專利名稱：建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒基因檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體地講是利用Fe3O4(核)/金(殼)納米顆粒乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)探針，通過二次放大技術(shù)，建立檢測HBVDNA及其變異的方法。
背景技術(shù)：
納米顆粒是直徑為1-100nm的顆粒，在該尺度范圍內(nèi)，納米材料有很多新的特性，因此它成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。利用納米材料獨(dú)特的力、電、光、磁等特性，形成高度學(xué)科交叉的納米生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，在現(xiàn)實(shí)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。1996年Chad A Mirkin等人將烷烴硫醇修飾的寡核苷酸通過金-硫(Au-S)鍵共價(jià)結(jié)合于金納米顆粒的表面，形成以金納米顆粒為標(biāo)記的DNA探針，并利用此探針，檢測靶DNA。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)形成金納米顆粒聚合體時(shí)，靶單鏈的檢測下限可達(dá)到10fMol；當(dāng)形成金納米單層后加入Ag+對苯二酚液進(jìn)行放大，靶單鏈的檢測下限可達(dá)到50fMol。這一研究成果發(fā)表在《科學(xué)》上。
病毒性肝炎(特別是乙型肝炎)是嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病，據(jù)估計(jì)全世界HBV攜帶者有4-5億。我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，HBV人群攜帶率為10-20％，每年由于病毒性肝炎給國家造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約為500-1000億元，由此產(chǎn)生的社會(huì)負(fù)擔(dān)及其它負(fù)面影響更為巨大。乙肝患者(包括肝移植術(shù)前術(shù)后)經(jīng)抗病毒治療后野生型乙肝病毒滴度下降或發(fā)生變異(尤其在應(yīng)用拉米呋啶治療的患者)，采用傳統(tǒng)的生化方法(ELISA，enzyme-linked immunoadsordent assay)不能檢出，PCR(polymorase chainreaction)技術(shù)因存在一定假陽性有其應(yīng)用局限性。HBV變異后可產(chǎn)生免疫逃逸、抗疫苗性及抗藥性等，病情易惡化并嚴(yán)重威脅患者的生命。目前尚未有文獻(xiàn)公開利用利用Fe3O4(核)/金(殼)納米顆粒乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸探針，通過二次放大技術(shù)，檢測HBV DNA及其變異的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將DNA結(jié)合的特異性與納米材料獨(dú)有的特性很好地整合起來，建立了一種新型的DNA探測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)HBV DNA及其變異的超靈敏探測。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的a、以HBV DNA為靶序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，探針包含21-60個(gè)核苷酸，由兩部分組成，其中主要部分長15-50個(gè)核苷酸，另外一小部分為6-10個(gè)核苷酸，將寡核苷酸的5’端或3’端進(jìn)行烷烴硫醇修飾；用化學(xué)方法合成寡核苷酸，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。寡核苷酸中主要部分是與HBVDNA的突變區(qū)或保守區(qū)互補(bǔ)的，長15-50個(gè)核苷酸；另外一小部分為6-10個(gè)核苷酸T，以保證寡核苷酸中的主要部分與其互補(bǔ)區(qū)充分結(jié)合。
b、將烷烴硫醇修飾的探針通過Au-S鍵共階結(jié)合于Au納米顆?；騀e3O4(核)/Au(殼)納米顆粒上；c、采用操控俘捉探針；d、檢測系統(tǒng)中加入連接鏈和信號放大物質(zhì)。
此發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)有三個(gè)1、信號二次放大效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了HBV DNA的超靈敏探測。針對HBV DNA設(shè)計(jì)的金納米顆粒DNA探針與靶單鏈在溶液中雜交，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)連接鏈替代靶單鏈以形成金納米顆粒聚合體，極大地減少靶單鏈的需用量(信號一次放大)；隨后加入銀(Ag+)-對苯二酚液，Ag+離子將從金納米顆粒表面或溶液中奪得一個(gè)電子而還原為Ag原子，并附著于金納米顆粒表面上(信號二次放大，放大約105倍)。兩次放大可使DNA的檢測下限小于0.1fMol(目前國際上可探測的敏感度為10fMol)，通過對聚合體灰度的分析，定性或半定量地檢測出已知序列的HBV DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)HBV DNA的超靈敏探測。同時(shí)，利用Au納米顆粒的等離子共振信號在DNA變性溫度范圍極其敏感的特點(diǎn)寡核苷酸修飾的Au納米顆粒體系的光吸收隨溫度變化的曲線在DNA變性溫度附近的變化極陡銳，其一次微分的半峰寬Full Width atHalf Maximum(FWHM)～2℃，而通常DNA的FWHM～15℃，從而提高了DNA雜交的特異選擇性。
2、我們發(fā)明并應(yīng)用Fe3O4(核)/Au(殼)納米顆粒，極大地減小了雜交的位阻效應(yīng)，以確保雜交率。傳統(tǒng)的Au納米顆粒無內(nèi)核，我們所構(gòu)建的HBVDNA的俘捉探針因含有Fe3O4內(nèi)核，通過磁場加以控制，既可將靶單鏈從待檢樣品中預(yù)分離，又可借助磁場在基底上形成覆蓋率可控的Fe3O4(核)/Au(殼)-Au納米顆粒單層，從而極大地減小了雜交的位阻效應(yīng)，確保HBV DNA樣品中靶單鏈的檢測下限達(dá)到0.1fMol。
3、該技術(shù)的另一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)就是檢測成本低。其主要耗材是烷烴硫醇-寡核苷酸修飾的金納米顆粒。假設(shè)每個(gè)聚合體有近千個(gè)金納米顆粒，每個(gè)金納米顆粒(直徑約15nm)連接約220條寡核苷酸(實(shí)際數(shù)可低30-50％)，若探測系統(tǒng)含有近千個(gè)聚合體，則共需寡核苷酸的數(shù)目約為2.2×108條。而購買烷烴硫醇修飾的寡核苷酸(20D值，HPLC純化)的價(jià)格約為1100～1500元，其中含有約1×1016條寡核苷酸。而且金納米顆粒的制備成本也很低。每次探測耗材(烷烴硫醇修飾的寡核苷酸、金納米顆粒)的費(fèi)用少于1元。如果該技術(shù)能實(shí)現(xiàn)集成自動(dòng)化的儀器檢測，將具有很大的利潤空間和價(jià)格優(yōu)勢。


附圖Fe3O4(核)/金(殼)納米顆粒HBV DNA探針檢測過程示意圖具體實(shí)施方式
寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成寡核苷酸探針包含26個(gè)核苷酸，由兩部分組成，其中主要部分是與HBV DNA的突變區(qū)或保守區(qū)互補(bǔ)的，長20個(gè)核苷酸；另外一小部分為6個(gè)核苷酸T，以保證寡核苷酸中的主要部分與其互補(bǔ)區(qū)充分結(jié)合。
1、各型乙型肝炎HBV DNA(急性、慢性/重型、輕型及病毒攜帶者)變異株、野生株的篩選、克隆和純化。找出與乙型肝炎病情發(fā)生發(fā)展相關(guān)的突變區(qū)并進(jìn)行系統(tǒng)研究，針對常見突變的區(qū)域設(shè)計(jì)探針；同時(shí)設(shè)計(jì)HBV DNA保守序列區(qū)域的探針。以HBV DNA(accessionX75658)1873-1912位為靶序列設(shè)計(jì)探針①設(shè)計(jì)的探針c(probe c)與靶單鏈的1893-1912位互補(bǔ)，探針c序列為5’-ttt ttt gtc aat gtc cat gcc cca aa-3’。
②連接鏈(linker)的設(shè)計(jì)連接鏈長40bp，序列為5’-caa gct gtg cct tgg gtg gcg ggg ggg ggg ggg ggg ggg g-3’前20bp與靶單鏈上未跟probe c雜交的部分(即1873-1892位)相同，后20bp不與probe c互補(bǔ)或相似。以linker替代靶單鏈形成金納米顆粒聚合體，可大大減少了靶單鏈的需用量，達(dá)到超靈敏地探測DNA。
③對連接鏈上的這兩段分別設(shè)計(jì)出探針a(probe a)和探針b(probeb)，probe a序列為5’-gcc acc caa ggc aca gct tgt ttt tt-3’probe b序列為5’-ttt ttt ccc ccc ccc ccc ccc ccc cc-3’它們與連接鏈嚴(yán)格地互補(bǔ)。
探針的設(shè)計(jì)結(jié)果是probe a和probe c可與靶單鏈上不同段互補(bǔ)結(jié)合，probe a和probe b可與linker上不同段互補(bǔ)結(jié)合。將烷烴硫醇修飾寡核苷酸的5’端或3’端。用化學(xué)方法合成寡核苷酸，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
2、將烷烴硫醇修飾的探針通過Au-S鍵共價(jià)結(jié)合于Au納米顆粒或Fe3O4(核)/Au(殼)納米顆粒上，形成探針鏈以超順磁性的Fe3O4(核)/Au(殼)結(jié)構(gòu)的納米顆粒偶聯(lián)烷烴硫醇修飾的probe c，構(gòu)成靶單鏈的俘捉探針。在被檢樣品中俘捉探針通過雜交(加熱、退火)而俘捉靶單鏈，通過磁場操控、清洗，實(shí)現(xiàn)被檢靶單鏈的初步分離，并可避免芯片設(shè)計(jì)帶來的位阻影響。
用Au納米顆粒分別偶聯(lián)烷烴硫醇修飾的probe a或probe b，用來形成Au納米顆粒聚合體。
將金納米顆粒與烷氫硫醇修飾的寡核苷酸連接，其連接方法如下(1)5ml檸檬酸處理的10nM金納米顆粒溶液與2.5OD烷氫硫醇修飾的寡核苷酸(終濃度為3.61uM)混合，放置24小時(shí)；(2)加入0.1M氯化鈉，10mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7)，放置40小時(shí)，14,000轉(zhuǎn)/分，25分鐘，去上清；(3)加入5ml 0.1M氯化鈉，10mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7)，洗紅色油狀沉淀，14,000轉(zhuǎn)/分，25分鐘，去上清；(4)沉淀重懸于5ml新鮮0.3M氯化鈉，10mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7)，0.01％疊氮鈉溶液中。
3.探測流程①probe c[Fe3O4(核)/Au(殼)]與待檢樣品混合，與靶單鏈雜交后，加磁場分離，清洗。
②加入probe a，與靶單鏈另一段雜交后，probe a顆粒即與probec[Fe3O4(核)/Au(殼)]連接，加強(qiáng)磁場，超順磁性的Fe3O4(核)/Au(殼)納米顆粒將拉著probe a的Au納米顆粒向下沉并被吸于底部，排列，不易被洗去。
③依次加入linker、probe b、probe a，并重復(fù)多次，使在上一步中probe a的Au納米顆粒處為固定點(diǎn)，形成降落傘狀層疊的含有probe a、probe b的Au納米顆粒聚合體(信號一次放大)。
④加入Ag+對苯二酚液，Ag+離子將從金納米顆粒表面或溶液中奪得一個(gè)電子而還原為Ag原子，并附著于金納米顆粒表面上，薄膜表面隨即呈現(xiàn)灰黑的顏色，靶越多，顏色越黑(信號二次放大，放大約105倍)。
⑤通過對聚合體灰度的分析，定性或半定量地檢測出已知序列的HBVDNA片段。
權(quán)利要求
1.建立一種乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是a、以HBV DNA為靶序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，探針包含21-60個(gè)核苷酸，由兩部分組成，其中主要部分長15-50個(gè)核苷酸，與HBV DNA的突變區(qū)或保守區(qū)互補(bǔ)；另外一小部分為6-10個(gè)核苷酸T，將寡核苷酸的5’端或3’端進(jìn)行烷烴硫醇修飾；b、將烷烴硫醇修飾的探針通過Au-S鍵共價(jià)結(jié)合于Au納米顆?；騀e3O4核/Au殼納米顆粒上；c、采用磁場操控俘捉探針；d、檢測系統(tǒng)中加入連接鏈和信號放大物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是以HBV DNA 1873-1912位為靶序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針。
3.如權(quán)利要求1所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是探針包含26個(gè)核苷酸，由兩部分組成，其中主要部分與HBVDNA的突變區(qū)或保守區(qū)互補(bǔ)，長20個(gè)核苷酸，另外一小部分是6個(gè)核苷酸T。
4.如權(quán)利要求1所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是寡核苷酸探針包括俘捉探針c，它與靶單鏈的一段互補(bǔ)；連接鏈長30-40bp，其中一段與靶單鏈上未跟探針c雜交的部分相同，另一段不與探針c互補(bǔ)或相似；探針a和探針b與連接鏈嚴(yán)格地互補(bǔ)。
5.如權(quán)利要求4所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是俘捉探針c序列為5’-ttt ttt gtc aat gtc cat gcc ccaaa-3’，它與靶單鏈的1893-1912位互補(bǔ)。
6.如權(quán)利要求4所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是連接鏈長40bp，序列為5’-caa gct gtg cct tgg gtg gcgggg ggg ggg ggg ggg ggg g-3’，前20bp與靶單鏈上未跟探針c雜交的部分即1873-1892位相同，后20bp為20個(gè)核苷酸G，不與探針c互補(bǔ)或相似。
7.如權(quán)利要求4所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是探針a序列為5’-gcc acc caa ggc aca gct tgt ttt tt-3’，探針b序列為5’-ttt ttt ccc ccc ccc ccc ccc ccc cc-3’，它們與連接鏈嚴(yán)格地互補(bǔ)。
8.如權(quán)利要求1所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征是通過磁場操控俘捉探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求書1所述建立乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸的探測系統(tǒng)的方法，其特征在于檢測系統(tǒng)中加入的信號放大物質(zhì)是Ag+對苯二酚液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立的HBV DNA的探測系統(tǒng)的方法。它是以HBV DNA1873－1912位為靶序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，探針包含26個(gè)核苷酸，由兩部分組成，其中主要部分長20個(gè)核苷酸，另外一小部分為6個(gè)核苷酸，將寡核苷酸的5’端或3’端進(jìn)行烷烴硫醇修飾；將烷烴硫醇修飾的探針通過Au－S鍵共價(jià)結(jié)合于Au納米顆?；騀e
文檔編號C12Q1/68GK1510148SQ0215413
公開日2004年7月7日 申請日期2002年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者琴 寧, 寧琴, 姚凱倫, 羅小平, 劉祖黎, 習(xí)東, 盧強(qiáng)華 申請人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院