專利名稱：用于動物細胞消化接種的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于動物細胞培養(yǎng)擴大接種的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
用于重組蛋白、基因治療用重組病毒和病毒疫苗生產(chǎn)的動物細胞系大多具有貼壁依賴的特性，這類細胞必須生長在載體的表面上。在工業(yè)化動物細胞培養(yǎng)過程中，在達到最終生產(chǎn)規(guī)模前，需要應(yīng)用一系列逐級擴大的反應(yīng)器培養(yǎng)種子細胞。接種是貼壁細胞擴大培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵。因此，我們發(fā)明了一種用于動物細胞培養(yǎng)擴大接種的消化反應(yīng)器，本發(fā)明是基于此消化反應(yīng)器的消化工藝。
目前文獻報道的接種方法主要有三種1.消化接種，其主要過程為利用大量的方瓶或滾瓶培養(yǎng)種子細胞，當(dāng)細胞長滿生長表面時，對這些方瓶或滾瓶依次消化，然后將細胞混于一處接入反應(yīng)器中，完成接種過程。(Wentz D.and Schugerl K.Enzyme Microb.Technol.，1992，1468-75)。
2.原位消化接種，其主要過程為當(dāng)種子反應(yīng)器中細胞培養(yǎng)結(jié)束后，停止攪拌，待微載體沉降后小心地將培養(yǎng)上清排出，再用緩沖液洗滌，同樣小心地排出緩沖液，接著加入胰蛋白酶消化液，消化完成后加入含血清的培養(yǎng)基，使胰蛋白酶失活。最后經(jīng)過旋轉(zhuǎn)的振動篩板獲得單分散的細胞接入下一級反應(yīng)器，完成接種過程。(Wilktor，T.J.，Bernard J.，F(xiàn)anget L.V.，et al.USP 4664912，1987.)。
3.直接接種，其主要方法是將上一級的培養(yǎng)物，直接接入下一級的培養(yǎng)反應(yīng)器中，旨在通過細胞在新舊載體間的轉(zhuǎn)移完成接種過程。(Hu X.，Xiao C.，Huang Z.，et al.Cytotechnology 2000，3313-19，Cong C.，Chang Y.，Deng J.，et al.，Biotechnol.Lett.2001，23881-885)。
由于直接接種導(dǎo)致細胞在下級生物反應(yīng)器中不均勻分布，導(dǎo)致細胞生長緩慢和細胞密度不高。因此消化接種仍是最有效的接種方法。
目前文獻報道的消化工藝主要由3步構(gòu)成(Wentz D.and Schugerl K.Enzyme Microb.Technol.1992，1468-75，Wilktor，T.J.，Bernard J.，F(xiàn)anget L.V.，et al.USP 4664912，1987.)1.洗滌。在用胰蛋白酶消化前先用不含胰蛋白酶的磷酸緩沖液洗滌去除殘留的培養(yǎng)基。
2.消化。洗滌后，加入胰蛋白酶濃度為0.025％或0.05％的磷酸緩沖液，消化10～15分鐘，排除胰蛋白酶消化液。
3.分散。消化后加入含血清或蛋白酶抑制劑的培養(yǎng)基，中和殘留的胰蛋白酶。然后，用移液管吹打分散(小規(guī)模的方瓶消化)或通過振動的方法將細胞從載體上分離下來(大規(guī)模的反應(yīng)器消化)。
以上消化方法的主要不足是消化時間太長，從而影響種子細胞的活性。另一方面也很難得到單分散的種子細胞，很多細胞以細胞團的形式存在，不利于在下級反應(yīng)器培養(yǎng)中細胞在載體上的均勻分布，影響了細胞的生長。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供用于動物細胞培養(yǎng)擴大接種的試劑盒及其應(yīng)用，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中的前述缺陷。
技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種用于動物細胞消化接種的試劑盒，其中包括洗滌液和消化液。
本發(fā)明的洗滌液包含常規(guī)洗滌液和乙二胺四乙酸或其鹽，乙二胺四乙酸或其鹽的濃度為0.1～0.5g/L乙二胺四乙酸當(dāng)量。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，種子培養(yǎng)基中的二價金屬離子會影響到消化速率，因此，本發(fā)明在常規(guī)洗滌液內(nèi)添加了乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽，用于螯合培養(yǎng)基中的二價離子。所述常規(guī)洗滌液包括常用的無鈣、鎂離子的平衡鹽緩沖系統(tǒng)，這些是本領(lǐng)域所熟知的，例如D-Hanks平衡緩沖液，另可參見《組織培養(yǎng)和細胞學(xué)技術(shù)》(鄂征主編，北京出版社)。本發(fā)明實施方式之一中，所用的緩沖液是常規(guī)PBS緩沖液(例如氯化鉀0.20g/L，磷酸二氫鉀0.20g/L，氯化鈉8g/L，七水磷酸氫二鈉2.16g/L；見《組織培養(yǎng)和細胞學(xué)技術(shù)》，鄂征主編，北京出版社)。在本發(fā)明洗滌液中，除上述常規(guī)PBS組成之外，還包含0.1～0.5g/L乙二胺四乙酸或相同當(dāng)量的乙二胺四乙酸鹽。所述EDTA或其鹽優(yōu)選EDTA，EDTANa或EDTANa2。
本發(fā)明的消化液包含常規(guī)消化液和乙二胺四乙酸(或其鹽)和膠原酶。其中，乙二胺四乙酸(或其鹽)的濃度為0.1～0.5g/L乙二胺四乙酸或相同當(dāng)量的乙二胺四乙酸鹽，膠原酶的濃度為0.05～0.8g/L。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，消化后細胞的結(jié)團主要是因為二價離子的存在和細胞表面膠原蛋白的作用，因此我們在常規(guī)消化液中加入了可螯合二價離子的EDTA或其鹽和可作用于細胞表面膠原蛋白的膠原酶，用于提高種子細胞的分散性。所述的常規(guī)消化液包括常用的加有胰蛋白酶的無鈣、鎂離子的平衡鹽緩沖系統(tǒng)，這些是本領(lǐng)域所熟知的，例如D-Hanks平衡緩沖液，另可參見《組織培養(yǎng)和細胞學(xué)技術(shù)》(鄂征主編，北京出版社)。本發(fā)明實施方式之一中，所用的常規(guī)消化液為PBS+Trypsin消化液(例如氯化鉀0.20g/L，磷酸二氫鉀0.20g/L，氯化鈉8g/L，七水磷酸氫二鈉2.16g/L，胰蛋白酶濃度為0.25g/L)(《組織培養(yǎng)和細胞學(xué)技術(shù)》鄂征主編，北京出版社)。所述EDTA或其鹽優(yōu)選EDTA，EDTANa或EDTANa2。此外，本發(fā)明實施方式中，胰蛋白酶的濃度為0.1～0.8g/L。
本發(fā)明還提供了一種用于動物細胞接種的消化方法，依次包括以下步驟(1)用本發(fā)明所述試劑盒中的洗滌液洗滌貼壁于培養(yǎng)載體上的動物細胞種子；(2)用本發(fā)明所述試劑盒中的消化液將貼壁動物細胞從載體上的消化；(3)將細胞從載體上分離，并分散成單細胞懸液。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明在以上步驟1和步驟2中還采用了低剪切攪拌，這樣可以使得洗滌和消化過程具有更均勻的環(huán)境條件。本發(fā)明在以上步驟3中還采用了高剪切攪拌，其目的在于促進消化后的細胞從載體上剝離。本發(fā)明所述的低剪切是指該剪切力足以在洗滌或消化系統(tǒng)內(nèi)形成局部或整體湍流，但不會破壞動物細胞的完整性。這樣的無害攪拌是動物細胞培養(yǎng)過程中的常規(guī)操作，因此，攪拌方式，裝置的選擇，攪拌強度的控制都屬于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所掌握的常規(guī)技術(shù)，通過簡單的試驗即可確定。例如，本發(fā)明實施方式中采用了0.2～2dyne/cm2強度的低剪切攪拌。本發(fā)明在所述剪切強度的攪拌下可以選擇不同的作用時間，如洗滌1～2分鐘，消化4～8分鐘。
本發(fā)明分離步驟中的高剪切攪拌是指該攪拌強度足以將消化后仍然貼壁的動物細胞與載體分離，但不會破壞動物細胞的完整性。同理，由于無害攪拌是動物細胞培養(yǎng)過程中的常規(guī)操作，因此，攪拌方式，裝置的選擇，攪拌強度的控制都屬于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所掌握的常規(guī)技術(shù)，通過簡單的試驗即可確定。例如，本發(fā)明實施方式中采用了15～35dyne/cm2強度的高剪切攪拌。在所述高剪切強度攪拌下，所述分離步驟作用時間依細胞和環(huán)境條件而定，如4～10分鐘。
有益效果本消化工藝消化速率快，僅需10分鐘左右。得到的細胞呈單分散狀態(tài)，有利于細胞在下級反應(yīng)器中的均勻分布。細胞的收率和活性都很高，有利于提高活細胞接種密度和細胞的快速生長。本消化工藝應(yīng)用范圍廣泛，可用于CHO、BHK等細胞的實驗室培養(yǎng)，工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白，Vero細胞工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)病毒疫苗和293細胞工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)基因治療用重組腺病毒等各種貼壁細胞培養(yǎng)過程。本消化工藝操作方便，洗滌液和消化液成本低，易于被使用者接受。


圖1顯示了本發(fā)明以反應(yīng)器消化模式進行的一種實施方式。
圖2顯示本發(fā)明實施方式之一中5升反應(yīng)器接種培養(yǎng)Vero細胞的生長曲線。
具體實施例方式
以下將結(jié)合附圖舉例說明本發(fā)明的實施方式。但是需要指出的是，以下具體描述僅以說明為目的，不應(yīng)將其理解成是對本發(fā)明范圍的限定。因為，根據(jù)以下描述，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員不難根據(jù)本發(fā)明構(gòu)思，推導(dǎo)得出許多等效的改換方式，而這些理應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例1～4用本發(fā)明的試劑盒和消化方法消化微載體培養(yǎng)的BHK、CHSE、CHO和Vero種子細胞。實現(xiàn)從1升反應(yīng)器到5升反應(yīng)器間的接種。1升反應(yīng)器為微載體培養(yǎng)，工作體積為0.7升，5升反應(yīng)器為固定床培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)，工作體積為3.5升。洗滌液中的EDTA，消化液中的胰蛋白酶濃度，膠原酶濃度如表1所示。
將種子懸浮液從1升反應(yīng)器壓入消化反應(yīng)器，并從消化反應(yīng)器的底部排出培養(yǎng)上清。從底部通入預(yù)熱到37℃的洗滌液，通過壓力從底部排出，洗滌時間和攪拌強度如表1所示。從消化反應(yīng)器的底部通入預(yù)熱到37℃的消化液，利用壓力將消化液從底部排出，消化時間和攪拌強度如表1所示。從消化反應(yīng)器的底部通入預(yù)熱到37℃的培養(yǎng)基，利用壓力將培養(yǎng)液從消化反應(yīng)器壓到5升反應(yīng)器中培養(yǎng)，消化時間和攪拌強度如表1所示。經(jīng)如此消化的細胞活性(臺盼藍染色計數(shù)確定)、收率及分散度(單分散細胞的比率)見表2。
表1本實施例中對于不同細胞的消化條件

表2 細胞消化的收率、活性及分散度(細胞密度105cells/mL)

*取樣檢測的時間(天)實施例5本發(fā)明的試劑盒也可用于方瓶培養(yǎng)的接種消化。方瓶體積為75ml，裝液量為10ml，培養(yǎng)細胞為Vero細胞，當(dāng)細胞單層長滿時，傾去培養(yǎng)基，加入5ml的洗滌液，輕輕搖晃兩下，傾去洗滌液，加入消化液，放置3分鐘后傾去消化液，加入10ml培養(yǎng)基，用移液管將細胞從瓶的生長表面吹下來，按1∶10的比例傳到同樣大小的培養(yǎng)瓶中，4天后細胞單層長滿。消化條件見表3，消化結(jié)果見表4。
表3 本實施例的消化條件

表4本實施例中細胞消化的收率、活性及分散度(細胞密度105cells/mL)

與常規(guī)的消化技術(shù)相比，細胞的分散度有明顯提高，有利于細胞傳代后的貼壁和快速生長。
權(quán)利要求
1.一種用于動物細胞消化接種的試劑盒，其中包括(1)洗滌液，其中包含常規(guī)洗滌液和0.1～0.5g/L乙二胺四乙酸或相同當(dāng)量的乙二胺四乙酸鹽，和(2)消化液，其中包含常規(guī)消化液和0.1～0.5g/L乙二胺四乙酸或相同當(dāng)量的乙二胺四乙酸鹽和濃度為0.05～0.8g/L的膠原蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的常規(guī)洗滌液為磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的常規(guī)消化液為含胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述胰蛋白酶的濃度為0.1～0.8g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的乙二胺四乙酸或其鹽選自乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸一鈉或乙二胺四乙酸二鈉。
6.一種用于動物細胞接種的消化方法，依次包括以下步驟(1)用權(quán)利要求1所述試劑盒中的洗滌液洗滌貼壁于培養(yǎng)載體上的動物細胞種子；(2)用權(quán)利要求1所述試劑盒中的消化液將貼壁動物細胞從載體上消化；(3)將細胞從載體上分離，并分散成單細胞懸液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的消化方法，其中，步驟1和步驟2還包括剪切強度為0.2～2dyne/cm2的攪拌，步驟3還包括剪切強度為15～35dyne/cm2的攪拌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的消化方法，其中，步驟1的洗滌進行1～2分鐘，步驟2的消化進行4～8分鐘，步驟3的分離/分散進行4～10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于動物細胞培養(yǎng)擴大接種的試劑盒及其應(yīng)用。
文檔編號C12N5/07GK1483804SQ02137068
公開日2004年3月24日 申請日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月20日
發(fā)明者孫祥明, 張元興 申請人:華東理工大學(xué)