專利名稱：用酵母分泌表達瑞替普酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領域中的重組蛋白質藥物的制備工藝。
瑞替普酶(reteplase，簡稱r-PA)是組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)的39KD重組異構體，是t-PA的一種分子改造衍生物。它包含有野生型t-PA的Kringle 2結構域和蛋白酶結構域，而刪除了t-PA的其它結構域。r-PA具有t-PA的溶血栓活性，但半衰期延長，并且出血副作用小，比t-PA具有使用方便、安全、經濟的優(yōu)勢，是取代t-PA的理想溶血栓藥物。
由于瑞替普酶分子包含9對二硫鍵，若用大腸桿菌進行表達必需經過變性和復性步驟，復性率很低，純化困難，成本居高不下，其產量和應用受到限制。為了提高瑞替普酶的表達產率，我們用甲醇營養(yǎng)型的畢赤酵母來分泌表達瑞替普酶。
本發(fā)明的原理畢赤酵母可以高效地表達酵母表達質粒上的外源基因并將表達的外源蛋白分泌至細胞壁外的培養(yǎng)基中。這樣的表達產物具天然蛋白結構和生物學活性。
本發(fā)明的目的使用畢赤酵母高效表達瑞替普酶并使表達產物分泌至培養(yǎng)基中，以產生結構正確、活性高的瑞替普酶產品，提高產率，降低生產成本。
技術方案當然，亦可依不同方法來制備瑞替普酶，如可在細菌或昆蟲細胞及動物細胞等較高等真核細胞中表達。但最好是在酵母系統(tǒng)中表達，例如使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorphis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，或最好是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)由酵母細胞中表達的優(yōu)點不僅因為可以分泌瑞替普酶，而且還因為它在實際上是呈準確折迭形式的并具有高度活性的。
該體系以醇氧化酶(AOX1)為啟動子，通過同源雙交換使外源基因穩(wěn)定地整合于酵母染色體，有效的避免了外源基因丟失。畢赤巴斯德酵母不但能使表達產物糖基化，避免釀酒酵母的超糖基化作用，更重要的是它可將表達產物分泌于胞外，而且自身蛋白的分泌卻很少，非常有利于下游的純化設備。綜上所述，酵母培養(yǎng)體系經濟、簡便，高密度發(fā)酵可得100克/L干重酵母，比較適合于大規(guī)模工業(yè)化生產。目前，尚未見有瑞替普酶分子在酵母表達體系分泌表達的報道。
優(yōu)選采用的酵母載體是所謂的穿梭載體，其具有的細菌質粒和酵母質粒的復制原點，以及在兩種宿主系統(tǒng)中分泌的基因。此外，該類型載體還含有表達外來基因所必需的啟動子順序，以及最好有可改善產率的終止順序，從而即可使利于同分泌信號融合的異源基因定位于啟動子和終止密碼子之間。
具體工藝簡述如下瑞替普酶基因的PCR擴增→表達質粒構建→轉化畢赤酵母→高密度發(fā)酵表達→上清液分離→超濾濃縮→陽離子交換層析純化→脫鹽→除菌過濾→制劑分裝→成品凍干。經上述步驟，即可制備得到純度大于99％，生物比活性高于500,000IU/mg蛋白的瑞替普酶。
實施例1首先用PCR擴增的方法獲得瑞替普酶的全長基因。經DNA序列測定證實其序列正確后，插入我們已改建過的酵母表達質粒pPIC9K-Y。所構建成的表達質粒經DNA序列測定分析正確后，用SalI酶切成線性質粒，用電穿孔的方法轉化入畢赤酵母，經過篩選即得到瑞替普酶的高表達酵母工程菌。該工程菌在酵母培養(yǎng)基中生長、誘導、分泌，再將發(fā)酵液離心后，取上清液，超濾至十分之一體積，經脫鹽后，過CM-Sepharose陽離子交換層析柱純化，即得到純度＞99％，比活性高于500,000IU/mg的瑞替普酶純品。
實施例2表達用得自實施例1基本培養(yǎng)之新鮮過夜培養(yǎng)物的細胞接種10ml酵母完全培養(yǎng)基，以這種方式達到最適密度OD600＝0.1。于28℃振蕩培養(yǎng)8小時，然后加入90ml新鮮培養(yǎng)基。再振蕩培養(yǎng)20小時。離心分離細胞后，檢測上清液中的瑞替普酶活性。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明提供了一種用酵母分泌表達具天然蛋白結構和生物活性的瑞替普酶的新型工藝方法。它與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達體系相比具有以下優(yōu)點①表達產率高②產物具天然結構和生物活性，無需變性和復性③培養(yǎng)基簡單、價廉④熱源性物質減少。因此，生產成本大幅度降低。上述優(yōu)勢使本發(fā)明具有明顯的技術創(chuàng)新性與工藝先進性，產率提高，成本降低，更適合于工業(yè)化生產瑞替普酶。
權利要求
1.用酵母分泌表達瑞替普酶。其特征在于表達用宿主細胞為畢赤酵母。
2.如權利要求1所述的瑞替普酶表達工程酵母的構建。其特征在于瑞替普酶基因插入酵母表達載體如pPIC，將此表達質粒轉化畢赤酵母，即構建成瑞替普酶表達工程酵母。
3.如權利要求1所述的瑞替普酶的分泌表達。其特征在于瑞替普酶在酵母中表達后可以有效地分泌至培養(yǎng)基中。
4.瑞替普酶的分離和純化。其特征在于經過培養(yǎng)液分離、超濾濃縮、陽離子交換層析等步驟，獲得高純度、高比活的瑞替普酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用畢赤酵母分泌表達瑞替普酶的新型工藝方法。將瑞替普酶基因插入酵母表達質粒中，轉化畢赤酵母后經篩選得到高表達酵母工程菌，再經過表達和一系列純化步驟，可以制備得到高純度、高比活性的瑞替普酶。
文檔編號C12N9/00GK1414094SQ0213579
公開日2003年4月30日 申請日期2002年11月14日 優(yōu)先權日2002年11月14日
發(fā)明者苗祖英 申請人:苗祖英