專(zhuān)利名稱(chēng)：一種簡(jiǎn)化的細(xì)胞凍存降溫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，廣泛適用于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外常用的組織培養(yǎng)凍存細(xì)胞技術(shù)中的降溫過(guò)程，是將具有生物活性的細(xì)胞溶液，從37℃的生長(zhǎng)狀態(tài)，采用逐級(jí)降溫法的過(guò)程凍存，即活性細(xì)胞懸液→-20℃，2-4小時(shí)→-40℃，2-4小時(shí)→-80℃，8-16小時(shí)→浸入液態(tài)氮(-196℃)，此過(guò)程最短需要8小時(shí)，最長(zhǎng)需要4-24小時(shí)，同時(shí)需要3種不同溫度的低溫設(shè)備。采用常規(guī)逐級(jí)降溫法凍存的細(xì)胞，在排除其他影響的條件下，是安全、可靠的，不影響細(xì)胞的復(fù)蘇率，細(xì)胞復(fù)蘇率是指在長(zhǎng)期冷凍保存狀態(tài)下的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)復(fù)蘇過(guò)程，恢復(fù)其活性與生物學(xué)特性的細(xì)胞數(shù)量。所以細(xì)胞凍存、復(fù)蘇的任一過(guò)程都與復(fù)蘇率相關(guān)。
發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種簡(jiǎn)化的細(xì)胞凍存降溫方法，該方法可以在保持較高細(xì)胞復(fù)蘇率的前提下，減少凍存操作時(shí)間，并且同時(shí)減少了低溫設(shè)備。
為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)措施是將活性細(xì)胞混入細(xì)胞凍存液中，分裝于無(wú)菌塑料小管內(nèi)，直接浸入液態(tài)氮中，長(zhǎng)期保存。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是縮短了細(xì)胞凍存的操作過(guò)程，節(jié)約時(shí)間8-24小時(shí)；省去了三種不同溫度的低溫設(shè)備，降低工作成本，提高工作效率，不影響凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率。
細(xì)胞復(fù)蘇率1、從液態(tài)氮中取出凍存的地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細(xì)胞(Hep-2)、豬腎細(xì)胞(PK)、人肝癌細(xì)胞(7721)各一小管→37℃水浴中，3分鐘速溶→加入8毫升細(xì)胞培養(yǎng)液，離心4000轉(zhuǎn)/10分鐘→棄上清→加入10％小牛血清MEM培養(yǎng)液10毫升/瓶→靜置37℃，培養(yǎng)16小時(shí)-24小時(shí)；
2、光鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見(jiàn)地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細(xì)胞(Hep-2)、豬腎細(xì)胞(PK)、人肝癌細(xì)胞(7721)均見(jiàn)細(xì)胞大面積貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)好，大小均勻，折光性好；3、復(fù)蘇率顯示BHK-21細(xì)胞復(fù)蘇率約65％，Hep-2細(xì)胞復(fù)蘇率約70％，PK細(xì)胞復(fù)蘇率約63％，7721細(xì)胞復(fù)蘇率約73％；4、培養(yǎng)48小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)成單層，繼續(xù)傳代培養(yǎng)；5、完成了細(xì)胞復(fù)蘇生長(zhǎng)繁殖周期。
比較例細(xì)胞凍存過(guò)程取培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細(xì)胞(Hep-2)、豬腎細(xì)胞(PK)、人肝癌細(xì)胞(7721)各一瓶→0.25％胰蛋白酶液，消化3分鐘→棄胰酶液→加入MEM培養(yǎng)液10毫升，吹打混勻細(xì)胞懸液→離心4000轉(zhuǎn)/10分鐘→棄上清→加入細(xì)胞凍存液2毫升/管，置入潔凈塑料小管→-20℃，2小時(shí)→-40℃，4小時(shí)→-80℃，8小時(shí)→浸入液態(tài)氮中保存兩年。
細(xì)胞復(fù)蘇率1、從液態(tài)氮中取出凍存的地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細(xì)胞(Hep-2)、豬腎細(xì)胞(PK)、人肝癌細(xì)胞(7721)各一小管→37℃水浴中，3分鐘速溶→加入8毫升細(xì)胞培養(yǎng)液，離心4000轉(zhuǎn)/10分鐘→棄上清→加入10％小牛血清MEM培養(yǎng)液10毫升/瓶→靜置37℃，培養(yǎng)16小時(shí)-24小時(shí)；2、光鏡下觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)，可見(jiàn)地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細(xì)胞(Hep-2)、豬腎細(xì)胞(PK)、人肝癌細(xì)胞(7721)均見(jiàn)細(xì)胞大面積貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)好，大小均勻，折光性好；3、復(fù)蘇率顯示BHK-21細(xì)胞復(fù)蘇率約64％，Hep-2細(xì)胞復(fù)蘇率約72％，PK細(xì)胞復(fù)蘇率約63％，7721細(xì)胞復(fù)蘇率約70％；4、培養(yǎng)48小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)成單層繼續(xù)傳代培養(yǎng)；5、完成了細(xì)胞復(fù)蘇生長(zhǎng)繁殖周期。
權(quán)利要求
1.一種簡(jiǎn)化的細(xì)胞凍存降溫方法，其特征在于將活性細(xì)胞混入細(xì)胞凍存液中，分裝于無(wú)菌塑料小管內(nèi)，直接浸入液態(tài)氮中，長(zhǎng)期保存。
全文摘要
一種簡(jiǎn)化的細(xì)胞凍存降溫方法，其特征在于將活性細(xì)胞混入細(xì)胞凍存液中，分裝于無(wú)菌塑料小管內(nèi)，直接浸入液態(tài)氮中，長(zhǎng)期保存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是縮短了細(xì)胞凍存的操作過(guò)程，節(jié)約時(shí)間8－24小時(shí)；省去了三種不同溫度的低溫設(shè)備，降低工作成本，提高工作效率，不影響凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1415745SQ0214470
公開(kāi)日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2002年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
發(fā)明者李天憲, 范兆軍, 陳繩亮, 熊克娟, 張忠 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所