專利名稱：一種非手術構建人/山羊嵌合體的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物細胞技術領域，涉及人源性干細胞宮內異種移植構建人/山羊嵌合體的方法，具體涉及人源性干細胞在非手術條件下進行宮內異種移植，構建人/山羊嵌合體的的方法。
本發(fā)明是在B超儀的監(jiān)視下，用非手術的方法將從人新鮮臍血分離富集的人造血干細胞(hHSC)或骨髓、肝臟等人體組織分離獲得的組織成體干細胞，直接注射于胎齡為45-55天的山羊腹腔中，建立人/山羊嵌合模型。
本發(fā)明通過以下步驟建立人/山羊嵌合模型1、收集獲得新鮮人臍血或骨髓、肝臟等人體組織分離獲得的組織成體干細胞，所得人新鮮臍血首先用NycoPrepTM(1.077g/mL，Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)梯度離心分離臍血中單個核細胞，然后用“人原始祖細胞富集雞尾酒”(Human PrimitiveProgenitor Enrichment Cocktail，Stemcell Technologies，Vancouver，Canada)試劑盒進一步分離獲得人造血干細胞(hHSC)。
將獲得的骨髓、肝臟組織分別進行灌注、沖洗、研磨、過濾，然后用“人原始祖細胞富集雞尾酒”試劑盒進一步分離獲得人組織成體干細胞。
2、將山羊在B超儀的監(jiān)視下，定位到子宮內的胎山羊，確定其頭部、脊柱等定位標志，然后用穿刺針經母體皮膚、子宮壁直接穿刺入胎山羊的腹腔，將人組織成體干細胞直接注射于胎山羊腹腔內，建立人/山羊嵌合模型。本發(fā)明所用胎山羊其胎齡為45-55天。本發(fā)明避免了用開腹手術作異體移植。本發(fā)明為32頭胎羊進行宮內異種移植，注射1×105的組織成體干細胞，每頭羊的移植全過程只需3-5分鐘。注射后定期用B超觀察胎羊生長發(fā)育的情況。
本發(fā)明所述直接注射方法可反復進行。
3、非手術移植獲得的人/山羊嵌合體中人源細胞進行擴增、分化和基因表達檢測(1)進行FACS分析本發(fā)明采用的PE(phycoerythrin)和FITC共價標記的鼠抗人CD抗原，GPA和HLA抗原的單克隆抗體購自美國B.D.公司，流式細胞儀為美國B.D.公司產品。本發(fā)明中FACS的分析步驟按美國B.D.公司的操作指南進行，通過鼠抗人單抗對正常山羊和人兩者之間的細胞結合能力的比較分析。
(2)DNA分析①抽提DNA；②設計PCR引物通過Genbank分別查詢人CD34、血型糖蛋白A(Glycophorin A，Gly A)，與山羊的序列進行同源性比對，選取非同源的部分設計引物。
③檢測引物特異性將合成的各對引物分別擴增人基因組DNA和對照組羊DNA，檢測其特異性。
④按常規(guī)方法進行PCR檢測人/山羊造血干細胞嵌合模型中的人CD34基因和Gly A基因，其中陽性特異性擴增帶分別為437bp和479bp。
⑤RT-PCR檢測人/山羊造血干細胞嵌合模型抽提總RNA使用QIAGEN公司的QIAampRNA Blood Kit從羊外周血中抽提總RNA。將RNA逆轉錄為cDNA使用BRL公司的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。
PCR擴增CD34基因、GlyA基因以逆轉錄生成的cDNA為模板，具體擴增過程同上。⑥對移植的胎羊進行組織學和免疫組織化學檢查。⑦對被移植胎羊的母體血液行血液學檢查。
其中1、山羊子宮壁；2、山羊羊膜囊；3、胎山羊頭部；4、胎山羊腹腔；5、宮內胎山羊腹腔穿刺點；6、胎山羊脊柱
32頭正常妊娠受試的山羊，取其中3頭妊娠110天山羊，剖腹取胎后，抽取其心臟血作FACS、PCR、Southern雜交分析，并對肝臟組織進行RT-PCR、免疫組化和FISH分析，以觀察山羊的組織中是否出現人源細胞。經FACS分析，結果顯示，所有經檢測的受試胎山羊的血液中均有組織成體干細胞的嵌合，CD34+細胞的頻率分別為0.64％、0.6％和1.44％，GPA+細胞的頻率分別為0.87％、2.61％和2.65％，PCR結果顯示CD34和GPA DNA均為陽性，Southern雜交結果表明組織成體干細胞陽性嵌合的山羊基因組中含有人類特異的α-衛(wèi)星序列。陽性山羊肝臟切片的免疫組化實驗證明有人肝細胞特異抗原(HSA)存在。RT-PCR結果顯示人的肝細胞核因子(hHNF-3β)和人血清白蛋白mRNA表達。FISH分析表明在山羊肝組織中嵌合有人基因特異雜交信號的人源細胞。
受試的32頭胎羊中，僅一頭于移植組織成體干細胞的一周內流產，其余均正常妊娠；而在另一組50頭手術注射組織成體干細胞的受體山羊中，有11頭胎羊于移植后一周內流產。
本發(fā)明在B超監(jiān)視下經皮穿刺胎山羊腹腔內注射人組織成體干細胞，完成異種移植，形成人/山羊嵌合模型。本方法的優(yōu)點是非手術方法建立人/山羊嵌合模型，較目前采用的手術方法快捷、安全、可靠、流產率低、成功率高，移植全過程僅需3-5分鐘，32頭非手術移植羊中僅一頭流產，手術移植組50頭羊11頭流產。證實本方法的安全可靠、成功率高。本發(fā)明對加速干細胞體內擴增、分化的研究并，對進行宮內移植與宮內治療均具有重要的價值。
權利要求
1.一種非手術構建人/山羊嵌合體的方法，其特征是在影像監(jiān)視下，直接注射人源干細胞至胎山羊腹腔內，建立人/山羊嵌合體模型。
2.按權利要求1所述的非手術構建人/山羊嵌合體的方法，其特征是所述影像監(jiān)視包括X線監(jiān)視和B超監(jiān)視。
3.按權利要求1所述的非手術構建人/山羊嵌合體的方法，其特征是所述人源干細胞指來源于人體任何組織的細胞，包括干細胞和間充質細胞。
4.按權利要求1所述的非手術構建人/山羊嵌合體的方法，其特征是所述嵌合體模型是人和非人哺乳動物構成的嵌合模型。
5.按權利要求1所述的非手術構建人/山羊嵌合體的方法，其特征是所述直接注射方式可以重復多次。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物組織細胞技術領域，具體涉及人源性干細胞在影象監(jiān)視下非手術進行宮內異種移植，構建人/山羊嵌合體的方法。本方法在移植山羊體的循環(huán)血液、肝臟等重要組織中成功形成人源性細胞，并具有相應組織人源細胞的基因表達和功能。與手術移植比較，該方法快捷、安全、流產率低、成功率高。為建立人/非人哺乳動物嵌合模型創(chuàng)建了新的技術平臺。對加速干細胞體內擴增、分化的研究并對進行官內移植與官內治療均具有重要的價值。
文檔編號C12N5/08GK1429561SQ02136780
公開日2003年7月16日 申請日期2002年9月3日 優(yōu)先權日2002年9月3日
發(fā)明者曾凡一, 黃淑幀, 曾溢滔 申請人:上海凡華生物技術有限公司