專利名稱：鼻咽癌相關基因ngx6表達產物的獲取及抗體的制備的制作方法
專利說明鼻咽癌相關基因NGX6表達產物的獲取及抗體的制備 本發(fā)明涉及鼻咽癌相關基因NGX6表達產物的獲取及抗體的制備，屬于基因工程領域。鼻咽癌是東南亞和我國南方各省常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居世界首位，嚴重威脅人民的生命安全。目前對于鼻咽癌的早期診斷尚無有效的方法，患者一旦發(fā)現(xiàn)多已是中晚期，因而急待開發(fā)用于鼻咽癌早期診斷的新型手段。經過研究發(fā)現(xiàn)，NGX6與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關聯(lián)，本發(fā)明采用多聚酶鏈式反應(PCR)方法克隆NGX6基因蛋白編碼序列，構建該基因的融合表達質粒，導入JM109的大腸桿菌中，IPTG誘導其在大腸桿菌中的表達，SDS-PAGE電泳，Western blot鑒定，用GST融合蛋白純化試劑盒純化融合蛋白。用HPLC大量分離與純化蛋白質，并進一步制備兔多抗及小鼠單抗。在大規(guī)模的正常與患病人群中通過抗體檢測NGX6的表達水平，建立檢測標準。
具體如下?lián)吮磉_載體pEGX-3X的GST閱讀框架設計引物，使NGX6基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致。以含NGX6基因的質粒為模板(0.1μg)，加入上述引物各10pmol進行擴增，回收PCR產物條帶。用SmalI酶切PCR回收產物及pEGX-3X載體，產生匹配的粘末端。小膠回收試劑回收線性的4.9kb的載體，NGX6編碼區(qū)片段。將pEGX-3X載體與NGX6基因連接，構建成符合閱讀框的GST-NGX6融合基因。用含融合基因的pEGX-3X質粒轉化大腸桿菌JM109，小量制備質粒DNA，SalI和NotI酶切鑒定是否含插入片段，含插入片段的陽性克隆質粒DNA純化后用DNA自動測序儀測序。
單個陽性菌落接種入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培養(yǎng)液中，于37℃過夜培養(yǎng)，將400μl過夜培養(yǎng)物分別接種到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培養(yǎng)7h，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，培養(yǎng)2.5h，轉移至50ml離心管中。室溫12000×g離心10min，去盡上清，置于冰上，重懸于預冷的600μl的PBS中。加入終濃度為100μg/ml的溶菌酶、10μg/ml DNase I，用液氮和溫水介導的反復凍融法破膜，11000rp離心10min，收集上清。重懸GST MicroSpin純化柱中的樹脂，打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，棄液體，蓋上底蓋，柱中加入600μl的細菌裂解液。蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5～10min后打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗滌2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脫液，蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5-10min。735×g離心1min收集流出液。
誘導后的菌液超聲破碎裂解后，SDS-PAGE電泳，KCl染色后，切下融合蛋白條帶，反復凍融，加入等體積的福氏完全佐劑混勻，乳化后備用。
多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；兩周后，注射抗原，采取背部多點注射；一周后加強一次，重復2-3次后采血。用環(huán)狀沉淀實驗確定其效價，當效價達到要求后，即可處死動物，收集血清。
單抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬細胞及小鼠的脾細胞，與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性克隆，大量培養(yǎng)，可收集抗體，也可接種小鼠后，收集其血清或腹水。
收集正常與癌標本多例，通過western blot和FISH檢測NGX6的表達水平，確定NGX6在正常與異常組織中的表達差異，建立診斷標準。
NGX6是鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的重要的相關基因之一；它的表達產物蛋白質作用于鼻咽癌細胞，具有基因治療意義；抗體可用于鼻咽癌診斷。

圖1融合蛋白的誘導與表達。
圖2融合蛋白的純化。
圖3瓊脂雙向擴散實驗測定抗NGX6血清的效價和純度。1.(1)據(jù)原核表達載體pEGX-3X的GST閱讀框架設計引物，使NGX6基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致構建成符合閱讀框的GST-NGX6融合基因。用含融合基因的pEGX-3X質粒轉化大腸桿菌JM109，鑒定含插入片段的陽性克隆質粒(2)單個陽性菌落接種入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培養(yǎng)液中，37℃，過夜培養(yǎng)。將400μl過夜培養(yǎng)物分別接種到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培養(yǎng)7h，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，培養(yǎng)2.5h，轉移至50ml離心管中。室溫12000×g離心10min，去盡上清，置于冰上，重懸于預冷的600μl的PBS中。加入終濃度為100μg/ml的溶菌酶、10μg/ml DNase I，用液氮和溫水介導的反復凍融法破膜，11000rp離心10min，收集上清。(3)重懸GST MicroSpin純化柱中的樹脂，打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，棄液體，蓋上底蓋，柱中加入600μl的細菌裂解液。蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5-10min后打開蓋及底蓋，置于一干凈的1.5ml的離心管中，735×g離心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗滌2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脫液，蓋緊上蓋，輕輕混勻，置于室溫5-10min。735×g離心1min收集流出液。(4)誘導后的菌液超聲破碎裂解后，SDS-PAGE電泳，KCl染色后，切下融合蛋白條帶，反復凍融，加入等體積的福氏完全佐劑混勻，乳化后備用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；兩周后，注射抗原，采取背部多點注射；一周后加強一次，重復2-3次后采血。用環(huán)狀沉淀實驗確定其效價，當效價達到要求后，即可處死動物，收集血清。單抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬細胞及小鼠的脾細胞，與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性克隆，大量培養(yǎng)，可收集抗體，也可接種小鼠后，收集其血清或腹水。
權利要求
1.一種鼻咽癌相關基因NGX6表達產物的獲取，采用多聚酶鏈式反應方法克隆NGX6基因蛋白編碼序列，構建該基因的融合表達質粒，導入JM109的大腸桿菌中，IPTG誘導其在大腸桿菌中的表達，SDS-PAGE電泳，Western blot鑒定，用GST融合蛋白純化試劑盒純化融合蛋白，本發(fā)明據(jù)原核表達載體pEGX-3X的GST閱讀框架設計引物，使NGX6基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致；其特征在于以含NGX6基因的質粒為模板(0.1μg)，加入上述引物各10pmol進行擴增，回收PCR產物條帶；用SmalI酶切PCR回收產物及pEGX-3X載體，產生匹配的粘末端；小膠回收試劑回收線性的4.9kb的載體，NGX6編碼區(qū)片段；將pEGX-3X載體與NGX6基因連接，構建成符合閱讀框的GST-NGX6融合基因；用含融合基因的pEGX-3X質粒轉化大腸桿菌JM109，小量制備質粒DNA，SalI和NotI酶切鑒定是否含插入片段，含插入片段的陽性克隆質粒DNA純化后用DNA自動測序儀測序。
2.根據(jù)權利要求1所述NGX6表達產物的多抗體的制備方法，其特征在于用HPLC大量分離與純化蛋白質，兔右足后趾注射30mg卡介苗；兩周后，注射抗原，采取背部多點注射；一周后加強一次，重復2-3次后采血。用環(huán)狀沉淀實驗確定其效價，當效價達到要求后，收集血清。
3.根據(jù)權利要求1所述NGX6表達產物的單抗體的制備方法，其特征在于用HPLC大量分離與純化蛋白質，免疫小鼠后收集腹腔巨噬細胞及小鼠的脾細胞，與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性克隆，大量培養(yǎng)，可收集抗體，也可接種小鼠后，收集其血清或腹水。
全文摘要
一種鼻咽癌相關基因NGX6表達產物的獲取及抗體的制備。本發(fā)明采用多聚酶鏈式反應方法克隆NGX6基因蛋白編碼序列，構建該基因的融合表達質粒，導入JM109的大腸桿菌中，IPTG誘導其在大腸桿菌中的表達，SDS－PAGE電泳，Western blot鑒定，用GST融合蛋白純化試劑盒純化融合蛋白，本發(fā)明據(jù)原核表達載體pEGX－3X的GST閱讀框架設計引物，使NGX6基因的編碼區(qū)閱讀框與GST的閱讀框架一致。NGX6是鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的重要的相關基因之一；它的表達產物蛋白質作用于鼻咽癌細胞，具有基因治療意義；抗體可用于鼻咽癌診斷。
文檔編號C12N15/62GK1482243SQ0213960
公開日2004年3月17日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權日2002年9月13日
發(fā)明者李桂源, 李江, 張秋紅, 譚琛, 黃宇琛 申請人:中南大學