樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔5h測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
6.如權(quán)利要求5所述的一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法，其特征在于步驟為arhHSS與FAD以至少1∶1的摩爾比混合，37℃過夜，以SephadexG-25凝膠柱除去剩余的FAD；brhHSS氧化巰基活性的測定100nmol還原型谷胱甘肽與從a步驟所得的200pmol rhHSS溶于1.2ml pH7.5的磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)中，迅速取出200μl，加入790μl磷酸緩沖液(含2M尿素+1mM EDTA)與10μl 1mmol/L DTNB于412nm處定空白。兩分鐘后，再取出200μl樣品，按以上步驟測定A412，以后每隔5h測定一次。作出時間/巰基含量圖，樣品中巰基的含量計算公式為A412/13.6mmol。
全文摘要
一種巰基氧化酶法檢測重組人肝細胞生長素生物活性方法，所采用的技術(shù)方案是以巰基氧化酶活性檢測rhHSS產(chǎn)品的生物學(xué)活性，包括含游離巰基的底物或其制備，rhHSS氧化巰基活性的測定。本發(fā)明提供了一種簡便易行、特異敏感的rhHSS活性檢測方法。
文檔編號C12Q1/26GK1472334SQ0213467
公開日2004年2月4日 申請日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者李茹冰, 萬華印, 易學(xué)瑞, 孔祥平, 佟明華, 楊聯(lián)萍, 柴向東, 王妍 申請人:深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司, 深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公