專利名稱：發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，更確切地說是涉及一種采用酵母菌作為菌種的發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
酶是一種作用范圍廣、反應(yīng)條件溫和、催化效率高、立體選擇性及底物專一性強(qiáng)的生物催化劑，在醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、精細(xì)化工及食品工業(yè)等方面均有著較為廣泛的應(yīng)用。而在應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的酶中，無論從市場(chǎng)價(jià)值還是從應(yīng)用的范圍來說，脂肪酶都是最為重要的酶之一。
脂肪酶除可以催化酯化反應(yīng)外，還可以催化多種反應(yīng)。脂肪酶(三酰基甘油酯水解酶)廣泛存在于高等動(dòng)物、微生物和植物中，現(xiàn)在用來生產(chǎn)工業(yè)脂肪酶酶制劑的微生物主要有假單胞桿菌(Pseudomonas)、毛霉菌(Mucor)、地霉菌(Geotrochum)、根霉(Rhizopus)、念珠菌(Candida)等，其中皺褶假絲酵母(Candida rugosa)就是廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)生菌之一。
盡管皺褶假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶的生化、結(jié)構(gòu)和催化特性已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，但是關(guān)于控制脂肪酶合成和分泌因素及條件的報(bào)道較少。另外遺傳研究證實(shí)在皺褶假絲酵母中有七種基因編碼不同的脂肪酶，Lotti等研究表明，編碼各種同功酶基因的表達(dá)可能存在不同的控制機(jī)制，所以培養(yǎng)基的組成就影響著所產(chǎn)生的脂肪酶中同功酶種類及比例。Gordillo等通過實(shí)驗(yàn)表明在發(fā)酵過程中采用不同的操作條件也影響所產(chǎn)生的同功酶種類及比例。所以在用發(fā)酵法生產(chǎn)皺褶假絲酵母脂肪酶過程中，為了保證發(fā)酵結(jié)果具有確定性和可重復(fù)性，選擇合適的培養(yǎng)條件特別是培養(yǎng)基組成是非常重要的。
現(xiàn)有技術(shù)中，利用微生物生產(chǎn)酶制劑所采用的培養(yǎng)基中主要成分為碳源和氮源。由于氮元素是構(gòu)成微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)的重要成分，亦是構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)核酸的重要成分，同時(shí)也是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)、酶和氨基酸等重要代謝物的成分，因此，在酶制劑工業(yè)中，氮源是不可缺少的重要原料。
當(dāng)前酶制劑工業(yè)生產(chǎn)中常用的氮源可分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。前者有硫酸銨、硝酸銨和尿素，而常用的有機(jī)氮源大多為酵母膏和胨類。從文獻(xiàn)報(bào)道來看，應(yīng)用于皺褶假絲酵母脂肪酶生產(chǎn)的氮源主要是無機(jī)氮源如硫酸銨和尿素，而尚未有采用油料餅粕特別是黃豆餅粉作為氮源的報(bào)道。在國(guó)內(nèi)，宋慶訓(xùn)等以尿素作為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵水平為19.5U/ml；吳國(guó)平等采用有機(jī)氮源魚胨和酵母膏進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每毫升發(fā)酵液酶活力為4.2U。在國(guó)外，Laksmi等和Obradors等用尿素作為氮源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶，發(fā)酵水平分別為4.43U/ml和8.0U/ml。Rao等同樣以尿素作為唯一氮源進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵水平為24.4U/克米糠。但是Montesinos等在用油酸和尿素進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)尿素與油酸之間在培養(yǎng)基中存在乳化現(xiàn)象。由于酵母細(xì)胞無法正常的吸收氮源，導(dǎo)致細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的能力降低，同時(shí)脂肪酶的生產(chǎn)也受到抑制，所以在發(fā)酵生產(chǎn)中尿素逐漸被硫酸銨所取代。Gordillo等和Dalmau等均以硫酸銨作為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵水平分別為12.1U/ml和5.3U/ml。最近， 等利用有機(jī)氮源酵母膏結(jié)合蛋白胨進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵水平達(dá)5.58U/ml。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法主要包括以皺褶假絲酵母為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心后取得離心液即包含所需的脂肪酶，所述的在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，以油料餅粕作為培養(yǎng)基唯一氮源。
本發(fā)明方法所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是油酸1～3g/L，磷酸二氫鉀 2～7g/L，硫酸鎂MgSO4·7H2O 0.1～1.2g/L，氯化鐵FeCl3·6H2O 5～15mg/L，肌醇 2～6mg/L，生物素 0.005～0.012mg/L，維生素 0.1～0.4mg/L，油料餅粕 16～90g/L。
所述的油料餅粕是以花生、大豆、油菜籽、棉籽、葵花籽、芝麻以及紅花為原料的油料餅粕，較佳的油料餅粕是以大豆、芝麻為原料的油料餅粕。發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件是在28～32℃下培養(yǎng)48～50小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速可以控制在180～240轉(zhuǎn)/分鐘。
本發(fā)明方法所述的斜面培養(yǎng)基是蛋白胨0.2～0.5g，瓊脂1.5～4g，然后加入麥芽浸出液至100mL。斜面培養(yǎng)條件是在28～30℃下培養(yǎng)24～26小時(shí)。
本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法針對(duì)現(xiàn)有培養(yǎng)基的發(fā)酵水平不高的情況，以油料餅粕作為氮源，如黃豆餅粉。黃豆餅粉含有粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和灰分等微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分。當(dāng)以黃豆餅粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基唯一氮源與硫酸銨、硝酸銨、尿素、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和玉米蛋白等氮源相比，皺褶假絲酵母發(fā)酵水平有了大幅度的提高，最高可達(dá)94U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)所報(bào)道的皺褶假絲酵母發(fā)酵水平，同時(shí)，還進(jìn)一步降低了皺褶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的成本。
具體實(shí)施例方式
下面將針對(duì)對(duì)本發(fā)明方法的具體實(shí)施例的詳細(xì)描述來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1①菌種皺褶假絲酵母(Candida rugosa)。
②斜面培養(yǎng)基蛋白胨0.3g，瓊脂2.5g，加麥芽浸出液至100mL。
③發(fā)酵培養(yǎng)基油酸2.0g/L，磷酸二氫鉀6.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.0g/L，氯化鐵(FeCl3·6H2O)10mg/L，肌醇4mg/L，生物素0.008mg/L，維生素B10.2mg/L，大豆餅粉16g/L。
④接種與培養(yǎng)條件首先取皺褶假絲酵母(Candida rugosa)菌種在斜面上劃線，28℃培養(yǎng)24小時(shí)；然后挑取菌體兩環(huán)接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)，30℃培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘；取1mL種子培養(yǎng)基接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液離心取得離心液即包含所需的脂肪酶。
測(cè)定脂肪酶酶活力發(fā)酵液在4℃、3000倍的重力加速度下離心15分鐘后測(cè)定脂肪酶酶活力，測(cè)得脂肪酶酶活力是33.33U/mL。
實(shí)施例2①菌種皺褶假絲酵母(Candida rugosa)。
②斜面培養(yǎng)基蛋白胨0.2g，瓊脂1.5g，加麥芽浸出液至100mL。
③發(fā)酵培養(yǎng)基油酸1.0g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.1g/L，氯化鐵(FeCl3·6H2O)5mg/L，肌醇2mg/L，生物素0.005mg/L，維生素B10.1mg/L，花生餅粕75g/L。
④接種與培養(yǎng)條件首先取皺褶假絲酵母(Candida rugosa)菌種在斜面上劃線，28℃培養(yǎng)24小時(shí)；然后挑取菌體兩環(huán)接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)，30℃培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘；取1mL種子培養(yǎng)基接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液離心取得離心液即包含所需的脂肪酶，測(cè)得脂肪酶酶活力是73U/mL。
實(shí)施例3①菌種皺褶假絲酵母(Candida rugosa)。
②斜面培養(yǎng)基蛋白胨0.5g，瓊脂4.0g，加麥芽浸出液至100mL。
③發(fā)酵培養(yǎng)基油酸3.0g/L，磷酸二氫鉀7.0g/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.2g/L，氯化鐵(FeCl3·6H2O)15mg/L，肌醇6mg/L，生物素0.012mg/L，維生素B10.4mg/L，大豆餅粉90g/L。
④接種與培養(yǎng)條件首先取皺褶假絲酵母(Candida rugosa)菌種在斜面上劃線，28℃培養(yǎng)24小時(shí)；然后挑取菌體兩環(huán)接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)，30℃培養(yǎng)12小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘；取1mL種子培養(yǎng)基接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液離心取得離心液即包含所需的脂肪酶，測(cè)得脂肪酶酶活力是94U/mL。
實(shí)施例4除油料餅粕是以芝麻為原料的油料餅粕，發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入量為40g/L外，其余同實(shí)施例1，分析離心液，其脂肪酶酶活力是35U/mL。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶的方法，主要包括以皺褶假絲酵母為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心后取得離心液即包含所需的脂肪酶，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，以油料餅粕作為培養(yǎng)基唯一氮源。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是油酸 1～3g/L，磷酸二氫鉀2～7g/L，硫酸鎂MgSO4·7H2O 0.1～1.2g/L，氯化鐵FeCl3·6H2O 5～15mg/L，肌醇 2～6mg/L，生物素 0.005～0.012mg/L，維生素 0.1～0.4mg/L，油料餅粕16～90g/L。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的油料餅粕是以花生、大豆、油菜籽、棉籽、葵花籽、芝麻以及紅花為原料的油料餅粕。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的油料餅粕是以大豆、芝麻為原料的油料餅粕。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基是蛋白胨0.2～0.5g，瓊脂1.5～4g，然后加入麥芽浸出液至100mL。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件是在28～32℃下培養(yǎng)48～50小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)條件是在28～30℃下培養(yǎng)24～26小時(shí)。
全文摘要
一種發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶的方法，是以皺褶假絲酵母為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，以油料餅粕作為培養(yǎng)基唯一氮源，發(fā)酵液離心后取得離心液即包含所需的脂肪酶。以油料餅粕作為培養(yǎng)基唯一氮源與硫酸銨、硝酸銨、尿素、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和玉米蛋白等氮源相比，發(fā)酵水平有了大幅度的提高，最高可達(dá)94U/mL，降低了皺褶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的成本。
文檔編號(hào)C12N9/18GK1454993SQ0215101
公開日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2002年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月4日
發(fā)明者童海寶, 趙相國(guó), 蔡揚(yáng), 劉華文, 徐靜安 申請(qǐng)人:上?；ぱ芯吭?br>