專利名稱：利用洋蔥伯克霍氏德氏菌JS－02制備系列D－a－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
D-a-氨基酸是一類具有光學(xué)活性的化合物，在醫(yī)藥、食品和農(nóng)藥領(lǐng)域有廣泛的用途。如D-苯丙氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-蛋氨酸是合成多肽藥物的重要組分；D-丙氨酸是合成甜味劑阿力甜的關(guān)鍵組分；D-纈氨酸是制備光學(xué)活性殺蟲劑的重要成分等。
近年來(lái)，隨著藥物研究的進(jìn)展，肽類藥物已經(jīng)逐漸成為藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，D-a-氨基酸由于其獨(dú)特的代謝特性而成為了肽類藥物制備的限制性組分；同時(shí)食品和農(nóng)藥的發(fā)展也帶動(dòng)了D-氨基酸在食品添加劑和手性農(nóng)藥合成中的需求。D-氨基酸的低成本、高收率制備技術(shù)成為了氨基酸的研究重點(diǎn)。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到用于本發(fā)明中進(jìn)行D-氨基酸生產(chǎn)的微生物洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02(以下簡(jiǎn)稱為JS-02菌株)，其具有產(chǎn)生D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶的能力，可以用于本發(fā)明中生產(chǎn)D-氨基酸。該菌株于2001年在我國(guó)江蘇省南京地區(qū)土壤中分離而得，其于2002年9月6日經(jīng)過(guò)中科院微生物研究所鑒定，然后于2002年12月16日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCCNO.M202047。
JS-02菌株具有下述性質(zhì)1、形態(tài)特征在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡分別觀察菌絲的形態(tài)和孢子形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該菌呈現(xiàn)桿狀，不形成芽孢，有端生鞭毛，一般為1-2條，可以移動(dòng)。
2、生理生化特征(1)明膠液化，陰性(2)淀粉水解，陰性(3)硝酸鹽還原，陰性(4)亞硝酸鹽還原，陰性(5)反硝化，陰性(6)熒光色素，陰性(7)水溶性非熒光色素，陰性(8)嚴(yán)格好氧，陽(yáng)性(9)兼性厭氧，陰性(10)接觸酶，陽(yáng)性(11)氧化酶，陽(yáng)性(12)PHB，陽(yáng)性(13)甲基紅試驗(yàn)，陰性(14)VP試驗(yàn)，陰性(15)精氨酸雙水解酶，陰性(16)O/F試驗(yàn)，氧化
3、碳源利用產(chǎn)酶微生物JS-02菌株的培養(yǎng)以單糖或雙糖作為碳源，如葡萄糖、山梨醇、蔗糖或乳糖。淀粉、醇類和有機(jī)酸利用情況不佳；作為氮源有機(jī)氮源為佳，效果最好的是玉米漿和酵母膏；Co2+對(duì)產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用。JS-02菌株所產(chǎn)的酶是誘導(dǎo)酶，發(fā)酵過(guò)程必須加0.1-0.5％的N-氨甲酰苯丙氨酸作為誘導(dǎo)劑；該菌是好氧培養(yǎng)菌，在pH5-9溫度25-40℃的通氣條件下，生長(zhǎng)良好。
在發(fā)酵時(shí)使用液體培養(yǎng)，一般發(fā)酵周期在20-30小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體作為酶法合成的催化劑。
在酶法反應(yīng)過(guò)程中，DL-5取代海因在酶的作用下不對(duì)稱水解，其中僅有D型的5取代基海因能發(fā)生水解反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生D-a-氨基酸。L-型的5取代基海因在反應(yīng)條件下能自動(dòng)消旋促進(jìn)了水解反應(yīng)的進(jìn)程，形成了水解、消旋、再水解的反應(yīng)序列，直至反應(yīng)底物被完全水解為止。同時(shí)在反應(yīng)過(guò)程中為防止氧對(duì)酶的抑制作用，在反應(yīng)過(guò)程中通入氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)；酶反應(yīng)過(guò)程中，DL-5取代海因的起始濃度為2-5％，pH7-10；反應(yīng)溫度25-40℃；反應(yīng)時(shí)間為20-75小時(shí)。
反應(yīng)結(jié)束后，離心去除菌體和雜質(zhì)，然后在減壓條件下55-60℃濃縮結(jié)晶得到D-氨基酸粗品，重結(jié)晶得到氨基酸精品。
這種制備方法工藝簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)品比旋度高，并具有良好的通用性。
將冰箱內(nèi)保存的菌種，取出后，接在新鮮斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，接入上述制好的液體培養(yǎng)基中，32℃180轉(zhuǎn)/分搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，5000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)離心25分鐘，收集菌體，制成菌懸液(每100ml菌懸液含濕菌體40克左右)。
取DL-5-芐基海因3.0g裝入準(zhǔn)備好的500ml三角瓶中，并分別加入無(wú)離子水100ml，調(diào)PH9.0，然后在每個(gè)三角瓶中加入菌懸液10ml。用氮?dú)鈱⑷瞧靠臻g內(nèi)的氧氣置換后加膠塞塞緊后，在搖床上震蕩反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間分別為48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后在4000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)上離心30分鐘，去除菌體和雜質(zhì)，真空減壓55-60℃濃縮。經(jīng)酒精洗滌后，過(guò)濾結(jié)晶烘干后得D-苯丙氨酸2.21g，純度為97.8％；
取DL-5-吲哚甲基海因4.0g裝入準(zhǔn)備好的500ml三角瓶中，并分別加入無(wú)離子水100ml，調(diào)PH9.0，然后在每個(gè)三角瓶中加入菌懸液10ml。用氮?dú)鈱⑷瞧靠臻g內(nèi)的氧氣置換后加膠塞塞緊后，在搖床上震蕩反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間分別為42小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后在4000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)上離心30分鐘，去除菌體和雜質(zhì)，真空減壓55-60℃濃縮。經(jīng)酒精洗滌后，過(guò)濾結(jié)晶烘干后得D-色氨酸2.71g，純度為95.8％；
取DL-5-甲硫乙基海因3.0g裝入準(zhǔn)備好的500ml三角瓶中，并分別加入無(wú)離子水100ml，調(diào)PH9.0然后在每個(gè)三角瓶中加入菌懸液10ml。用氮?dú)鈱⑷瞧靠臻g內(nèi)的氧氣置換后加膠塞塞緊后，在搖床上震蕩反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間分別為36小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后在4000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)上離心25分鐘，去除菌體和雜質(zhì)，真空減壓55-60℃濃縮。經(jīng)酒精洗滌后，過(guò)濾收集結(jié)晶烘干后得D-蛋氨酸2.42g，純度為97.7％
培養(yǎng)基組成及消毒條件同實(shí)例一。菌種培養(yǎng)18小時(shí)后接入制好的液體培養(yǎng)基中，32℃180轉(zhuǎn)/分搖床振蕩培養(yǎng)30小時(shí)后，5000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)離心25分鐘，收集菌體，制成菌懸液(每100ml菌懸液含濕菌體40克左右)。
取DL-5-異丙基海因海因3.0g分別裝入準(zhǔn)備好的500ml三角瓶中，并分別加入無(wú)離子水100ml，調(diào)PH9.0后在每個(gè)三角瓶中加入菌懸液10ml。用氮?dú)鈱⑷瞧靠臻g內(nèi)的氧氣置換后加膠塞塞緊后，在搖床上震蕩反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間分別為72小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后在4000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)上離心25分鐘，去除菌體和雜質(zhì)，真空減壓55-60℃濃縮。經(jīng)酒精洗滌后，過(guò)濾收集結(jié)晶烘干后得D-纈氨酸1.86g，純度為96.5％
權(quán)利要求
1.洋蔥伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號(hào)是CCTCC NO.M202047。
2.一種洋蔥伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02的培養(yǎng)方法，其特征是洋蔥伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，以單糖或雙糖作為碳源，有機(jī)氮源為氮源，添加誘導(dǎo)劑N-氨甲酰苯丙氨酸和生長(zhǎng)促進(jìn)劑金屬離子Co2+。
3.一種利用洋蔥伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02制備系列D-a-氨基酸的方法，其特征是利用洋蔥伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS-02，通過(guò)微生物所產(chǎn)酶的催化作用，將系列DL-5取代海因化合物直接轉(zhuǎn)化為D-a-氨基酸類物質(zhì)，其中，DL-5取代海因化合物作為反應(yīng)底物，其濃度在2-5％；反應(yīng)在水溶液內(nèi)進(jìn)行；反應(yīng)在充氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下進(jìn)行。
全文摘要
D－a－氨基酸是一類具有光學(xué)活性的化合物，在醫(yī)藥、食品和農(nóng)藥領(lǐng)域有廣泛的用途。本發(fā)明采用由土壤篩選的洋蔥伯克霍氏德氏菌(Burkholderia cepecia)JS－02，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號(hào)是CCTCC NO.M202047為拆分催化劑，一步把系列5－取代海因轉(zhuǎn)化成系列D－a－氨基酸。利用該方法制備D－苯丙氨酸，底物濃度可達(dá)5％，收率可達(dá)80％；制備D－色氨酸收率也在74.8％左右，底物濃度可達(dá)3.0％；制備D－纈氨酸收率也在72.8％左右，底物濃度可達(dá)3.0％；制備D－蛋氨酸收率也在85.2％左右，底物濃度可達(dá)3.0％。
文檔編號(hào)C12P13/04GK1431295SQ0215174
公開日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者韋萍, 周華, 于榮華, 李環(huán), 萬(wàn)紅貴, 胡永紅, 歐陽(yáng)平凱 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)