專利名稱：親和反應(yīng)的化學(xué)放大電化學(xué)檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電化學(xué)領(lǐng)域中一種檢測分析物的方法和試劑盒，特別是涉及親和反應(yīng)的化學(xué)放大電化學(xué)檢測方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
長時(shí)間以來，為了使分析的靈敏度更高、成本更低和再現(xiàn)性更好，人們一直在努力改進(jìn)已有的分析方法，并致力于新分析方法的開發(fā)。一般，對于基于親和力的生物檢測，是將標(biāo)記物(信號產(chǎn)生分子)附著在生物分子上，該生物分子通過獨(dú)特的生物識別過程結(jié)合到其互補(bǔ)物質(zhì)上。識別反應(yīng)類型包括DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗體、配體-受體等。通過測量以光、電、質(zhì)量、聲音等形式從標(biāo)記物上發(fā)出的信號來檢測結(jié)合反應(yīng)，有時(shí)也可以對其進(jìn)行定量檢測。
在早期生物檢測中，放射性同位素被用作標(biāo)記物。它們提供了足夠的靈敏度，但保存時(shí)間太短，而且對人類健康有害。隨后它們被酶標(biāo)記物和基于吸附的檢測方法(如ELISA)所取代。酶標(biāo)記物安全，但長期保存不穩(wěn)定，且靈敏度也有限。接著出現(xiàn)的是有機(jī)和無機(jī)熒光分子，它們都安全又穩(wěn)定。盡管它們提供了比ELISA更高的靈敏度，但它們?nèi)匀徊荒芘c放射性同位素相媲美。由于復(fù)雜且昂貴的激光激發(fā)源和光學(xué)檢測器件，設(shè)備成本也是一個(gè)主要劣勢。最近，化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光正在成為臨床診斷實(shí)驗(yàn)室中所選擇的檢測方法，這要?dú)w因于它們的超高靈敏度(由于背景非常低)和穩(wěn)定的反應(yīng)物。然而，由于該方法仍然使用了光學(xué)檢測，所以設(shè)備成本仍然相對較高。
與光學(xué)檢測并行，在這條研究道路上，電化學(xué)也已經(jīng)被用于化學(xué)和生物分析。由于其設(shè)備成本低且簡單，電化學(xué)檢測在成本和可攜帶性等主要問題方面已經(jīng)相當(dāng)成功。實(shí)例包括離子選擇電極、手持葡萄糖測量儀和其它血液分析儀器。然而，親和反應(yīng)的電化學(xué)檢測卻沒有如此成功，如抗體和抗原之間的檢測。這主要是由于在常規(guī)電化學(xué)檢測中存在這樣一個(gè)事實(shí)，即用于親和反應(yīng)的標(biāo)記物僅供出或接受一個(gè)作為被檢測信號的電子。這一事實(shí)以及來自雙電層的背景電流嚴(yán)重限制了其靈敏度。
將化學(xué)放大作為增強(qiáng)電化學(xué)信號的方法以前已被提出。為了實(shí)施該策略，將一種化學(xué)試劑加入電解液，被檢測信號仍然是親和反應(yīng)標(biāo)記分子的電化學(xué)電流。在反應(yīng)程序中，首先是標(biāo)記物被電極氧化。接著是氧化標(biāo)記物和化學(xué)試劑之間在溶液中的氧化還原化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)將標(biāo)記物還原到其最初的氧化還原態(tài)。再生標(biāo)記物可以再次參與第一個(gè)步驟?？傂?yīng)是同一標(biāo)記分子的循環(huán)使用和電化學(xué)反應(yīng)的重復(fù)進(jìn)行。由于從同一標(biāo)記物中提取了不止一個(gè)電子，這導(dǎo)致了信號放大。其過程為(1)電極反應(yīng)標(biāo)記物(還原態(tài))-→標(biāo)記物(氧化態(tài))(2)化學(xué)再生標(biāo)記物(氧化態(tài))+還原劑-→標(biāo)記物(還原態(tài))(3)重復(fù)(1)盡管化學(xué)放大是在數(shù)年前就提出的，但還沒有取得很大的成功?？偟膩碚f，主要原因是，用于放大的化學(xué)試劑可以在電極直接氧化，從而產(chǎn)生高背景電流。因此需要使放大效應(yīng)最大化，同時(shí)使來自化學(xué)試劑的背景最小化。
典型地，親和反應(yīng)是在叫做標(biāo)記物的產(chǎn)生信號的分子的幫助下被檢測的，其中標(biāo)記物是與親和對之一結(jié)合的。正如上邊所描述的，產(chǎn)生顏色、熒光、化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光的多種分子已經(jīng)被用作標(biāo)記物。
理論上來說，由于許多生物分子的一些成分具有氧化還原活性，所以它們可以在不使用標(biāo)記物的情況下直接用電化學(xué)方法來檢測。例如，在DNA中，對標(biāo)準(zhǔn)氫電極而言，鳥嘌呤的氧化還原電勢是1.3V，該電勢可以容易地在許多電極上測出。其它堿基具有更高的氧化還原電勢。DNA的糖結(jié)構(gòu)也是可氧化的。在蛋白質(zhì)中，酪氨酸的氧化還原電勢是0.82-0.95V，色氨酸是0.82-1.07V，組氨酸是1.32-1.62V。然而，這些氧化反應(yīng)過程很慢，以致于它們對于檢測沒有實(shí)用價(jià)值。
在美國專利5,871,918中，Thorp等人描述了一個(gè)用鳥嘌呤堿基的間接電化學(xué)氧化來分析DNA的方法。在該方法中，靶DNA與固定在電極表面的探針雜交。將過渡金屬絡(luò)合物如三聯(lián)吡啶合釕溶解在溶液中，并用來促進(jìn)靶DNA中的鳥嘌呤堿基的電化學(xué)氧化。絡(luò)合物首先被電化學(xué)氧化，然后通過與鳥嘌呤的化學(xué)反應(yīng)被還原。被還原的絡(luò)合物可以再次在電極上被氧化。該方法的缺點(diǎn)是絡(luò)合物在不存在任何DNA的情況下也會(huì)產(chǎn)生氧化電流，從而產(chǎn)生背景信號。另外，由于DNA中鳥嘌呤堿基的數(shù)量很少，所以放大效果不高。在美國專利6,346,387中，Thorp等人又提出了一個(gè)類似的用于蛋白質(zhì)分析的方法。
正如上邊所提到的，電化學(xué)標(biāo)記物可以被用來分析親和反應(yīng)。在美國專利5,312,527中，Mikkelsen等人用三聯(lián)吡啶合鈷通過非共價(jià)結(jié)合來標(biāo)記DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)行電化學(xué)檢測。DNA雙鏈結(jié)構(gòu)被雜交在玻碳電極上。將少量的鈷絡(luò)合物加入電解液。它通過插入結(jié)合到雙鏈結(jié)構(gòu)上，但不結(jié)合到單鏈上。在不存在靶DNA的情況下，該絡(luò)合物在低濃度下均勻地分布在溶液中，從而產(chǎn)生一些背景電流。當(dāng)靶DNA被引入而且與固定在電極上的探針雜交時(shí)，絡(luò)合物就會(huì)插入雙鏈結(jié)構(gòu)。絡(luò)合物在電極表面的積聚所產(chǎn)生的電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于溶液中的絡(luò)合物所產(chǎn)生的電流。這就可以作為雙鏈結(jié)構(gòu)形成的標(biāo)志。該方法與Thorp的方法有相同的缺點(diǎn)，即未結(jié)合的金屬絡(luò)合物會(huì)產(chǎn)生高背景電流。
按照標(biāo)記DNA的傳統(tǒng)方法，Meade等人在美國專利6,277,576中公開了一個(gè)將電化學(xué)標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合到DNA的糖結(jié)構(gòu)上的合成方法。二茂鐵，一種典型的具有快速電極動(dòng)力學(xué)的電化學(xué)化合物，被用作標(biāo)記物。DNA探針通過導(dǎo)電硫醇分子被固定在金電極上。用絕緣層覆蓋電極表面的其它區(qū)域。在標(biāo)記的DNA與探針雜交之后，檢測二茂鐵的電化學(xué)電流，同時(shí)絕緣層將背景電流保持在最小。但是該公開的方法中沒有放大機(jī)制。
酶在許多場合已經(jīng)被用作DNA和免疫反應(yīng)的標(biāo)記物。由于一個(gè)酶分子能催化數(shù)千個(gè)或更多個(gè)底物分子，所以存在一個(gè)內(nèi)在的放大機(jī)制。實(shí)例包括那些在WilliamHeineman，et al.Anal.Chem.1996，68，2453；I.Willner et al.Anal.Chem，1996，68，3151；Adam Heller，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，769中所公開的內(nèi)容。但酶分子的大尺寸和不穩(wěn)定性已經(jīng)限制了它們的應(yīng)用。
美國專利6,221,586使用了一個(gè)用具有電化學(xué)活性的DNA插入物作為標(biāo)記物的方法，并且公開了以溶解的鐵氰化物作為被氧化的插入物的還原劑。由于很難抑制所使用的鐵氰化物在金電極上的直接氧化電流，所以高背靜是一個(gè)主要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效、靈敏的化學(xué)放大電化學(xué)檢測方法。
化學(xué)放大電化學(xué)檢測方法，包括以下步驟1)提供能在氧化電極上與被分析的目的分析物結(jié)合和/或反應(yīng)的反應(yīng)物。
2)將可能含有目的分析物的樣品與步驟1)中所提供的所述反應(yīng)物接觸。在合適條件下，所述分析物與所述反應(yīng)物結(jié)合。所述反應(yīng)物、分析物或者額外反應(yīng)物或額外分析物或分析物類似物與處于還原態(tài)的電化學(xué)活性標(biāo)記分子以共價(jià)鍵連接。標(biāo)記分子在電極上被氧化。
3)用不能在電極上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的還原劑將所述親和物的電化學(xué)活性分子還原到還原態(tài)；4)所述被還原的電化學(xué)活性分子重復(fù)參與步驟2)和3)的所述氧化-還原反應(yīng)，產(chǎn)生放大的電化學(xué)信號；5)評價(jià)放大的電化學(xué)信號，確定目的分析物在樣品中的存在和/或目的分析物的量。
所述“電化學(xué)活性分子”指當(dāng)給電極施加適當(dāng)?shù)碾妷簳r(shí)，可以給電極輸送電子或接受來自電極的電子的分子。
步驟2)中，將可能含有目的分析物的樣品與步驟1)中所提供的所述反應(yīng)物接觸，使得如果樣品中存在分析物，允許其與反應(yīng)物結(jié)合，其中反應(yīng)物、分析物或者額外反應(yīng)物或額外分析物或分析物類似物以共價(jià)鍵連接到還原態(tài)電化學(xué)活性分子上，并且使電化學(xué)活性分子與電極密切靠近，以使電化學(xué)活性分子被電極氧化。
所述步驟2)中所述電化學(xué)活性分子是在電極上被氧化；在夾心法中，反應(yīng)物、分析物及電化學(xué)活性分子標(biāo)記的額外反應(yīng)物形成三元親和物，使得電化學(xué)活性分子與電極密切靠近；在競爭法中，反應(yīng)物與電化學(xué)活性分子標(biāo)記的分析物形成二元親和物，使得電化學(xué)活性分子與電極密切靠近；在直接檢測中，反應(yīng)物和被電化學(xué)活性分子標(biāo)記的分析物形成二元親和物，使得電化學(xué)活性分子與電極密切靠近。
所述分析物可以選自細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、分子及其集合物或復(fù)合物。所述細(xì)胞選自動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、重組細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞；所述細(xì)胞器選自細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、分泌小泡、液泡或微粒體所述分子選自無機(jī)分子、有機(jī)分子及其復(fù)合物。所述有機(jī)分子選自氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、碳水化合物、脂類及其復(fù)合物。
所述分析物還可以選自激素、癌標(biāo)記物、類固醇、固醇、藥物化合物、藥物化合物的代謝物及其復(fù)合物。
所述樣品可以是哺乳動(dòng)物樣品、體液樣品或臨床樣品。所述哺乳動(dòng)物選自?？苿?dòng)物、山羊、綿羊、馬科動(dòng)物、野兔、豚鼠、鼠科動(dòng)物、人類、貓科動(dòng)物、猴子、狗或豬；所述臨床樣品是血清、血漿、全血、痰、腦脊液、羊水、尿、胃腸內(nèi)容物、頭發(fā)、唾液、汗、齒齦刮取物、活體解剖組織。
所述反應(yīng)物是抗體或核酸。所述反應(yīng)物可以選自細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、分子及其集合物或復(fù)合物；所述細(xì)胞選自動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、重組細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞；所述細(xì)胞器選自細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、分泌小泡、液泡或微粒體所述分子選自無機(jī)分子、有機(jī)分子及其復(fù)合物；所述有機(jī)分子選自氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、碳水化合物、脂類及其復(fù)合物；所述分析物選自激素、癌標(biāo)記物、類固醇、固醇、藥物化合物、藥物化合物的代謝物及其復(fù)合物?！翱贵w”指免疫球蛋白的特定類型，即IgA、IgD、IgE、IgG如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgM?？贵w可以以任何合適的形式存在，而且可以含有任何合適的片斷或衍生物。代表性的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片斷、Fab’片斷、F(ab’)2片斷、Fv片斷、微型雙功能抗體、單鏈抗體和由抗體片斷形成的多專一性抗體?！昂怂帷敝溉魏魏邪ǖ幌抻贒NA、RNA或PNA分子的核酸。該術(shù)語包括序列，其中包括DNA和RNA的任何已知堿基類似物，包括但不限于4-乙?；拎?、8-羥基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞吡啶、假異胞吡啶、5-(羧基羥基甲基)尿吡啶、5-氟尿吡啶、5-溴尿吡啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲吡啶、5-羧基甲基氨基甲基尿吡啶、二氫尿吡啶、次黃嘌呤、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿吡啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞吡啶、5-甲基胞吡啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿吡啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫胞吡啶、5’-甲氧基羧基甲基尿吡啶、5-甲氧基尿吡啶、2-硫代甲基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿吡啶-5-含氧乙酸甲基酯、尿吡啶-5-含氧乙酸、假尿吡啶、2-硫胞吡啶、5-甲基-2-硫尿吡啶、2-硫尿吡啶、4-硫尿吡啶、5-甲基尿吡啶、N-尿吡啶-5-含氧乙酸甲基酯、尿吡啶-5-含氧乙酸、假尿吡啶、2-硫胞吡啶和2，6-二氨基嘌呤。
所述電化學(xué)活性分子是過渡金屬絡(luò)合物。所述過渡金屬選自鈷、鎳、鋨、鐵、錸、鉻和釕；所述過渡金屬絡(luò)合物選自二茂鐵、金屬卟啉、金屬聚吡啶、金屬聚菲咯啉和金屬酞氰染料。過渡金屬可以是金屬三(2，2’-聯(lián)吡啶)或其衍生物之一，較優(yōu)選的是釕三(2，2’-聯(lián)吡啶)或其衍生物之一。一般來說，電化學(xué)標(biāo)記物應(yīng)具有下述特征(1)它們可以與檢測中所使用的電極發(fā)生快速的電化學(xué)反應(yīng)；(2)分子的氧化態(tài)和還原態(tài)都是穩(wěn)定的；(3)它們具有可以被用來連接其它分子的官能基團(tuán)；(4)可以容易且便宜地合成和純化；(5)當(dāng)它們與其它分子連接時(shí)，親和反應(yīng)不會(huì)受到任何顯著有害的影響。合適的標(biāo)記物主要是過渡金屬絡(luò)合物，如二茂鐵、金屬卟啉、金屬聚吡啶、金屬聚菲咯啉和金屬酞氰染料。金屬聚吡啶是一種優(yōu)選的電化學(xué)標(biāo)記物。例如，相對于飽和的甘汞電極，金屬(2，2’-聯(lián)吡啶)的氧化還原電勢的變化范圍在0V和1.1V之間。
“電極”指導(dǎo)體或半導(dǎo)體電極，通過它們電流進(jìn)入或離開介質(zhì)。介質(zhì)可以是電解液、固體、熔融體、氣體或真空?！把趸镫姌O”指由金屬氧化物或非金屬氧化物組成的導(dǎo)體或半導(dǎo)體。
為了適合化學(xué)放大電化學(xué)檢測，電極必須能與標(biāo)記物發(fā)生快速的電子交換，但與還原劑的電化學(xué)反應(yīng)小到可以忽略。有很多氧化電極可以滿足該要求。根據(jù)電極如何被氧化，可以粗略地將其分成兩組。第一組電極通常是原子態(tài)，但在電化學(xué)測量中可以很容易地被氧化。換句話說，可以在現(xiàn)場形成氧化電極。一旦電壓被去除，氧化態(tài)就會(huì)不穩(wěn)定。這些電極包括金、鉑、銀、鈷、鎳、碳等。第二組包括金屬氧化物電極，它們是穩(wěn)定的氧化物。這些物質(zhì)包括氧化銦、氧化錫、氧化鈦、氧化鋯、氧化鎢等。它們可以是純金屬氧化物，或摻雜金屬氧化物，如摻錫的氧化銦(ITO)。其中優(yōu)選電極是金屬氧化物，如摻雜了金屬的或純的氧化銦、氧化錫、氧化鈦，最優(yōu)選的是摻錫的氧化銦或摻氟的氧化錫。各種形狀和大小的金屬氧化物電極可以用公知方法制備。
還原劑必須具有氧化還原活性，并且其氧化還原電勢低于標(biāo)記分子的氧化還原勢，以使它可以還原氧化的標(biāo)記物。而且，它自己的電化學(xué)電流必須被保持在最小以獲得最大的檢測靈敏度。另外，優(yōu)選地，試劑要具有在水溶液中的足夠可溶性，且具有很長的保存時(shí)間。通常，有機(jī)氧化還原分子在許多氧化電極上表現(xiàn)出很慢的電化學(xué)反應(yīng)。原因目前還不清楚，但一般的觀點(diǎn)是電化學(xué)反應(yīng)包括分子和金屬表面之間的化學(xué)鍵合。在被氧化的表面，不能形成這樣的鍵合，因此減緩了電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。代表性還原劑包括有機(jī)酸、有機(jī)堿、有機(jī)離子和有機(jī)兩性離子。這些還原劑可以分成下述幾種飽和烷基、不飽和烷基、芳族或雜環(huán)化合物。它們可以含有-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-SH等取代基。有機(jī)酸包括一元羧酸、二元羧酸和多元羧酸。優(yōu)選的有機(jī)酸是二元羧酸。最優(yōu)選的是草酸。有機(jī)堿包括單胺和多胺，胺可以是伯胺、仲胺或叔胺。優(yōu)選的有機(jī)堿是叔胺。最優(yōu)選的是三丙胺。而且，上述有機(jī)酸和有機(jī)堿的離子化形式也適合用于電化學(xué)信號的化學(xué)放大的還原劑。最優(yōu)選的是草酸鹽和質(zhì)子化三丙胺。一些有機(jī)兩性離子如氨基酸和生物緩沖分子既含有羧酸也含有胺。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們是合適的還原劑。優(yōu)選的有機(jī)兩性離子包括脯氨酸、PIPES和HEPES。
所述還原劑應(yīng)該是可以溶解在水溶液中的物質(zhì)。有機(jī)氧化還原分子可以選自有機(jī)酸、有機(jī)堿、有機(jī)離子和有機(jī)兩性離子。所述有機(jī)酸是羧酸或草酸；所述有機(jī)堿是胺、伯胺、仲胺、叔胺或三丙胺。有機(jī)氧化還原分子還可以選自離子化有機(jī)酸或離子化有機(jī)堿；離子化的有機(jī)酸優(yōu)選的是草酸鹽；離子化的有機(jī)堿優(yōu)選的是質(zhì)子化三丙胺。所述有機(jī)兩性離子優(yōu)選的有機(jī)堿和有機(jī)酸，其中較佳的配合是所述有機(jī)堿是胺，有機(jī)酸是羧酸或者有機(jī)堿是胺，有機(jī)酸是磺酸。所述有機(jī)兩性離子還可以是氨基酸，其中優(yōu)選的是脯氨酸。所述有機(jī)兩性離子也可以是“Good”緩沖液，其中優(yōu)選的是BES、BICINE、CAPS、HEPPS、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TAPS、TES和TRICINE?！癎ood”緩沖液指由Good等人于1996年(Good，N.E.et al.，Biochemistry，5467(1966))提出的緩沖液種類。它們是含有作為帶正電基團(tuán)的仲胺和叔胺，以及含有作為帶負(fù)電基團(tuán)的磺酸和羧酸的兩性離子緩沖液。代表性的“Good”緩沖液包括N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)(或N，N-雙(2-羥乙基)?；撬?、牛磺酸N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙磺酸(HEPPS)(或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(3-丙磺酸))、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)(或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸))、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)或其半鈉鹽或其一水化合物、4-嗎啉丙磺酸(MOPS)(或3-嗎啉丙磺酸)、哌嗪-1，4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)(或哌嗪-N，N’-雙(2-乙磺酸)或1，4-哌嗪二乙磺酸)、[(2-羥基-1，1-雙[羥甲基]乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)(或N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、2-[2-羥基-1，1-雙(羥甲基)乙氨基]乙磺酸(TES)(或不含TES的酸)，和N-[2-羥基-1，1-雙(羥甲基)乙基]甘氨酸(TRICINE)(或N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸)(通常參考Sigma-Aldrich產(chǎn)品目錄)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能夠較靈敏地進(jìn)行化學(xué)放大電化學(xué)檢測的試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明所提供的試劑盒包括1)能在氧化電極上與被分析的分析物結(jié)合和/或反應(yīng)的反應(yīng)物；2)一種與還原態(tài)電化學(xué)活性分子共價(jià)連接的額外的反應(yīng)物、分析物或分析物類似物；3)不能被所述電極直接氧化的一種還原劑；4)評價(jià)放大的電化學(xué)信號以確定分析物在樣品中的存在和/或量的裝置。
所述“還原劑不能被所述電極直接氧化”的意思是，盡管還原劑的標(biāo)準(zhǔn)電極電勢和施加于電極上的電壓之間的差別大到足以氧化還原劑，但氧化的速度非常低，以至于該反應(yīng)可以被忽略。
為了使試劑盒更加完善，所述試劑盒還包括能氧化電化學(xué)活性分子，但不能氧化還原劑的氧化物電極，以及操作說明書。
利用本發(fā)明的方法檢測分析物，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有靈敏度高，成本低的特點(diǎn)。其靈敏度相對于當(dāng)前常用的熒光方法沒有變化，但設(shè)備成本顯著降低。本發(fā)明的方法在酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、免疫印跡、免疫沉淀反應(yīng)、放射性免疫測定(RIA)、免疫染色、乳膠凝集素、間接紅血球凝聚(IHA)、補(bǔ)體結(jié)合、間接熒光免疫分析(IFA)、用懸液計(jì)測量懸液法、流體細(xì)胞分析、化學(xué)發(fā)光分析、橫向流體免疫測定分析、μ-捕獲分析、抑制分析、能量轉(zhuǎn)移分析、親和力分析、濁度免疫分析或時(shí)間分辯放大穴狀化合物發(fā)射(TRACE)分析中均將具有廣泛的應(yīng)用。


圖1為草酸鈉放大的三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕的循環(huán)伏安圖。
圖2為草酸鈉放大的三(2，2’-聯(lián)吡啶)金屬的電化學(xué)電流與氧化還原電勢的關(guān)系。
圖3為脯氨酸與不同濃度的三(2，2’-二吡啶)合釕的循環(huán)伏安圖。
圖4為脯氨酸放大電流與三(2，2’-二吡啶)合釕濃度的線性關(guān)系曲線。
圖5為不同濃度的釕(4，4’-二羧基)-雙(2，2’-聯(lián)吡啶)標(biāo)記的親和素與吸附在氧化銦錫電極上的生物素-BSA作用后產(chǎn)生的化學(xué)放大電化學(xué)電流。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、本發(fā)明的方法用于夾心免疫測定當(dāng)用于夾心免疫測定時(shí)，其步驟如下1、將抗體/抗原親和對(俘獲抗體)之一固定在電極上；2、測試樣品接觸電極，當(dāng)存在抗原時(shí)，抗原與固定的俘獲抗體結(jié)合；3、用有共價(jià)結(jié)合電化學(xué)標(biāo)記物的第二個(gè)抗體(標(biāo)記抗體)接觸電極，從而形成俘獲抗體/抗原/標(biāo)記抗體的三元復(fù)合物；4、將電極浸入含有還原劑的溶液中。測量標(biāo)記物的化學(xué)放大電化學(xué)電流，確定測試樣品中抗原的存在和/或存在量。
上述方法也適用于其它基于親和力的分析，如配體-受體、DNA-DNA、DNA-RNA、蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合對。分析物可以是自然存在物或化學(xué)合成物、生物化學(xué)品或生物分子，包括藥物、肽、蛋白質(zhì)、配體、受體、糖、維生素、激素、脂類、寡核苷酸、DNA、RNA、病毒和細(xì)胞。
實(shí)施例2、草酸鹽放大的釕三聯(lián)吡啶的電化學(xué)電流三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕是從Alfa Aesar購買的，草酸鈉是從Avocado購買的。制備含有10mM草酸鈉、0.5mM三-(聯(lián)吡啶)合釕、0.1M磷酸鈉的溶液，pH為5.5。電化學(xué)測量是在CHI 630A電化學(xué)分析儀上完成的。工作電極是涂敷在0.8cm2載玻片上的氧化銦錫薄膜。鉑箔被用作對電極，飽和甘汞作為參比電極。為了完成測量，電極電壓以100mV/s速率從0V掃描到1.3V，然后回到0V。記錄掃描過程的電流。將電流對電壓作圖，如圖1所示。曲線1是含有三聯(lián)吡啶合釕的溶液，曲線2是不含金屬絡(luò)合物的溶液。
實(shí)施例3、草酸鹽放大的各種金屬絡(luò)合物的電化學(xué)電流單羧酸二茂鐵是從Alfa Aesar購買的。鋨和鐵的三(2，2’-聯(lián)吡啶)絡(luò)合物是根據(jù)文獻(xiàn)合成的(C.Creulz，et al.，J.Am.Chem.Soc.，1980，102，1309)。制備含有10mM草酸鈉、0.5mM金屬絡(luò)合物、0.1M磷酸鈉的溶液，pH為5.5。按實(shí)施例2的描述進(jìn)行電化學(xué)測量。結(jié)果如圖2所示，金屬絡(luò)合物的放大電流是其標(biāo)準(zhǔn)電勢的函數(shù)。從圖中可以看出，具有最大氧化標(biāo)準(zhǔn)電勢的三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕產(chǎn)生了最大的電流。
實(shí)施例4、各種還原劑放大的三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕的電化學(xué)電流還原劑選用哌嗪-1，4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)(購自ICN)、三丙胺(購自AlfaAesar)、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)(購自Avocado)、脯氨酸(購自AlfaAesar)、三丁胺和三乙胺。
制備含有10mM溶解在0.1M磷酸鈉中的還原劑的溶液。在還原劑的電化學(xué)測量得到背景電流后，加入三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕，使終濃度為0.5mM。用與測量背景電流相同的方式測量放大電流。放大系數(shù)是先用各個(gè)電壓下的放大電流除以背景電流，再選擇最大值而獲得的。各種還原劑的放大系數(shù)如表1所示，從表1的數(shù)據(jù)可以看出，草酸鹽具有最大的放大系數(shù)。
表1各種還原劑的放大系數(shù)(除非另外說明，所用pH為7.5)

實(shí)施例5、不同濃度三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕條件下脯氨酸的放大電流制備含有10mM脯氨酸、0.1M磷酸鈉的溶液，pH為7.5。在還原劑的電化學(xué)測量得到背景電流后，加入三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕，使終濃度分別為125uM、250uM、375uM和500uM。對每一種絡(luò)合物濃度，測量脯氨酸放大的電流(結(jié)果如圖3所示)。結(jié)果顯示電流與釕濃度成線性關(guān)系(如圖4所示)。
實(shí)施例6、用本發(fā)明化學(xué)放大電化學(xué)方法檢測生物素-親和素的結(jié)合在室溫下，將氧化銦錫電極浸入1mg/mL生物素標(biāo)記的牛血清蛋白(生物素-BSA)溶液中1小時(shí)，使生物素-BSA被吸附到氧化銦錫電極上。用磷酸鹽緩沖液沖洗后，在室溫下將電極浸入用(4，4’-二羧基)-雙(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕標(biāo)記的親和素溶液中1小時(shí)。用磷酸鹽緩沖液再次沖洗電極。然后將其放入pH為5.5，含有10mM溶解在0.1M磷酸中的草酸鈉溶液的電化學(xué)池中。如實(shí)施例2所述測量電化學(xué)電流。結(jié)果如圖5所示，表明電流是親和素濃度的函數(shù)。
權(quán)利要求
1.化學(xué)放大電化學(xué)檢測方法，包括以下步驟1)提供能在氧化電極上與被分析的目的分析物結(jié)合和/或反應(yīng)的反應(yīng)物；2)將可能含有目的分析物的樣品與步驟1)中所提供的所述反應(yīng)物接觸3)將可能含有目的分析物的樣品與步驟1)中所提供的所述反應(yīng)物接觸。在合適條件下，所述分析物與所述反應(yīng)物結(jié)合。所述反應(yīng)物、分析物或者額外反應(yīng)物或額外分析物或分析物類似物與處于還原態(tài)的電化學(xué)活性標(biāo)記分子共價(jià)鍵連接。標(biāo)記分子在電極上被氧化；4)用不能在電極上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的還原劑將所述親和物的電化學(xué)活性分子還原到還原態(tài)；5)所述被還原的電化學(xué)活性分子重復(fù)參與步驟3)和4)的所述氧化-還原反應(yīng)，產(chǎn)生放大的電化學(xué)信號；6)評價(jià)放大的電化學(xué)信號，確定目的分析物在樣品中的存在和/或目的分析物的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)中所述電化學(xué)活性分子是在電極上被氧化；在夾心法中，反應(yīng)物、分析物及電化學(xué)活性分子標(biāo)記的額外反應(yīng)物形成三元親和物，使得電化學(xué)活性分子與電極密切靠近；在競爭法中，反應(yīng)物與電化學(xué)活性分子標(biāo)記的分析物形成二元親和物，使得電化學(xué)活性分子與電極密切靠近；在直接檢測中，反應(yīng)物和被電化學(xué)活性分子標(biāo)記的分析物形成二元親和物，使得電化學(xué)活性分子與電極密切靠近。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述分析物選自細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、分子及其集合物或復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞選自動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、重組細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞；所述細(xì)胞器選自細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、分泌小泡、液泡或微粒體所述分子選自無機(jī)分子、有機(jī)分子及其復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述有機(jī)分子選自氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、碳水化合物、脂類及其復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述分析物選自激素、癌標(biāo)記物、類固醇、固醇、藥物化合物、藥物化合物的代謝物及其復(fù)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述樣品是哺乳動(dòng)物樣品、體液樣品或臨床樣品。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物選自牛科動(dòng)物、山羊、綿羊、馬科動(dòng)物、野兔、豚鼠、鼠科動(dòng)物、人類、貓科動(dòng)物、猴子、狗或豬；所述臨床樣品是血清、血漿、全血、痰、腦脊液、羊水、尿、胃腸內(nèi)容物、頭發(fā)、唾液、汗、齒齦刮取物、活體解剖組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)物是抗體或核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)物選自細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、分子及其集合物或復(fù)合物；所述細(xì)胞選自動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、重組細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞；所述細(xì)胞器選自細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、分泌小泡、液泡或微粒體所述分子選自無機(jī)分子、有機(jī)分子及其復(fù)合物；所述有機(jī)分子選自氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、碳水化合物、脂類及其復(fù)合物；所述分析物選自激素、癌標(biāo)記物、類固醇、固醇、藥物化合物、藥物化合物的代謝物及其復(fù)合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述電化學(xué)活性分子是過渡金屬絡(luò)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述過渡金屬選自鈷、鎳、鋨、鐵、錸、鉻和釕；所述過渡金屬絡(luò)合物選自二茂鐵、金屬卟啉、金屬聚吡啶、金屬聚菲咯啉和金屬酞氰染料。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述過渡金屬是三(2，2’-聯(lián)吡啶)絡(luò)合物或其衍生物之一。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述過渡金屬是三(2，2’-聯(lián)吡啶)合釕或其衍生物之一。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述氧化電極是天然的或在現(xiàn)場形成的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述氧化電極是金、鉑、銀、鈷、鎳、碳或金屬氧化物電極。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述金屬氧化物電極是一種金屬氧化物或聯(lián)合了兩種或多種金屬氧化物的電極。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述金屬氧化物選自氧化銦、氧化錫、氧化鈦、氧化鋯、氧化鎢、氧化鋅和氧化鐵。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述金屬氧化物是純金屬氧化物或摻雜金屬氧化物；所述摻雜金屬氧化物是摻錫的氧化銦或摻氟的氧化錫。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述還原劑可以溶解在水溶液中。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述有機(jī)氧化還原分子選自有機(jī)酸、有機(jī)堿、有機(jī)離子和有機(jī)兩性離子。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述有機(jī)酸是羧酸或草酸；所述有機(jī)堿是胺、伯胺、仲胺、叔胺或三丙胺。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述有機(jī)氧化還原分子是離子化有機(jī)酸或離子化有機(jī)堿；所述離子化的有機(jī)酸是草酸鹽；所述離子化的有機(jī)堿是質(zhì)子化三丙胺。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述有機(jī)兩性離子為有機(jī)堿和有機(jī)酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述有機(jī)堿是胺，有機(jī)酸是羧酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述有機(jī)堿是胺，有機(jī)酸是磺酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述有機(jī)兩性離子是氨基酸，其中優(yōu)選的是脯氨酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述有機(jī)兩性離子是“Good”緩沖液，其中優(yōu)選的是BES、BICINE、CAP、HEPPS、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TAPS、TES和TRICINE。
29.權(quán)利要求1-28中任何一項(xiàng)所述的方法在酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、免疫印跡、免疫沉淀反應(yīng)、放射性免疫測定(RIA)、免疫染色、乳膠凝集素、間接紅血球凝聚(IHA)、補(bǔ)體結(jié)合、間接熒光免疫分析(IFA)、用懸液計(jì)測量懸液法、流體細(xì)胞分析、化學(xué)發(fā)光分析、橫向流體免疫測定分析、μ-捕獲分析、抑制分析、能量轉(zhuǎn)移分析、親和力分析、濁度免疫分析或時(shí)間分辯放大穴狀化合物發(fā)射(TRACE)分析中的應(yīng)用。
30.一種進(jìn)行化學(xué)放大電化學(xué)檢測的試劑盒，它包括1)能在氧化電極上與被分析的分析物結(jié)合和/或反應(yīng)的反應(yīng)物；2)一種與還原態(tài)電化學(xué)活性分子共價(jià)連接的額外的反應(yīng)物、分析物或分析物類似物；3)不能被所述電極直接氧化的一種還原劑；4)評價(jià)放大的電化學(xué)信號以確定分析物在樣品中的存在和/或量的裝置。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括能氧化電化學(xué)活性分子，但不能氧化還原劑的氧化物電極。
全文摘要
本發(fā)明公開了親和反應(yīng)的化學(xué)放大電化學(xué)檢測方法及其試劑盒，其目的是提供一種有效、靈敏的化學(xué)放大電化學(xué)檢測方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟1)提供能在氧化電極上與被分析的目的分析物結(jié)合和/或反應(yīng)的反應(yīng)物；2)將樣品與步驟1)中所提供的反應(yīng)物接觸；3)在合適條件下，所述分析物與所述反應(yīng)物結(jié)合。所述反應(yīng)物、分析物或者額外反應(yīng)物或額外分析物或分析物類似物與處于還原態(tài)的電化學(xué)活性標(biāo)記分子共價(jià)鍵連接。標(biāo)記分子在電極上被氧化；4)用不能在電極上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的還原劑將所述親和物的電化學(xué)活性分子還原到還原態(tài)；5)所述被還原的電化學(xué)活性分子重復(fù)參與步驟3)和4)的所述氧化－還原反應(yīng)，產(chǎn)生放大的電化學(xué)信號；6)評價(jià)放大的電化學(xué)信號，確定目的分析物在樣品中的存在和/或目的分析物的量。利用本發(fā)明的方法檢測分析物，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有靈敏度高，成本低的特點(diǎn)，可以用于多種方法的分析中。
文檔編號C12Q1/68GK1504746SQ0215366
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者郭良宏, 李元光, 王娜, 王福泉, 楊夕強(qiáng), 程京 申請人:北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司, 清華大學(xué)