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脫水素基因BcDh2及其啟動(dòng)子在培育耐旱植物中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):399801閱讀:258來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:脫水素基因BcDh2及其啟動(dòng)子在培育耐旱植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明克隆了厚葉懸蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)一個(gè)新的402bp長(zhǎng)的脫水素基因及該基因5’端調(diào)控序列1084bp。為脫水素家族YSK2類型成員,命名為BcDh2,其啟動(dòng)子命名為BcDh2P。此基因受干旱和寒冷誘導(dǎo)表達(dá),其編碼蛋白脫水素在植物干旱情況下與細(xì)胞內(nèi)一些糖醇類小分子協(xié)同作用,保護(hù)細(xì)胞膜和生物大分子,從而幫助植物細(xì)胞抵抗干旱脅迫,提高植物的耐旱性。這個(gè)基因的5’端調(diào)控序列含有干旱、寒冷、熱激及ABA反應(yīng)等元件,可以用作逆境脅迫誘導(dǎo)的基因調(diào)控元件,用于抗逆性基因工程育種。我們構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍的方法將此耐旱基因?qū)敫黝愔参镏?,提高了植物的耐旱耐寒性?br> 脫水素是一種廣泛存在于高等植物的干旱、寒冷誘導(dǎo)蛋白。我們根據(jù)已知的植物脫水素基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,采用DDRT-PCR方法從厚葉旋蒴苣苔總RNA中擴(kuò)增出一個(gè)300bp與植物脫水素基因同源的序列。利用5’RACE技術(shù)獲得了植物脫水素基因家族的一個(gè)新成員BcDh2的全長(zhǎng)cDNA(402bp),并對(duì)該基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。Southem雜交分析表明BcDh2基因在厚葉旋蒴苣苔基因組中以單拷貝形式存在。Northern雜交結(jié)果表明,該基因的表達(dá)受干旱、寒冷及ABA的誘導(dǎo)。將BcDh2基因置于CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下,通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌LBA4404,再利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草得到了轉(zhuǎn)基因煙草植株。將BcDh2基因置于Ubiquitin啟動(dòng)子調(diào)控下,通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化草坪草和牧草,得到轉(zhuǎn)基因植株,并初步表現(xiàn)耐旱耐寒性能提高。通過(guò)連接介導(dǎo)PCR的方法,克隆到BcDh2基因上游的一段1084bp的序列BcDh2P,將它連接到含有GUS報(bào)告基因的中間表達(dá)載體pCAMBIA1350中,對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草中GUS表達(dá)的分析表明,BcDh2P該能對(duì)ABA、干旱和寒冷做出反應(yīng)。
本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之點(diǎn)在于(1)首次從厚葉懸蒴苣苔中克隆了一個(gè)脫水素基因BcDh2;(2)首次從厚葉懸蒴苣苔中克隆了脫水素基因BcDh2的5’端調(diào)控區(qū)BcDh2P;(3)構(gòu)建了BcDh2基因的適合于雙子葉和單子葉植物的表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍的途徑使植物表達(dá)該基因的編碼蛋白,從而提高這些物種的耐旱耐寒性能。
本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之一是從厚葉懸蒴苣苔中克隆BcDh2基因。根據(jù)脫水素類基因富含賴氨酸的保守區(qū)EKKGIMD(E)KIKEKLPG設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,用GSP1和mRNA 3’端的錨定引物43218 5’GCG GCC GCT(18)3’。采用TRIzol試劑從干旱脅迫處理后的厚葉旋蒴苣苔提取葉片總RNA,加DNaseI消化去除殘存DNA,用引物43128逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后用引物GSP1和43128進(jìn)行PCR反應(yīng)。樣品經(jīng)94℃預(yù)變性5min,然后按照下列參數(shù)進(jìn)行PCR94℃30s,53℃30s,72℃20s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,純化回收特異片段,連入pGEM-T Easy載體,用ABI377自動(dòng)分析儀進(jìn)行序列分析。為了通過(guò)5’RACE的方法獲得BcDh2基因的5’端,參照文獻(xiàn)(Kimura Y et al,1996)合成上游引物(46121)5’GGC CCG ACGTCG CAT G 3’和錨定引物(46122)5’GGC CCG ACG TCG CAT GAA TTC(12)3’,基因特異引物(GSP2)5’TTG GAT TCT CAG TGG CAT GC 3’和(43514)5’TAC ACT TCC TCG GTC TTC TTG 3’。采用TRIzol試劑從干旱脅迫處理后的厚葉旋蒴苣苔提取葉片總RNA,加DNaseI消化去除殘存DNA,用引物GSP1逆轉(zhuǎn)錄合成總cDNA第一鏈,玻璃奶純化后用磷酸轉(zhuǎn)移酶將polyA加到cDNA鏈的5’末端,接著以加尾的cDNA鏈為模板PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,純化回收特異片段,連入pGEM-T Easy載體,用ABI377自動(dòng)分析儀進(jìn)行序列分析。
本項(xiàng)發(fā)明的要點(diǎn)之二是BcDh2基因的5’端調(diào)控區(qū)BcDh2P啟動(dòng)子的克隆。厚葉旋蒴苣苔總DNA分別用BamH I、Bgl II、Bcl I、Xho I和Sal I酶切,連上相應(yīng)的接頭,兩輪PCR后只有經(jīng)過(guò)Xho I處理的厚葉旋蒴苣苔總DNA能擴(kuò)增出特異片斷,將該片段瓊脂糖凝膠電泳回收連接到pGEM-T Easy載體上,篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。染色體步行法得到的BcDh2基因上游調(diào)控區(qū)長(zhǎng)為1084bp。將該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因構(gòu)建植物表達(dá)載體,通過(guò)干旱、寒冷及ABA誘導(dǎo)等不同處理,檢測(cè)GUS基因的活性,發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子能受干旱、寒冷及ABA的誘導(dǎo)。
本項(xiàng)發(fā)明的要點(diǎn)之三是植物表達(dá)載體pBI121BcDh2和pAHC-BcDh2的構(gòu)建。將連接在pGEM-T Easy載體上的BcDh2基因編碼區(qū)用Nco I和Sac I切下來(lái),連接到用Nco I和Sac I處理過(guò)的原核表達(dá)載體pET-30a上,構(gòu)建表達(dá)BcDh2蛋白的質(zhì)粒pET-30aBcDh2,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α菌株,篩選正確的克隆。用Bgl II和Sac I消化質(zhì)粒p30aBcDh2,回收BcDh2片段,將它連接到用BamH I和Sac I消化過(guò)的質(zhì)粒pBI121中,形成pBI121BcDh2,將它連接到用BamH I和Sac I消化過(guò)的質(zhì)粒pAHC25中形成pAHC-BcDh2。植物表達(dá)載體構(gòu)建流程見(jiàn)

圖1植物表達(dá)載體pAHC-BcDh2的構(gòu)建流程。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,BcDh2基因置于CaMV35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下,以NPTII基因?yàn)闃?biāo)記基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121BcDh2。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,得到含有此質(zhì)粒的農(nóng)桿菌,并侵染煙草葉子,共培養(yǎng)兩天,轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基,2周后傷口處有愈傷組織形成,4周左右陸續(xù)從愈傷組織分化出小苗,苗長(zhǎng)至2cm左右時(shí),將小苗切下移入含抗生素的生根培養(yǎng)基中生根。在生長(zhǎng)初期,提取煙草葉片總DNA,利用PCR擴(kuò)增BcDh2基因的特異片段,得到陽(yáng)性植株。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,BcDh2基因置于Ubiquitin啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下,以bar基因?yàn)闃?biāo)記基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體pAHC-BcDh2。pAHC-BcDh2質(zhì)粒大量提取后,用于基因槍轉(zhuǎn)化草坪草、牧草等單子葉植物。轉(zhuǎn)化過(guò)程包括種子或幼穗誘導(dǎo)愈傷組織、基因槍轟擊、抗性愈傷篩選、苗的分化、植株鑒定。種子誘導(dǎo)愈傷的步驟成熟種子用0.1%升汞消毒后,先接于MS基本培養(yǎng)基上,讓其萌動(dòng)3天,露出小芽時(shí),將胚縱切后轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上,形成愈傷(約30天左右)后,每次挑選色澤鮮、增殖快、質(zhì)地硬的愈傷組織繼代培養(yǎng),繼代愈傷可供基因槍轉(zhuǎn)化;幼穗誘導(dǎo)愈傷的步驟取長(zhǎng)約0.2~1cm左右的幼穗,用70%乙醇表面消毒后,在超凈臺(tái)內(nèi)剝出幼穗,接種于誘導(dǎo)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,形成愈傷后,每20天繼代培養(yǎng)一次,供基因槍轉(zhuǎn)化;基因槍的轉(zhuǎn)化及苗的分化質(zhì)粒提取的質(zhì)粒濃度調(diào)整為1μg/μL。子彈配制30mg金粉或鎢粉加1mL 100%乙醇旋渦洗滌15分鐘,無(wú)菌水洗3次,加500μL 50%甘油備用。取上述鎢或金粉懸液50μL,加5μL DNA,加50μL 2.5M CaCl2,加20μL 0.1M亞精胺,旋渦,冰上靜置15分鐘,離心數(shù)秒,70%乙醇142μL洗一次,離心數(shù)秒,100% 140μL乙醇洗一次,離心數(shù)秒,加50μL 100%乙醇,供5槍用。供試基因槍PDS-1000/He(美國(guó)伯樂(lè)公司)基因槍可裂膜用1350Psi可裂膜,真空度25InHg,6cm射擊距離,每皿射擊一槍。槍擊前的愈傷組織在含0.4M甘露醇的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4~8小時(shí),槍擊16小時(shí)后移入正常繼代培養(yǎng)基。槍擊后的愈傷組織一周后轉(zhuǎn)至含除草劑2-5mg/L的繼代篩選2~4輪,每輪20天。篩選后得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含50g糖的培養(yǎng)基中,光照培養(yǎng)20天,然后轉(zhuǎn)入去掉2,4-D的分化培養(yǎng)基中分化成苗。當(dāng)小苗長(zhǎng)到4-5片葉時(shí),取少量葉片提取植物總DNA,進(jìn)行PCR檢測(cè)。小苗長(zhǎng)至5~10cm大小時(shí),移入蛭石∶松針土為1∶1的土中,塑料袋保溫一周后,苗即成活。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,BcDh2基因置于BcDh2P啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下,以bar基因?yàn)闃?biāo)記基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體pAHCP-BcDh2。pAHCP-BcDh2質(zhì)粒大量提取后,用于基因槍轉(zhuǎn)化草坪草、牧草等單子葉植物。轉(zhuǎn)化過(guò)程、抗性植株篩選及PCR檢測(cè)方法同上。
此專利涉及的菌種已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏,單位地址中國(guó)北京中關(guān)村,該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(Ecoli.),保藏代號(hào)為pT-BcDh2,保藏編號(hào)為CGMCC NO.0838,保藏日期為2002年11月22日。
權(quán)利要求
1.厚葉懸蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)一個(gè)402bp長(zhǎng)的脫水素基因(BcDh2)及該基因5’端調(diào)控序列1084bp(BcDh2P)。該基因及其5’端調(diào)控序列的全長(zhǎng)和部分序列均在權(quán)利要求之內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1。使用此基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體,啟動(dòng)子為BcDh2P、Ubiquitin、actin、CaMV35S或其它植物啟動(dòng)子,在本專利權(quán)利要求之內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1。使用此基因啟動(dòng)子BcDh2P全部或部分序列驅(qū)動(dòng)目的基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體,目的基因?yàn)槟秃怠⒛秃?、耐鹽堿等抗逆性相關(guān)基因,在本專利權(quán)利要求之內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1。使用此基因或其啟動(dòng)子構(gòu)建的植物表達(dá)載體,標(biāo)記基因?yàn)閎ar、hptII、NPT II等植物常用標(biāo)記基因,在本專利權(quán)利要求之內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1。將此基因作適當(dāng)突變或偏愛(ài)密碼子改造后的基因,亦在本專利權(quán)利要求之內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1。將此基因或其啟動(dòng)子構(gòu)建的植物表達(dá)載體通過(guò)基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化得到耐旱耐寒植株的方法,亦在本專利權(quán)要求之內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明克隆了厚葉懸蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)一個(gè)新的402bp長(zhǎng)的脫水素基因及該基因5’端調(diào)控序列1084bp。該基因?yàn)槊撍丶易錣SK2類型成員,命名為BcDh2。此基因受干旱和寒冷誘導(dǎo)表達(dá),其編碼蛋白脫水素在植物干旱情況下與細(xì)胞內(nèi)一些糖醇類小分子協(xié)同作用,保護(hù)細(xì)胞膜和生物大分子,從而幫助植物細(xì)胞抵抗干旱脅迫,提高植物的耐旱性。這個(gè)基因的5’端調(diào)控序列含有干旱、寒冷、熱激及ABA反應(yīng)等元件,命名為BcDh2P,可以用作逆境脅迫誘導(dǎo)的基因調(diào)控元件,用于抗逆性基因工程育種。我們構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍的方法將此耐旱基因?qū)敫黝愔参镏?,提高了植物的耐旱耐寒性?br> 文檔編號(hào)C12N15/82GK1417337SQ0215327
公開(kāi)日2003年5月14日 申請(qǐng)日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者林忠平, 申業(yè), 胡鳶雷, 倪挺 申請(qǐng)人:林忠平
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