專利名稱：超氧化物歧化酶生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種超氧化物歧化酶生產(chǎn)方法，目前，我國超氧化物歧化酶(SOD)超氧陰離子自由基的清除劑，可用于過量超氧陰離子自由基引起的疾病或機(jī)體損佃的防治，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、放射性損傷、血液再灌流損傷等。但原有的一些老的方法生產(chǎn)的該產(chǎn)品外觀和活性都不是非常理想。例如有使用硫酸銨鹽析法去除雜蛋白，再用磷酸鹽緩沖液透析方法脫鹽，這不僅給產(chǎn)品中帶入了雜離子，還使得獲得產(chǎn)品的步驟增加，生產(chǎn)周期延長?，F(xiàn)在克服超氧化物歧化酶外觀不好及活性低等缺點(diǎn)的方法主要是用凝膠過濾，但該方法的費(fèi)用非常高，產(chǎn)品的收率低，生產(chǎn)周期過長，影響大規(guī)模生產(chǎn)，限制了超氧化物歧化酶在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的就是要提供一種方法簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品收率高，應(yīng)用范圍廣，外觀好，活性高的超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種超氧化物歧化酶生產(chǎn)方法，其特征在于它包括以下步驟1、溶血、去血紅蛋白，去酸性蛋白將分離、洗滌干凈的紅細(xì)胞置于反應(yīng)罐中，加入去離子水?dāng)嚢琛㈧o置，攪拌時(shí)間≥3小時(shí)，靜置時(shí)間≥2小時(shí)，再加入乙醇，氯仿攪拌、靜置，攪拌時(shí)間≥4小時(shí)，靜置時(shí)間≥2小時(shí)，后用HCl調(diào)溶液pH為5.8-6.0后分離，得到去血紅蛋白，去酸性蛋白的上清液；2、熱變性、超濾將上述上清液加入丙酮得到顆狀沉淀物，再加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，然后加入硫酸鹽，用HCl溶液調(diào)pH為5.8-6.0，攪拌加熱變性，加熱溫度≤70°，保溫≥10分鐘，再分離去雜蛋白，最后將溶液用超濾機(jī)超濾，得到超氧化物歧化酶濃縮液。
本發(fā)明還可以在第二步后加入干燥工藝，即將得到的超氧化物歧化酶濃縮液除菌過濾，冷凍干燥得到凍干粉的超氧化物歧化酶，硫酸鹽最佳為硫酸銅，用于保護(hù)酶的活性中心，超濾機(jī)采用截留值為一萬的聚砜中空纖維超濾機(jī)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、工藝過程簡單，僅用二次調(diào)pH就能達(dá)到理想的結(jié)果；生產(chǎn)周期短，節(jié)約開支。制得的超氧化物歧化酶產(chǎn)品與其他方法制得的超氧化物歧化酶相比具有外觀好、收率高、活性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，不易失活等特性。用作化妝品添加劑，穩(wěn)定性明顯增加，從而能在化妝品中較長時(shí)間的保持較高的活性。2、本發(fā)明制得的超氧化物歧化酶產(chǎn)品，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證加到鮮牛奶中也能夠保持較高的活性。3、本發(fā)明生產(chǎn)的超氧化物歧化酶產(chǎn)品，因雜質(zhì)少、純度高、活性強(qiáng)與其他生化藥物修飾在一起，其在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期明顯延長，動(dòng)物試驗(yàn)用于治療腦血管方面的疾病已取得了非常滿意的結(jié)果。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明實(shí)施例1取新鮮動(dòng)物血，按血量1∶0.038的比例加入枸櫞酸三納，靜置2小時(shí)。分離、洗滌干凈紅細(xì)胞，采用4000rpm/min離心機(jī)離心30min，再加入等體積的0.9％的生理鹽水洗滌二次，用4000rpm/min離心機(jī)離心30min，得到干凈的紅細(xì)胞，將干凈的紅細(xì)胞置于反應(yīng)罐中，加入溶液等體積的去離子水，攪拌溶液3小時(shí)，靜置2小時(shí)，得到的溶液再按與溶液體積比的0.25倍的醫(yī)用工業(yè)乙醇和0.15倍的氯仿進(jìn)行攪拌、靜置，攪拌時(shí)間為4小時(shí)，靜置2小時(shí)，再加入2NHCl將溶液調(diào)至pH為5.8，利用4000rpm/min離心機(jī)離心，得到澄清透明的淡黃色液體，然后加入與溶液體積比為1.5倍的丙酮，靜置過液得到超氧化物歧化酶的白色顆粒狀沉淀物，然后將沉淀物加入2倍量的蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓偌尤?.1％的硫酸銅溶液5ml，用以保護(hù)酶的活性中心，再加入2NHCl使溶液的pH為6.0，再投入70℃的熱變鍋內(nèi)加熱變性，保溫10分鐘，再用3000rpm/min離心機(jī)離心去除雜蛋白，最后將溶液放入分子量截留值為一萬的聚砜中空纖維膜超濾機(jī)中超濾，從而得到濃縮的超氧化物歧化酶，真空干燥得產(chǎn)品。
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同在于所得到的濃縮超氧化物歧化酶進(jìn)行冷凍干燥，先除菌過濾，然后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到冷凍干燥的超氧化物歧化酶。
實(shí)施例3與實(shí)施例1相同的是分離、洗滌干凈的紅細(xì)胞，其不同之處在于將干凈的紅細(xì)胞置于反應(yīng)罐中加入與溶液不等體積的去離子水，攪拌溶血4小時(shí)，靜置3小時(shí)，得到的溶液再按溶液體積比分別加入0.35倍的醫(yī)用工業(yè)乙醇和0.2倍的氯仿進(jìn)行攪拌、靜置。攪拌、靜置時(shí)間同實(shí)施例1，再用2NHCl，將溶液調(diào)至pH為6.0，利用40000rpm/min離心機(jī)離心得到淡黃色液體，然后加入與溶液體積比為1倍的丙酮，靜置得到超氧化物歧化酶的沉淀物。加入等量的蒸留水?dāng)嚢枞芙?，再加?.1％的硫酸銅溶液5ml，加入2NHCl，使溶液的pH為6.0，再投入60℃的熱變鍋內(nèi)加熱變性，保溫12分鐘，再用3000rpm/min離心機(jī)離心，去除雜蛋白，用超濾機(jī)超濾得到濃縮液，濃縮液再除菌過濾進(jìn)行冷凍干燥即可得到凍干粉狀的超氧化物歧化酶。
權(quán)利要求
1.一種超氧化歧化酶生產(chǎn)方法，其特征在于它包括以下步驟(1)溶血、去血紅蛋白、去酸性蛋白，洗滌干凈的紅細(xì)胞置于反應(yīng)罐中，加入去離子水?dāng)嚢?、靜置，攪拌時(shí)間≥3小時(shí)，靜置時(shí)間≥2小時(shí)，再加入乙醇、氯仿攪拌、靜置，攪拌時(shí)間≥4小時(shí)，靜置≥2小時(shí)，后用HCl調(diào)溶液pH為5.8-6.0，然后分離，得到去血紅蛋白、去酸性蛋白的上清液。(2)熱變性、超濾將上清液加入丙酮得到顆粒狀沉淀物，再加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，然后加入硫酸鹽，用HCl溶液pH為5.8-6.0，攪拌加熱變性，加熱溫度≤70℃，保溫≥10分鐘，再分離去雜蛋白，最后用超濾機(jī)超濾，得到超氧化物歧化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求(1)所述的超氧化物歧化酶生產(chǎn)方法，其特征在于所述的第二步后加入干燥工藝，即將濃縮液除菌過濾，冷凍干燥的凍干超氧化物歧化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求(1)或(2)所述的超氧化物歧化酶生產(chǎn)方法，其特征在于所述的硫酸鹽最佳為硫酸銅。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的超氧化物歧化酶生產(chǎn)方法，其特征在于所述的超濾機(jī)采用截留值為一萬的聚砜中空纖維超濾機(jī)。
全文摘要
一種超氧化物歧化酶，它是由將分離、洗滌干凈的紅細(xì)胞，加入去離子水?dāng)嚢琛㈧o置，再加入乙醇，氯仿攪拌、靜置，用鹽酸調(diào)pH為5.8－6.0的上清液，然后用丙酮沉淀，加入含硫酸鹽的蒸餾水，再利用2NHCl調(diào)溶液pH為5.8－6.0，然后加熱變性，分離、過濾所得到超氧化物歧化酶，該生產(chǎn)方法簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品外觀好，活性高，使用范圍廣，特別適合于生物醫(yī)藥、化妝品添加劑及食品加工領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/02GK1506458SQ0213597
公開日2004年6月23日 申請日期2002年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月10日
發(fā)明者曹吉超, 崔程劍, 王鳳山, 姚凱軍 申請人:煙臺養(yǎng)合生物工程有限公司