專利名稱：一種檢測(cè)布魯加達(dá)綜合癥基因突變的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬人類遺傳學(xué)和內(nèi)科心血管領(lǐng)域，主要涉及特發(fā)性室顫布魯加達(dá)(Brugada)綜合癥SCN5A基因突變的檢測(cè)方法，及其在預(yù)防、診斷及治療Brugada綜合癥方面的用途。
該疾病經(jīng)常顯現(xiàn)具有常染色體顯性遺傳的特點(diǎn)，國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)心臟鈉離子通道α亞單位(voltage-gated sodium channel type V；SCN5A)基因與該疾病有關(guān)，自1999年以來(lái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有9個(gè)該基因的突變與Brugada綜合征有關(guān)，它們分別為Frameshift、L567Q、V1398stop、R1432G、R1512W、T1620M、S1710L、Y1795C、A1924T。但目前都沒(méi)有申請(qǐng)相關(guān)的專利。
Brugada綜合征作為引起特發(fā)性室顫猝死的重要疾病之一，其死亡的方式是“健康的”突然的死亡，在預(yù)防上可能較那些有心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的患者更加被動(dòng)和消極。目前雖然有眾多研究表明其中存在著SCN5A基因上的突變，但作為帶有遺傳傾向的疾病，它存在種族間的差別，中國(guó)患者體內(nèi)的基因突變可能與已經(jīng)在歐美患者上發(fā)現(xiàn)的基因突變點(diǎn)不同，所以不揭示中國(guó)人特發(fā)性室顫的基因突變情況，而僅依賴國(guó)外的研究成果，顯然不能夠保障中國(guó)人的生命安全。
直接基因測(cè)序作為現(xiàn)在分析基因組信息學(xué)的主要技術(shù)平臺(tái)，已經(jīng)相當(dāng)成熟、便捷。所以我們采用Sanger雙脫氧鏈終止法雙向測(cè)序法對(duì)1個(gè)Brugada綜合征家系進(jìn)行基因測(cè)序，分析存在的可能突變。
本發(fā)明通過(guò)PCR及測(cè)序法獲得Brugada綜合征的一種SCN5A突變基因，再通過(guò)RT-PCR方法獲取野生型SCN5A的cDNA，利用克隆技術(shù)構(gòu)建該基因的重組體，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)獲取該基因的突變重組體，并將上述重組體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，用于Brugada綜合征的防治研究。
本發(fā)明方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)1)采用鹽析法獲取相應(yīng)的基因組核苷酸序列；2)獲取目的基因(SCN5A，編碼心肌快鈉離子通道Alpha亞單位)的27個(gè)外顯子的PCR產(chǎn)物；3)采用Sanger雙脫氧鏈終止法雙向測(cè)序法分析各自的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)Brugada綜合征患者的SCN5A基因第22個(gè)外顯子存在缺陷，是1個(gè)雜合基因移碼突變，在4087位置上插入一個(gè)C，其序列為4150 tcactgcgga cgctgcgtgc actccgtcct ctgagagcct ctgtcacgatttgagggcat gagg 4114；4)獲取健康個(gè)體心肌組織樣本；5)通過(guò)RT-PCR法獲取SCN5A基因的cDNA，引物序列為PrimerSCN5AfGGAAGCTTTGTGCCCAGAAGCAGGAHind IIIPrimerSCN5ARGAGATATCCCCCAGGCTGGTTTGTGEcoR V6)構(gòu)建野生型SCN5A基因的質(zhì)粒重組體；7)將野生型SCN5A基因的質(zhì)粒重組體(SCN5A-pcDNA3.1)，通過(guò)定點(diǎn)突變獲取突變型SCN5A-pc DNA3.1，突變位于整個(gè)重組體中的第4887個(gè)與第4889之間。
本發(fā)明構(gòu)建的SCN5A重組體，其載體為pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組體所使用的限制性內(nèi)切酶為Hind III和EcoR V。
本發(fā)明利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將該野生型SCN5A重組體和突變型SCN5A重組體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，通過(guò)G418進(jìn)行抗性篩選。
利用本發(fā)明的檢測(cè)方法可以用于人群中Brugada綜合征高?；颊叩脑缙谠\斷，而轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可以用于研究防治該綜合征的特異性藥物。
圖2為SCN5A基因4087insC突變及相應(yīng)的氨基酸變化。
圖3為SCN5A基因突變后造成的通道蛋白結(jié)構(gòu)改變模式圖。
圖4為以Hind III和EcoRV作為限制性內(nèi)切酶構(gòu)建野生型SCN5A基因重組體的構(gòu)建。
圖5為野生型SCN5A基因重組體酶切鑒定。
圖6為SCN5A重組體定位突變示意圖。
實(shí)施例11、Brugada綜合征家系和正常健康人資料的收集1個(gè)Brugada綜合征家系成員共11人，其中臨床診斷患病者3例，正常8例。另設(shè)對(duì)照組30例，均為正常南方漢族人群。臨床診斷Brugada綜合征的標(biāo)準(zhǔn)為1ECG呈右束支傳導(dǎo)阻滯，伴V1-V3導(dǎo)聯(lián)ST段下斜型抬高，變化時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，且PR及QT間期正常；2反復(fù)發(fā)生暈厥，特發(fā)性室顫發(fā)生率高；3無(wú)明顯器質(zhì)性心臟病證據(jù)。符合以上3點(diǎn)診斷為Brugada綜合癥。僅有第一點(diǎn)的診斷Brugada型心電圖。
先證者，男，37歲，以“心肺復(fù)蘇術(shù)后6天”入院?；颊哂谌朐呵?天無(wú)明顯誘因突發(fā)暈厥，意識(shí)喪失，伴大汗，面色蒼白，四肢抽搐。心電圖示心室纖顫。經(jīng)心肺復(fù)蘇10分鐘后意識(shí)恢復(fù)。入院后行心電圖示Brugada型心電圖，見(jiàn)

圖1(ECG呈右束支傳導(dǎo)阻滯，V1-V2導(dǎo)聯(lián)ST段馬鞍形抬高，PR及QT間期正常)，超聲心動(dòng)圖及冠狀動(dòng)脈造影均未見(jiàn)異常。診斷為Brugada綜合癥，于2001.7.18安裝ICD。2、相應(yīng)的基因組DNA樣本制備抽取Brugada綜合征家系成員和正常健康人的血樣標(biāo)本，采用Qiagen公司全血基因組DNA抽提試劑盒提取各自的基因組DNA，具體方法參考試劑盒說(shuō)明書。3、獲取SCN5A基因采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增SCN5A基因。根據(jù)Genbank SCN5A基因組全序列(序列號(hào)M77235)設(shè)計(jì)27個(gè)外顯子的引物。其引物為OptimumExon primer sequence length Product LengthTmExon2 AGCCTCTCTGCAAATGGTGT 20 60℃ 498bpTTGACAAGGGAGTTGCACAG 20Exon3 GCCTTTCTACACAAGGGCCTA21 60℃ 294bpTAGGACCAGCAGGGAATCAG 20Exon4 GGTAGCACTGTCCTGGCAGT 20TGGACTCAAGTCCCCCTTC 19Exon5 TCACTCCACGTAAGGAACCTG21 60℃ 約300bpATGTGGACTGCAGGGAGGAAGC 22Exon6 ATTTGTCGGCTCTTCGAACTT21 456bpAAGCATGTCCACTGCCAATAG21Exon7 CCACCTCTGGTTGCCTACAC 20 60℃ 約400bp
CTGCGGTCTCACAAAGTCTTC 21Exon8 TGGGGTCAGGGCATAAATAG20 62℃ 300bpGAGTGCCCCTCACCAGCAT 19Exon9-10 GTGGCACTAGGTTTGTGAAGC 21 60℃ 1271bpTCCTCACTAACAGGCACGTCT 21Exon11-12 GGCTGCACAAAGTCTCAATG20 60℃ 1302bpTCAGTTTGGGAGACCAGACC20Exon13-14 CCAGTGTCCCATCAAGACCT20 58℃ 1550bpTCCTTACCCATGAAGGCTGT20Exon15 GAGCAGGCTGGAGAAGAGAG20 58℃ 478bpTGGGTGAAGGCATGACAGAT20Exon16 GCTTTCAGGCAGGAGCTAGA20 60℃ 533bpGGGTGGGTAGCTGGGTAGAT20Exon17 CTCGGAGCTGTTTGTCACAG20 60℃ 819bpAGGGCATGAGTGGTGGATAG20Exon18 TGAAGACAGCTGGAGGCAAT20 60℃ 464bpGTACCGTCTCTCCCCTGTCA20Exon19 GAGGCCAAAGGCTGCTACTCAG 22 60℃ 約300bpCCTGTCCCCTCTGGGTGGAACT 22Exon20 AAGAGTGCCCGCAGAGC 17 62℃ 364bpGGTACcAGCGCTCCACTG 18Exon21 CACTTGGAAGGCATTCTCATC 21 58℃ 796bpCCTGGGTCACTCAGACTTACG 21Exon22 GCCTACTGTCTGTCCCCAAC20 60℃ 299bpGGCCATAGGACATCAGAAGC20Exon23 CAGCCAGGGAGTTCATTCTT20 58℃ 503bpATCCTCCTATGAAGATCCAGCA 22Exon24 CTCAAGCGAGGTACAGAATTAAATGA 60℃ 約300bp
GGGCTTTCAGATGCAGACACTGATExon25 GCCTGTCTGATCTCCCTGTGTGA60℃CCTGTCTGGTCTCCCTGTGTCAExon26 GTCAATCCTGGCATCCTCAT 20 60℃ 307bpAAAGACTGTGAAGCGGCTCT 20Exon27 CAGGACTTTTTCCTCTGCACTC 22 58℃ 527bpAGGGTTGTACATGGCATTCAG 21Exon28 TGGCTCCTTGCCATATAGAGA 21 62℃ 1500bpGAACTCTGCCTGGTTGATCC 20PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性92℃ 1min；變性92℃ 10sec；退火62℃ 30secs；延伸72℃ 1.0min；循環(huán)35次；后延伸72℃ 5min。PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果不理想的由梯度PCR儀重新行PCR摸索最佳條件。
采用Qiagen公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。4、基因缺陷分析測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性96℃ 1min；變性96℃ 10sec；退火和延伸的溫度和時(shí)間同PCR條件；循環(huán)35次；后延伸4℃。所得測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物用乙醇純化。
測(cè)序應(yīng)用MAGEBASE1000測(cè)序儀及采取Sanger雙脫氧鏈終止法雙向測(cè)序。所有步驟及條件按照MAGEBASE1000測(cè)序儀要求，由MAGEBASE1000測(cè)序自帶序列讀取軟件讀取序列，應(yīng)用DNASTAR應(yīng)用軟件包中SeqMan軟件進(jìn)行分析。
通過(guò)上述程序后發(fā)現(xiàn)，Brugada綜合癥患者SCN5A基因發(fā)生了雜合的突變，為明確突變情況，對(duì)突變的序列進(jìn)行了克隆轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌，傳代，來(lái)自父系和母系的基因片段分開(kāi)。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該突變?yōu)镾CN5A基因第22個(gè)外顯子4087位置上插入了一個(gè)堿基C，參見(jiàn)圖2，其中最前與最后一排為基因編碼的氨基酸，中間為突變與正常的DNA序列比較。可見(jiàn)突變DNA與正常DNA序列比較，在4087位插入一個(gè)堿基C。突變導(dǎo)致第1313位氨基酸產(chǎn)生移碼突變，1314-1317氨基酸都與標(biāo)準(zhǔn)不同，1318位終止。我們采用國(guó)際慣例對(duì)此進(jìn)行了命名，稱之為SCN5A4087insC。5、突變?cè)斐傻陌被嵝蛄蟹治鲠槍?duì)SCN5A4087insC基因突變，我們分析了對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致通道蛋白1314-1317氨基酸發(fā)生改變并自1318位終止(參見(jiàn)圖2)，導(dǎo)致鈉離子通道第3結(jié)構(gòu)域S4結(jié)構(gòu)變化，S5-6缺失，第4結(jié)構(gòu)域全部缺失，結(jié)果參見(jiàn)圖3，其中左圖表示正常鈉離子通道α亞基模式圖，由4個(gè)重復(fù)的結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域有6個(gè)跨膜螺段，共有24個(gè)螺段；4個(gè)結(jié)構(gòu)域彼此互相折疊、靠攏，圍在一起，形成中間孔道，允許鈉離子進(jìn)入。右圖表示在突變后，第3結(jié)構(gòu)域S4結(jié)構(gòu)變化，S5-6缺失，第4結(jié)構(gòu)域全部缺失。這些缺失導(dǎo)致鈉離子孔道無(wú)法形成，通道不完整。6、突變基因重組體的構(gòu)建為了建立研究該突變基因可能造成的功能缺陷和以后基因治療以及藥物治療上的需要，我們構(gòu)建了該突變基因的重組體。
(1)野生型SCN5A基因重組體的構(gòu)建；1)提取心肌細(xì)胞總RNA.一般采用TRIzol Reagent試劑盒，方法參考Trizol抽提試劑盒說(shuō)明書；2)用poly(dT)引物逆轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA，再用特異性引物做PCR，合成雙鏈DNA；SCN5A的RT-PCR的特異性引物如下PrimerSCN5AfGGAAGCTTTGTGCCCAGAAGCAGGAHind IIIPrimerSCN5ARGAGATATTCCCCCAGGCTGGTTTGTGEcoRV具體步驟如下Oligo(dT)12-18引物(1ug/ul) 1ulTotal RNA X(1ng-5ug)10mM dNTP 1.0ulDEPC H2O10-X ul12.0ul↓65℃，10min，迅速冰上冷卻，離心；↓+5xBuffer 4.0ul0.1DTT 2.0ulSuperScriptTMII(200U/ul) 1.0ulRnaseOUTTM(40U/ul)1.0ul↓20.0ul水域42℃，60min→70℃，15min→至于冰水中10xBuffer 5.0ul50mM MgCl21.5ul1ul 10mMdNTP 1.0ulPrimerF(10uM) 1.0ulPrimerR(10uM) 1.0ulTaq DNA polymerase(5U/ul) 0.4ulcDNA(from first-strand reaction) 2ulddH2O38.1ul↓ 50.0ul2xGC Buffer12.5ul25mM dNTP 4.0ulPrimerF(10uM) 1.0ulPrimerR(10uM) 1.0uldd H2O4.5ulcDNA(from first-stand reaction)2.0ulTaq/pfu(10∶1)(5U/ul) 0.25ulPCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 1min；變性95℃ 30sec；退火61℃ 1min；延伸68℃ 10min；循環(huán)30次；后延伸72℃ 5min。
3)Hind III和EcoRV酶切pcDNA3.1(+)；4)用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化；5)用T4DNA連接酶(promega)連接pcDNA3.1和插入片段SCN5A，參圖4；6)電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，在瓊脂培養(yǎng)板上劃板，37過(guò)夜；7)挑菌，在加Ampicillin的液體LB培養(yǎng)液中過(guò)夜；8)提質(zhì)粒，用插入序列上沒(méi)有的載體上有的酶切位點(diǎn)做酶切；9)經(jīng)過(guò)KpnI酶切后證實(shí)重組體構(gòu)建成功，參見(jiàn)圖5，其中1DNA ladder(1kb)；2pcDNA3.1-SCN5A經(jīng)KpnI限制性內(nèi)切酶作用得到的兩個(gè)DNA片斷，長(zhǎng)度分別為長(zhǎng)度為4314bp和7233bp；3pcDNA3.1-SCN5A，片斷長(zhǎng)度為11547bp；10)直接測(cè)序，證明SCN5A-pcDNA3.1重組體構(gòu)建成功。
(2)通過(guò)定點(diǎn)突變獲取突變型SCN5A-pcDNA3.1利用QuickChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene)進(jìn)行SCN5A-pcDNA3.1的定點(diǎn)突變，在4887bp位置插入了一個(gè)堿基C(參見(jiàn)圖6)，并經(jīng)直接測(cè)序證實(shí)。
(3)含野生型SCN5A和突變型SCN5A細(xì)胞株的建立1)野生型SCN5A-pcDNA3.1細(xì)胞株的建立在轉(zhuǎn)染前二天，將細(xì)胞以2×105的密度接種到24孔板中，培養(yǎng)基0.5m為包含10％胎牛血清的MEM，不含抗生素。次日細(xì)胞長(zhǎng)到約90-95％融合。以每孔100μl DNA轉(zhuǎn)染試劑混合物(1μg野生型SCN5A-pcDNA3.1質(zhì)粒/50μl無(wú)血清MEM2μlLipofectAMINEF2000轉(zhuǎn)染試劑/50μl無(wú)血清MEM)的量直接加到細(xì)胞中。在37℃含5％ CO2的孵箱中孵育24小時(shí)。此后將其按1∶10的細(xì)胞比例放到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此時(shí)培養(yǎng)基已經(jīng)含有800μg/ml的G418用以篩選抗性細(xì)胞。當(dāng)肉眼可見(jiàn)培養(yǎng)瓶中有白色點(diǎn)狀單個(gè)細(xì)胞克隆時(shí)，刮取后移至新的培養(yǎng)瓶中，約2個(gè)月后，細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)。
2)突變型SCN5A-pcDNA3.1細(xì)胞株建立方法同野生型SCN5A-pcDNA3.1細(xì)胞株的建立。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)布魯加達(dá)(Brugada)綜合癥基因突變的方法及用途，其特征是通過(guò)PCR及測(cè)序法獲得Brugada綜合征的一種SCN5A突變基因，再通過(guò)RT-PCR方法獲取野生型SCN5A的cDNA，利用克隆技術(shù)構(gòu)建該基因的重組體，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)獲取該基因的突變重組體，并將上述重組體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，用于Brugada綜合征的防治研究。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Brugada綜合癥基因突變的方法，其特征是該方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)1)采用鹽析法獲取相應(yīng)的基因組核苷酸序列；2)獲取目的基因(SCN5A，編碼心肌快鈉離子通道Alpha亞單位)的27個(gè)外顯子的PCR產(chǎn)物；3)采用Sanger雙脫氧鏈終止法雙向測(cè)序法分析各自的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)Brugada綜合征患者的SCN5A基因第22個(gè)外顯子存在缺陷，是1個(gè)雜合基因移碼突變，在4087位置上插入一個(gè)C，其序列為4150 tcactgcgga cgctgcgtgc actccgtcct ctgagagcct ctgtcacgatttgagggcat gagg 4114；4)獲取健康個(gè)體心肌組織樣本；5)通過(guò)RT-PCR法獲取SCN5A基因的cDNA，引物序列為PrimerSCN5AfGGAAGCTTTGTGCCCAGAAGCAGGAHind IIIPrimerSCN5ARGAGATATCCCCCAGGCTGGTTTGTGEcoRV6)構(gòu)建野生型SCN5A基因的質(zhì)粒重組體；7)將野生型SCN5A基因的質(zhì)粒重組體(SCN5A-pcDNA3.1)，通過(guò)定點(diǎn)突變獲取突變型SCN5A-pc DNA3.1，突變位于整個(gè)重組體中的第4887個(gè)與第4889之間。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)Brugada綜合癥基因突變的方法，其特征是構(gòu)建的SCN5A重組體，其載體為pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組體所使用的限制性內(nèi)切酶為Hind III和EcoRV。
4.如權(quán)利要求1和2所述的檢測(cè)Brugada綜合癥基因突變的方法，其特征是利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將該野生型SCN5A重組體和突變型SCN5A重組體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，通過(guò)G418進(jìn)行抗性篩選。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)Brugada綜合癥基因突變的方法及用途，其特征是該檢測(cè)方法可以用于人群中Brugada綜合征高?；颊叩脑缙谠\斷，而轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可以用于研究防治該綜合征的特異性藥物。
全文摘要
一種檢測(cè)布魯加達(dá)綜合癥基因突變的方法及用途，是通過(guò)PCR及測(cè)序法獲得Brugada綜合征的一種SCN5A突變基因，再通過(guò)RT－PCR方法獲取野生型SCN5A的cDNA，利用克隆技術(shù)構(gòu)建該基因的重組體，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)獲取該基因的突變重組體，并將上述重組體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，用于Brugada綜合征的防治研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1472341SQ0213631
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2002年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月30日
發(fā)明者陳君柱, 朱建華, 陶謙民, 鄭良榮, 張芙榮, 郭曉綱, 尚運(yùn)鵬 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院