專利名稱：基于體內(nèi)同源重組的構(gòu)建遺傳工程生物體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建遺傳工程生物體的方法以及獲得的遺傳工程生物體的用途。
釀酒酵母一直都被認為是研究同源重組的模式生物，研究表明，在釀酒酵母中，線性化的DNA片段可以有效的提高重組的發(fā)生頻率(Martin KDamagc-induccd recombination inthe yeast Saccharomyces cerevisiae.Mutation Research 451 2000 91-105)，這一特性使利用同源重組進行基因工程操作的技術(shù)在釀酒酵母中得到了廣泛的應用。目前主要的應用包括(1)將特定的DNA片段重組整合到染色體上(Kaiser，C.et al.Methods in Yeast Genetics.ColdSpring Harbor Laboratory Press，1994 Cold Spring Harbor，NY.)；(2)基因中斷、基因置換，即利用DNA重組將載體中的片段插入染色體中，造成基因功能缺失或由目的基因片段完全替代染色體上的基因；(3)構(gòu)建表達載體。目的基因片段兩端含有與質(zhì)粒序列上同源的部分，就可以在酵母體內(nèi)通過重組與線性化的質(zhì)?！斑B接”而獲得所需的表達載體(Kevin R.Oldenburg，Kham T.Vo，Susan Michaelis and Chris PaddonRecombination-mediatedPCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.Nucl Acids Res 25(2)1997 451-452)。這種方法不依賴于是否存在合適的限制性內(nèi)切酶位點。在一些酵母的基因中斷實驗中證實30-50bp的同源區(qū)段就可以進行有效的體內(nèi)重組(A，Lacroute F，Cullin C.A simple andefficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae.Nucleic Acids Res21(14)1993 Jul 11 3329-30)，也就是說完全可以將同源區(qū)段作為PCR引物的一部分來合成。另有一些系統(tǒng)性的實驗表明在同源整合實驗中同源區(qū)段的大小只需15bp就可以得到重組克隆了(Manivasakam P，Weber SC，McElver J，Schiestl RH.Micro-homology mediated PCRtargeting in Saccharomyces cerevisiae.Nucleic Acids Res 23(14)1995 Jul 252799-2800)。
但是，建成的表達載體都比較大，在細胞中的穩(wěn)定性迄待提高。
本發(fā)明的目的還在于提供利用這種方法獲得的遺傳工程生物體，尤其是表達具有商業(yè)價值的基因工程產(chǎn)品的酵母基因工程菌株。
本發(fā)明提出的基于體內(nèi)同源重組的構(gòu)建遺傳工程生體的方法，是將所需要的、兩端帶有載體片段同源序列的線性化外源基因表達單元與線性化的特定表達載體共轉(zhuǎn)化特定生物體，外源基因表達單元與特定表達載體進行遺傳重組，載體的非必要序列被外源基因表達單元替換，所得到的帶有外源基因表達單元的遺傳工程生物體中，外源基因表達單元能夠穩(wěn)定存在和高效率表達外源基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的具體步驟如下1、載體的線形化載體利用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進行酶切，然后收集適當大小的片段，此即為線形化的載體；2、獲得兩端帶有和線性化的載體片段同源的序列的表達單元；3、將線形化的載體與步驟2所述的表達單元分別共轉(zhuǎn)化適當?shù)纳矬w；4、鑒定轉(zhuǎn)化子。取少量轉(zhuǎn)化子對它們進行表達單元存在情況、表達水平的測定和轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析。
本發(fā)明中，所述的遺傳工程生物體包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌和真菌。
本發(fā)明中，所述的外源基因包括編碼干擾素、乙型肝炎病毒表面抗原、促紅細胞生成素、人血清白蛋白、人超氧化物歧化酶、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體I和II、白細胞介素-1，白細胞介素-2及其受體等的基因。
本發(fā)明中，所述的載體是含有以完整2μ質(zhì)粒為基礎(chǔ)。
本發(fā)明中，所述的載體同源序列，其同源區(qū)段堿基數(shù)目15-60bp。
本發(fā)明中，所述的真菌為酵母，包括釀酒酵母、克魯維酵母、假絲酵母、紅酵母、粟酒裂殖酵母等。
本發(fā)明中，所述的細菌是枯草桿菌或大腸桿菌。
上述酵母中，特別是含有表達乙型肝炎病毒SA-28融合抗原的酵母基因工程菌DCO4/pHC11R-SA-28或表達乙型肝炎病毒表面抗原和其他融合抗原的酵母基因工程菌。
上述酵母中，特別是含有表達人α2a或α2b干擾素的酵母基因工程菌DCO4/pHC11R-IFNα2a，或DCO4/pHC11R-IFNα2b，或表達其他人干擾素的酵母基因工程菌。
上述酵母中，特別是用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴氏畢氏酵母(Pichiapastoris)。
采用上述方法獲得了外源基因表達單元穩(wěn)定性明顯提高的遺傳工程生物體的，外源基因的表達水平也較其他方法顯著提高。
圖2pHC11R-SA-28轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定。其中，1-10PCR模板為轉(zhuǎn)化子DCO4/pHC11R-SA-28總DNA，pHC11SA-28PCR模板為轉(zhuǎn)化子DCO4/pHC11SA-28總DNA，pHC11RPCR模板為載體片段pHC11R自連DNA，pHC11SA-28質(zhì)粒對照PCR模板為pHC11SA-28質(zhì)粒DNA，markerλ-HindII marker。
圖3pHC11R-IFNα2a轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定。其中，1-6PCR模板為轉(zhuǎn)化子DCO4/pHC11R-IFNα2a轉(zhuǎn)化子，pHC11-IFNα2aPCR模板為轉(zhuǎn)化子DCO4/pHC11-IFNα2a的總DNA，pHC11-IFNα2a質(zhì)粒對照PCR模板為pHC11-IFNα2a質(zhì)粒DNA，markerλ-HindIII marker。
圖4pHC11R-SA-28轉(zhuǎn)化子表達水平的ELISA測定結(jié)果。其中，Y軸為ELISA測定中的吸光度值，與乙肝表面抗原活性成正比。陰性為空白樣品測定，對照為pHC11 SA-28轉(zhuǎn)化的高表達工程菌的表達產(chǎn)物活性測定，1～10為pHC11R-SA-28的10個不同轉(zhuǎn)化子的表達產(chǎn)物活性測定。
圖5重組轉(zhuǎn)化子表達干擾素α2a蛋白電泳結(jié)果。其中，1～66個不同的pHC11R-IFNα2a轉(zhuǎn)化子表達產(chǎn)物，對照pHC11-IFNα2a轉(zhuǎn)化子表達產(chǎn)物對照，M分子量Marker。
圖6轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒穩(wěn)定性。
構(gòu)建的步驟如

圖1(A)及圖1(B)所示1.載體pHC11R的線形化載體pHC11R經(jīng)SalI和BglI同時酶切，然后收集8.7Kbp的大片段，此即為線形化的載體pHC11R。
2.PCR擴增乙型肝炎病毒融合抗原SA-28或人α2a干擾素的表達單元DNA，獲得的產(chǎn)物兩端帶有和線性化的載體片段同源的50bp序列。
3.將線形化的載體pHC11R和PCR擴增的乙型肝炎病毒融合抗原SA-28表達單元或人αA干擾素表達單元分別共轉(zhuǎn)化釀酒酵母DCO4 cir0leu2 ade1。
4.取少量轉(zhuǎn)化子對它們進行表達單元存在情況、乙型肝炎病毒融合抗原SA-28或人α2a干擾素表達水平的測定和轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析。對轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果如下10個SA-28轉(zhuǎn)化子中只有4號未擴增出表達單元片段(圖2)，也不能表達SA-28(圖4)，可能是線形化pHC11的自連；其余九個轉(zhuǎn)化子都能擴增出表達單元片段(圖3)，SA-28的表達水平有差別，其中1號和7號表達水平最高，想當于原工程菌的3倍多(圖4)，質(zhì)粒在酵母細胞中的穩(wěn)定性也明顯高于原工程菌(圖6)。
6個人α2a干擾素轉(zhuǎn)化子全部都能擴增出表達單元片段(圖3)，從電泳膠上可以看出6個轉(zhuǎn)化子都有人α2a干擾素的表達，表達量都明顯高于原工程菌(圖5)。5號轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒穩(wěn)定性也略高于原工程菌(圖6)。
進一步的操作過程如下1、質(zhì)粒DNA的提取。用試劑盒快速制備少量質(zhì)粒DNA(博彩公司試劑盒)。
將過夜培養(yǎng)的3ml細菌，高速離心1min，徹底去除上清。
加入100μl Solution I，用振蕩器充分懸浮細胞。加入200μl Solution II，立即上下顛倒或用手指彈管底，使細菌裂解，室溫放置2mins，使溶液變成澄清。加入400μl SolutionIII，立即上下顛倒5-10次，使之充分中和，室溫放置2mins。
取出2ml樣品收集管和3S柱，在管壁上標上樣品號，將前一步的上清全部轉(zhuǎn)移到3S柱里。室溫放置2mins，室溫離心12,000rpm，1min。
取下3S柱，棄去收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，吸取700μl Wash Solution到3S柱，高速離心1min，并重復該步驟一次。取下3S柱，棄去收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，高速離心5mins。
將3S柱放入干凈的1.5ml離心管中，在3S柱膜中央加50μl TE，室溫離心5mins。
2、DNA的酶切和載體片段的回收將制備好的pHC11R質(zhì)粒DNA，用BglI和SalI酶切。
在瓊脂糖凝膠電泳分離片段，割下含有8.7Kbp的大片段DNA的瓊脂糖塊，放入1.5ml離心管，按每100mg瓊脂糖加入300～600μl S1液，置55℃水浴10mins，待瓊脂糖塊完全融化后，加入1/10 S1體積的異丙醇，混勻，55℃溫浴1min。
將融化后的Agarose液移入吸附柱，高速離心1min，倒掉收集管中液體，再將吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入450μl W1液，靜置1min后，離心15secs，倒掉收集管中液體，再將吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入450μl W1液，離心15secs，倒掉收集管中液體，再將吸附柱放入同一收集管中。
離心3mins，將吸附柱放入一個干凈的1.5ml Eppendorf管，在吸附膜中央加入30μlT1液，靜置1min，高速離心1min，-20℃貯存。
(本實驗步驟由上海華舜生物工程有限公司提供)3、PCR反應PCR引物的設計每條引物包括2個部分大約50bp左右的同源區(qū)段，分別和線性化載體片段的5’段和3’段同源；另一部分是PCR反應所需與模板配對部分，大約25bp左右，在5’引物序列中為釀酒酵母的ADH2-GAPDH融合啟動子(誘導型啟動子)或PGK1啟動子(組成型啟動子)的5’端序列、在3’引物中為ADH1終止子的3’序列。合成的PCR引物的序列如下5’PCR引物①76nts下劃線部分為載體片段BglI端同源的部分(50nts)，斜體部分為PADH 2-GAPDH 5’端序列(26nts)TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCGGATCCTTCAATATGCGCACATACGC②68nts下劃線部分為載體片段BglI端同源的部分(44nts)，斜體部分為或PPGK1 5’端序列(24nts)CGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCGGATCCACAGGACGGGTGTGGTCG3’PCR引物76nts下劃線部分為載體片段SalI端同源的部分(50nts)，
斜體部分為TADH1 3’端序列(26nts)AAAGTTCCCTCAAGAATTTTACTCTGTCAGAAACGGCCTTAACGACGTAGCCGTGTGGAAGAACGATTACAACAGG反應體系模板DNA50～100ng15pM 5’引物1.0μl15pM 3’引物1.0μl10mM dNTP0.5μl10×ExTaq buffer5μl5U/μl ExTaq1.0μl補水至總體積為50μl反應程序95℃ 5mins 1 cycle94℃ 30secs58℃ 30secs30 cycles72℃ 2mins72℃ 10mins1 cycle4、釀酒酵母轉(zhuǎn)化 醋酸鋰LiAc化學轉(zhuǎn)化法從平板上挑取1個單菌落的受體菌(DCO4 cir0leu2 ade1)，接種于3ml YEPD，30℃搖床培養(yǎng)16～24hr。
轉(zhuǎn)接過夜菌于50ml YEPD中，使得起始濃度為OD600＝0.1，30℃培養(yǎng)4～5hr至OD600＝0.4。離心，5,000rpm，5mins，收集菌體，并用無菌水洗滌兩次。
用10ml無菌水重懸，每1ml分裝，30secs離心，收集菌體。每管加入900μl無菌水、100μl 1M LiAc重懸，30℃，10mins。
將菌體快速離心30secs，收集菌體，小心移去LiAc。
每管加入50％PEG 240μl、1M LiAc 36μl、5mg/ml ssDNA 10μl、載體片段DNA和PCR片段(載體片段與PCR片段摩爾比為1∶6、載體片段用量為1μg)，補水至總體積為360μl。徹底混勻。。
30℃靜置30mins。42℃水浴20mins。8,000rpm，離心1min，棄上清。
加200μl無菌水打勻。往每塊選擇性培養(yǎng)基SDA平板上加100μl菌液，用無菌涂布棒涂布均勻。30℃培養(yǎng)3天。
(轉(zhuǎn)化效率可達0.5-1×103/ug載體片段。)5、工程菌發(fā)酵方法將工程菌接種到新制備的SDA平板，培養(yǎng)24-36hrs，等量接種到3mlSDA，30℃振蕩培養(yǎng)18hrs。
將1ml種子液轉(zhuǎn)入到25mlYEPE/250ml(誘導型啟動子，pHC11R-SA-28)三角瓶中，或25mlYEPD/250ml(組成型啟動子，pHC11R-IFNαA)三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)48hrs。
*(SDA0.67％YNB 2％Glucose 40ug/ml Adene)6、簡易酵母細胞抽提液制備取20 OD發(fā)酵菌體于Eppendorf管，5,000rpm離心5mins，棄上清。
菌體加入500ul玻璃珠、500ul破碎緩沖液*。
置于冰浴中，vortex振蕩1min，冰浴1min，10次。
12,000rpm離心15mins，吸取上清，置于-20℃保存。
*(破碎緩沖液(PBS)pH＝7.8NaH2PO40.09g Na2HPO40.95g定容至150ml)7、SA-28的ELISA測定準備將微孔順序編號。并將各樣品按比例稀釋稀釋10倍、100倍、1000倍。
加樣及酶標加待測樣品或陰、陽對照50μl于相應孔。每孔加酶標結(jié)合物50μl，混勻。設空白對照孔(不加酶標結(jié)合物)。
孵育置37℃恒溫反應60mins。
洗板甩去板中樣品，拍干并加滿清洗液(將試劑盒內(nèi)T-PBS干粉溶于雙蒸水并訂容500ml)。15～20secs后甩去清洗液，重復5次。
顯色每孔加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，37℃避光顯色15mins。
終止每孔加終止液50μl，混勻。
比色選波長450nm或雙波長450/630nm，空白孔校零。用酶標儀對每孔進行比色，并記錄其OD值。陰性對照OD值低于0.05時按0.05計算，高于0.05時按實際OD計算。樣品孔OD值≥陰性對照平均OD值×2.1時，該孔樣品HbsAg為陽性；反之，為陰性。
8、人α2a干擾素的凝膠電泳分析將玻璃板洗滌干凈，擦干凈，固定于電泳槽上；配制濃度為15％的分離膠，將分離膠注入玻璃夾層中，上部用70％乙醇封面，保持膠面平整；待分離膠聚合后，配制15％濃縮膠，倒去分離膠表面的乙醇，灌入濃縮膠，插入點樣梳。
取50μl蛋白上清樣品，加入10μl 6×SDS-PAGE樣品處理液，100℃水浴3-5mins。
在電泳槽加入電泳緩沖液后，小心拔取上樣梳，用微量加樣器分別吸取待分析樣品，注入加樣孔。
加樣完畢后，接通電源，起始用低電壓(30-50V)或低電流，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，再加大電壓或電流(60-90V)，待溴酚藍指示劑到達底部邊緣時即可停止電泳。
電泳結(jié)束后，輕輕橇開兩層玻璃，取出凝膠(戴手套，防止污染膠面)，將凝膠放于染色液中，振蕩染色0.5-2hrs，用脫色液洗至背景干凈，條帶清晰。
照相保存或凝膠干燥。
30％(W/V)acr-bis母液、3mol/L Tris-HCl pH＝8.8、0.5mol/L Tris-HCl pH＝6.7、10％SDS、TEMED、10％過硫酸銨、Tris-Gly電泳緩沖液(Gly 1.44％Tris 0.6％SDS 0.1％)pH＝8.3、0.05％(W/V)考馬斯藍染色液、脫色液9、轉(zhuǎn)化子中表達單元片段的PCR擴增按種各轉(zhuǎn)化子菌株于3ml SDA培養(yǎng)液中30℃振蕩培養(yǎng)16hrs，收集過夜菌。
用200μl酵母裂解液懸浮菌體，加入200μl玻璃珠，vortex劇烈振蕩2mins，加入100μl飽和酚、100μl氯仿/異戊醇，vortex劇烈振蕩2mins，共3次。
10,000rpm離心10mins，收集上清。加入等體積的氯仿/異戊醇抽提。
上清中加入1/10體積的3M NaAc、2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀2～3hrs。
70％乙醇洗一次，烘干后加入20μl無菌水溶解。-20℃保存。
取上述酵母DNA抽提物10μl為PCR模板，進行PCR鑒定。方法同前所述。
10、轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒穩(wěn)定性的測定接種轉(zhuǎn)化子菌株DCO4/pHC11R-SA-28和對照菌株DCO4/pHC11-SA-28，或DCO4/pHC11R-IFNα2a和對照菌株DCO4/pHC11R-IFNα2a到3mlSDA培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)16hrs。
等量各接種100ul到25mlYEPD培養(yǎng)液，30℃振蕩培養(yǎng)24hrs*。
分別測定兩組菌液的OD600值，將兩組菌液稀釋8,000倍，單倍體菌取100ul涂布YEPD平板。
將兩組平板30℃靜置2天，可見YEPD平板上明顯菌落形成，每皿約300個左右。
兩組菌分別用已滅菌牙簽作單菌落點種SDA平板，計數(shù)100個，30℃靜置培養(yǎng)36hrs，觀察平板上兩組菌生長情況，記錄菌落百分比。將*步驟的菌液各取100ul接種于另兩瓶YEPD液中，重復上述。
權(quán)利要求
1.一種通過體內(nèi)同源重組構(gòu)建遺傳工程生物體的方法，其特征是將所需要的、兩端帶有載體片段同源序列的線性化外源基因表達單元與線性化的特定表達載體共轉(zhuǎn)化特定生物體，外源基因表達單元與特定表達載體進行遺傳重組，載體的非必要序列被外源基因表達單元替換，所得到的帶有外源基因表達單元的遺傳工程生物體中，外源基因表達單元能夠穩(wěn)定存在和高效率表達外源基因產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的生物體包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、細菌和真菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的外源基因包括編碼干擾素、乙型肝炎病毒表面抗原、促紅細胞生成素、人血清白蛋白、人超氧化物歧化酶、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體I和II、白細胞介素-1，白細胞介素-2及其受體等的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的載體，是含有以完整2μ質(zhì)粒為基礎(chǔ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的載體同源序列，其同源區(qū)段堿基數(shù)目為15-60bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所說的真菌是酵母，包括釀酒酵母、克魯維酵母、假絲酵母、紅酵母、粟酒裂殖酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的遺傳工程生物體是酵母，其含有表達乙型肝炎病毒SA-28融合抗原的酵母基因工程菌DCO4/pHC11R-SA-28或表達乙型肝炎病毒表面抗原和其他融合抗原的酵母基因工程菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說的遺傳工程生物體是酵母，其含有表達人α2a或α2b干擾素的酵母基因工程菌DCO4/pHC11R-IFNα2a，或DCO4/pHC11R-IFNα2b，或表達其他人干擾素的酵母基因工程菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征是所說的酵母是釀酒酵母或巴氏畢氏酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征是具體步驟如下(1)載體的線形化載體利用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進行酶切，然后收集適當大小的片段，此即為線形化的載體；(2)獲得兩端帶有和線性化的載體片段同源的序列的表達單元；(3)將線形化的載體與步驟2所述的表達單元分別共轉(zhuǎn)化適當?shù)纳矬w；(4)鑒定轉(zhuǎn)化子。取少量轉(zhuǎn)化子對它們進行表達單元存在情況、表達水平的測定和轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將所需要的、兩端帶有載體片段同源序列的線性化外源基因表達單元與線性化的特定表達載體共轉(zhuǎn)化特定生物體，通過體內(nèi)同源重組構(gòu)建遺傳工程生物體的方法，以及用該方法獲得的遺傳工程生物體及其用途。
文檔編號C12N15/12GK1414105SQ0213630
公開日2003年4月30日 申請日期2002年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月30日
發(fā)明者李育陽, 陳向嶺, 何煒, 袁漢英, 霍克克 申請人:復旦大學