專利名稱：一種超低變性溫度的聚合酶鏈式反應方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學技術，特別是涉及一種聚合酶鏈式反應的方法及其應用。
背景技術：
聚合酶鏈式反應是一種高效的擴增特定DNA的方法，在生物醫(yī)學的各個領域特別是臨床診斷上有廣泛的應用。聚合酶鏈式反應主要由25-35個溫度呈周期變化的循環(huán)組成，每一個循環(huán)包括變性，退火和延伸三個步驟。其中，變性步驟目的是將原始模板或擴增產(chǎn)物的DNA雙鏈解開使之成為二條單鏈，然后二條單鏈能在退火溫度下與正、反引物分別互補結合，繼而延伸完成一個循環(huán)。變性步驟可以看作是每一輪循環(huán)的起始步驟，是整個擴增過程中不可或缺的一環(huán)。
PCR反應的專一性和效率主要取決于退火和延伸步驟，對變性過程的研究遠不及對退火和延伸的研究那樣廣泛深入。有關PCR的各種技術指南均指出變性溫度范圍通常為94-95℃，已發(fā)表的十余萬篇應用PCR方法的論文中絕大多數(shù)應用這一溫度，極少數(shù)使用較高的變性溫度如96℃或較低的變性溫度如90-94℃，文獻報導的最低變性溫度為87℃。
歷來將變性溫度界定為94-95℃有其道理，一方面這一溫度接近DNA聚合酶能承受的極限，充分發(fā)揮了酶的耐熱特性；另一方面在該溫度下幾乎所有的原始模板和不同長度的擴增產(chǎn)物均能被充分解鏈從而使整個擴增過程得以完成。正因為如此，十幾年來從未有文章對普遍地使用如此高的變性溫度是否有必要，是否合理和是否能作大幅度調整表示懷疑。
變性溫度上限受DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性所制約，DNA聚合酶的半衰期隨溫度升高而降低，溫度高于90℃時半衰期急劇下降。以極耐熱的被普遍應用的Taq酶為例，當溫度為92.5，95或97.5℃時其半衰期分別為130，40或5分鐘左右，通常每一循環(huán)的變性持續(xù)時間為30秒鐘，顯然，如果變性溫度超過97℃則經(jīng)過幾個循環(huán)以后Taq酶的活力就會顯著下降，難以完成30個左右循環(huán)的擴增。
變性溫度的下限則受原始模板DNA和擴增產(chǎn)物解鏈溫度(Tm)所制約。通常PCR擴增產(chǎn)物的長度為150-800堿基，它們在標準PCR反應液中的解鏈溫度通常在85-92℃之間。如果變性溫度較低原始模板或擴增產(chǎn)物的雙鏈不能解開從而無法完成擴增過程。
為了能使有某種良好特性但耐熱性較差的DNA聚合酶可以應用于PCR，九十年代初曾發(fā)展了在PCR反應液中添加高濃度化學變性劑的方法(Nucleic Acid Research，1999.Vol.27(6)1566-1568)，例如添加10-50％的甲酰胺，40％的甘油或5.5M的脯氨酸等，高濃度變性試劑使DNA的解鏈溫度顯著降低，從而可以在70℃左右完成變性步驟。但是，高濃度變性劑使反應體系中所有的DNA包括原始模板，目標擴增產(chǎn)物，非專一擴增產(chǎn)物和引物的解鏈溫度都大大降低，因而退火溫度和延伸溫度必須作相應的大幅度下降，而且高濃度的化學變性劑不僅抑制DNA聚合酶活力，也改變了PCR反應液的比重，粘度和傳熱特性等，對PCR反應的專一性和效率等均有顯著而復雜的負面影響。所以，這種方法除了能使耐熱性較差的DNA聚合酶可以用于PCR以外，并沒有其他令人興趣的有實質性價值的優(yōu)點。近年來具有各種良好特性又能耐高溫的DNA聚合酶正在不斷出現(xiàn)，所以應用高濃度化學變性劑來降低變性溫度的方法無論在科學研究還是臨床檢驗上都未能推廣。
本發(fā)明在回顧檢討PCR方法的原理和分析變性步驟的作用和機制的基礎上對傳統(tǒng)的變性步驟方法提出了大幅度修正和改進，擴展了PCR反應的變性溫度范圍，可降低至60-87℃，帶來了特殊的技術效果。

發(fā)明內容
所要解決的技術問題本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種超低變性溫度聚合酶鏈式反應方法及其應用，以突破現(xiàn)有PCR方法中模板變性溫度的常規(guī)，克服常規(guī)PCR反應不能利用變性溫度的調節(jié)來排除非專一性擴增產(chǎn)物以及排除假陰性結果的缺陷。
發(fā)明構思本發(fā)明的原理和構思歸納如下
第一，首次模板變性和最初2個循環(huán)的變性溫度仍為94-98℃。經(jīng)首次變性和第一循環(huán)變性步驟，承載目標擴增產(chǎn)物的原始模板被解開成二條全長的單鏈，在與引物退火并延伸完成第一循環(huán)后得到二對不完整的雙鏈，每一對由一條全長原始模板鏈和一條半長擴增鏈組成。在第二循環(huán)的變性步驟中二對不完整的雙鏈被解開得到四條單鏈，與引物退火并延伸完成第二循環(huán)后得到四對不完整雙鏈，其中二對與第一循環(huán)后產(chǎn)物相同，另二對由半長擴增鏈和目標擴增鏈組成。原始模板和第一循環(huán)形成的“半擴增產(chǎn)物”的分子量通常很大，它們的解鏈溫度均較高而且難以估算和測試，采用現(xiàn)有的變性溫度94-95℃能使絕大多數(shù)原始模板和半擴增產(chǎn)物解鏈。鑒于TaqDNA聚合酶在97.5℃下的半衰期仍有5分鐘，為了保證原始模板和“半擴增產(chǎn)物”能很快地充分解鏈，首次變性溫度和最初2個循環(huán)的變性溫度范圍可擴展至94-98℃。當變性溫度大于96℃時變性時間可縮短為1-15秒。
第二，最初二個循環(huán)之后反應的變性溫度采用超低的60-87℃。第一輪目標擴增產(chǎn)物形成后，這些單鏈DNA將作為模板參與擴增，使產(chǎn)物不斷按指數(shù)方式累積。原始模板和“半擴增產(chǎn)物”能繼續(xù)作為模板參與擴增，但隨著PCR的進程它們在目標擴增產(chǎn)物累積中的作用已越來越無足輕重。所以，PCR的其余循環(huán)的變性溫度只需要滿足目標擴增產(chǎn)物的解鏈而不必考慮原始模板和半擴增鏈的變性，而目標擴增產(chǎn)物的解鏈溫度可以根據(jù)其長度，堿基組成和順序來估測，計算和或由試驗測定。
第三，超低變性溫度的PCR反應可用于去除非專一產(chǎn)物的原理。人基因組總共約含30億對堿基，而18個堿基寡核苷酸的排列組合數(shù)達700億(418)，據(jù)此推算出現(xiàn)與含18堿基引順序完全匹配的DNA片段的幾率已非常小。但是，即使采用25堿基或更長的引物，非專一擴增產(chǎn)物也常常出現(xiàn)，這是因為雖然樣品中幾乎不可能存在目標基因之外的任何與正，反引物均完全匹配的DNA片段，但卻可能存在若干或許多與正，反引物順序均有較高匹配的DNA片段，在不十分嚴謹?shù)耐嘶饻囟认乱锬芘c甚至有嚴重錯配的DNA片段結合，從而導致非專一產(chǎn)物形成。在最初2個循環(huán)中形成的第一輪非專一擴增產(chǎn)物的上游和下游端順序已分別與引物完全互補，此時，即使提高退火溫度也無法阻止非專一產(chǎn)物繼續(xù)擴增。如果非專一產(chǎn)物的原始模板濃度較高或非專一產(chǎn)物的長度較低等各種原因，非專一產(chǎn)物的擴增效率可能比目標擴增產(chǎn)物還高而在擴增產(chǎn)物中占優(yōu)勢。當變性溫度為94-95℃時，幾乎所有的非專一產(chǎn)物都能解鏈完成變性步驟繼續(xù)循環(huán)。如果將變性步驟的溫度限定在只比目標擴產(chǎn)物的解鏈溫度略高，則那些解鏈溫度較高的非專一擴增產(chǎn)物就因不能完成解鏈過程而流產(chǎn)。
第四，當產(chǎn)物長度小于400堿基時，選擇到低于87℃變性溫度的目標產(chǎn)物是完全可行的方案。PCR擴增產(chǎn)物長度通常范圍為150-800堿基，本研究表明在此范圍尤其是在150-400堿基長度范圍內，DNA的解鏈溫度因其堿基組成成份和排列順序的不同而有較大的差異，以200堿基長擴增產(chǎn)物為例，在隨機選擇的22個DNA片段中，最低者解鏈溫度77.2℃，比平均解鏈溫度低8.7℃，比最高者低16.4℃。所以，在此范圍內對每一個既定的長度都有機會選擇到解鏈溫度較低的目標擴增產(chǎn)物。選擇的目標擴增產(chǎn)物解鏈溫度越低，通過控制變性步驟的溫度而流產(chǎn)的非專一擴增產(chǎn)物就越多。
第五，當產(chǎn)物長度小150堿基時，變性溫度大大降低。在PCR的許多應用中如基因表達分析和病毒感染檢測對PCR產(chǎn)物的長度沒有任何限制，即可以應用短于150堿基的短擴增產(chǎn)物。當擴增產(chǎn)物長度低于150堿基特別是低于70堿基時，DNA的平均解鏈溫度隨長度減短而急劇下降，最高與最低解鏈溫度的差距則隨鏈長降低而增大，所以選擇短擴增產(chǎn)物的超低變性溫度PCR方法具有更強的潛力和更特出的優(yōu)點。例如，當擴增產(chǎn)物長度分別小于200，120或70堿基時擴增產(chǎn)物的最低解鏈溫度可分別低于80，75和70℃，可以在分別比80，75或70℃略高的溫度下完成變性。
第六，實際應用過程中應將變性溫度作為指標之一選擇合適的引物。擴增產(chǎn)物的長度和包括解鏈溫度在內的各項特性是由引物對所決定的，以往的研究中從未把擴增產(chǎn)物的解鏈溫度作為選擇引物的考量之一，各種引物設計軟件都沒有把擴增產(chǎn)物的解鏈溫度作為判別引物嚴謹性的一個指標。但是，即使應用普通的引物設計軟件，也就是說在沒有考慮擴增產(chǎn)物解鏈溫度對引物嚴謹性貢獻情況下，用引物設計軟件自動搜尋到的高嚴謹性引物中，均出現(xiàn)一定比例的引物，用這種引物所得到的擴增產(chǎn)物的解鏈溫度顯著低于該長度擴增產(chǎn)物的平均解鏈溫度，所以低變性溫度PCR方法是有價值的，也是普遍可行的。
第七，當擴增產(chǎn)物長度為400-1000堿基時，仍可選到使擴增產(chǎn)物變性溫度低于87℃的引物，且在相應PCR反應中可去除非專一性產(chǎn)物。用同樣的方法分測試22個從30-2000堿基長擴增產(chǎn)物的平均解鏈溫度，最低解鏈溫度和最高解鏈溫度，結果表明當擴增產(chǎn)物為30-200堿基時，最低解鏈溫度比最高解鏈溫度低約16-30℃。從不同長度的DNA片段的解鏈溫度分布能清楚地顯示，如果擴增產(chǎn)物長度已定為400-1000堿基，很容易選到一些引物對，其擴增產(chǎn)物的解鏈溫度略超過80℃，在相應的變性溫度下絕大多數(shù)400堿基以上的非專一產(chǎn)物和部分400堿基以下的非專一擴增產(chǎn)物將因其解鏈溫度較高不能完成變性而流產(chǎn)。如果對擴增產(chǎn)物長度沒有預設限制，很容易選擇到引物使目標擴增產(chǎn)物長度小于200堿基而解鏈溫度比75℃略高，采用相應變性溫度能就能使大多數(shù)不同長度的非專一擴增產(chǎn)物流產(chǎn)。如果目標擴增產(chǎn)物長度小于70堿基，很容易找到引物使擴增產(chǎn)物的解鏈溫度接近70℃甚至低于70℃，這種情況下非專一擴增產(chǎn)物幾乎可完全被排除。當然，在人基因組的幾十億個堿基對中總是存在一些約70堿基長的DNA片段，其解鏈溫度也在70℃左右，但是，可以相象在這些片段里要同時與二個引物均高度匹配的幾率是微乎其微的。
第八，由于在短距離內二個引物均能退火的非專一產(chǎn)物幾乎不可能，故超低變性溫度PCR方法能有效的控制非專一擴增產(chǎn)物形成。PCR每一循環(huán)包括變性，退火和延伸三個過程缺一不可。標準PCR方法在94-95℃變性，這對使樣品中的原始模板DNA充分解開很有必要，因為無論是基因組DNA還是互補DNA，一般需要在94-95℃才能充分解開。但是，對很多擴增產(chǎn)物沒有必要在隨后的循環(huán)中繼續(xù)使用94-95℃變性，因為大多數(shù)小于1,000堿基的擴增產(chǎn)物往往能在94℃以下的溫度完成變性。按標準PCR方法，在最初三個循環(huán)形成的擴增產(chǎn)物包括目標擴增產(chǎn)物和非專一擴增產(chǎn)物都能繼續(xù)在隨后的循環(huán)中完成變性，退火和延伸，直至反應結束。本發(fā)明選用的引物的擴增產(chǎn)物解鏈溫度很低，在隨后的低變性溫度的幾十個循環(huán)中能完成變性，但是大部分在最初三個循環(huán)中形成的非專一擴增產(chǎn)物，因其解鏈溫度較高而不能在隨后的循環(huán)中完成變性，這些非專一擴增產(chǎn)物就被流產(chǎn)。選擇的目標擴增產(chǎn)物越短或解鏈溫度越低，可實施的變性溫度就越低，可通過變性溫度來排除的非專一擴增產(chǎn)物就越多，這就為減少臨床診斷中因病毒細菌的順序的多變性而造成的假陰性帶來契機。應用超低變性溫度時，PCR反應可以在比最高允許退火溫度低十幾度的情況下完成擴增而無任何非專一擴增產(chǎn)物干擾。
為了說明本發(fā)明的原理和方法，我們以長4000余堿基的人CyclinDl基因(基因庫編號NM_053056)為例，借助引物設計軟件Oligo對DNA解鏈溫度等一些數(shù)據(jù)進行了分析，每個數(shù)據(jù)是22個計算值的統(tǒng)計結果(表1)。
表1.不同長度DNA的解鏈溫度

技術方案本發(fā)明的超低變性溫度聚合酶鏈式反應方法依次包括如下步驟模板變性；引物退火；DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；按上述三步驟循環(huán)進行擴增反應，在不添加任何化學變性劑的前提下，模板變性溫度在前2或3個循環(huán)為93-98℃，在后續(xù)的循環(huán)中為60-87℃，優(yōu)選范圍70-82℃。
本發(fā)明的超低變性溫度聚合酶鏈式反應方法采用的擴增反應產(chǎn)物長度為40-1000堿基，優(yōu)選40-400堿基。
所說的超低溫變性溫度聚合酶鏈式反應方法在原始模板與產(chǎn)物的變性溫度之差為7-28℃的反應條件下，用于有效地排除非專一性擴增產(chǎn)物，優(yōu)選的原始模板與產(chǎn)物的變性溫度之差為10-20℃。
所說的超低溫變性溫度聚合酶鏈式反應方法在原始模板與引物有1-5個堿基的錯配且產(chǎn)物解鏈溫度為60-87℃情況下，用于有效地排除假陰性結果，特別在原始模板與引物有1-3個堿基的錯配的情況下，排除假陰性結果的效果更為理想。反應中采用引物與模板退火的溫度范圍為32-65℃，優(yōu)選的溫度為46-58℃。
實現(xiàn)本發(fā)明的關鍵之一是應用引物設計軟件自動搜尋優(yōu)秀引物，或者借助引物設計軟件所顯示的目標基因序列的Tm圖譜來初選引物的區(qū)域，并用軟件分析候選引物特性，然后人為確定。前一種方法適合于設計擴增產(chǎn)物小于100堿基的引物，后一方法適于設計擴增產(chǎn)物大于100堿基的引物。
與標準PCR方法選擇引物的通用標準一樣，本發(fā)明所選引物應具有高的嚴謹性，即低的3’端堿基互補，低的發(fā)夾結構，低的錯配結合強度和高的專一結合強度。引物本身長度范圍相當寬可在12-50堿基之間。而本發(fā)明所選引物的首要特征是擴增產(chǎn)物的解鏈溫度在60-85℃之間，優(yōu)選72-80℃。
本發(fā)明降低變性溫度的方法與添加化學變性劑方法在原理上各異但應用上能兼容，在需要的情況下添加低濃度化學變性劑可以使變性溫度范圍在本發(fā)明基礎上進一步下降，同時又保持本發(fā)明的優(yōu)點。
本發(fā)明的PCR反應的各種參數(shù)與標準PCR基本相同。循環(huán)數(shù)通常為20一45。PCR反應最初2或3個循環(huán)的變性溫度為94-95℃，經(jīng)過這個常規(guī)變性溫度循環(huán)，最初的目標擴增產(chǎn)物已形成。本發(fā)明的區(qū)別在于在隨后的約20-45個循環(huán)中將變性溫度降為60-87℃，具體實施溫度取決于目標擴增產(chǎn)物的解鏈溫度。變性步驟溫度應比此溫度略高，變性溫度越接近解鏈溫度，PCR反應的專一性越好。
本發(fā)明所采用的模板DNA為cDNA，由人肌肉組織總RNA(Clontech公司)利用cDNA制備試劑盒(Clontech公司Advantage RTfor PCR kit)制備，所用引物為試劑盒提供的Oligo(dT)18，PCR體積10μL，每管加1μL 1μg/1λRNA。
本發(fā)明的PCR反應均采用Clontech公司Advantage 2試劑盒，引物終濃度為0.5μM。
有益效果超低變性溫度聚合酶鏈式反應方法不僅使傳統(tǒng)PCR方法的簡單，快速，專一和靈敏等幾項特性都得到改進和發(fā)揮，而且拓展了PCR方法的功能和應用。
超低變性溫度PCR方法的另一特出優(yōu)點是使PCR反應的時間大大縮短。第一，本發(fā)明的變性溫度為60一87℃，優(yōu)選72-82℃，而退火溫度范圍與標準PCR相同，以退火溫度55℃變性溫度75℃為例，每一循環(huán)的溫差為20℃。與原來的溫差40℃(95減45)相比，坡道時間可節(jié)約一半。第二，本發(fā)明的變性溫度控制在比目標擴增產(chǎn)物解鏈溫度略高，在采用小反應體積傳熱過程迅速的前提下，變性時間只需要一秒，比通常的15秒至1分鐘省了幾十倍。第三，超低變性溫度PCR方法的擴增產(chǎn)物大多較短，可以在坡道和一秒鐘的延伸時間內完成擴增，與通常的延伸一分鐘相比也節(jié)約了幾十倍。本發(fā)明的實施例都能在15分內完包括30個循環(huán)的PCR，而標準PCR方法通常需一至一個半小時。
除了最初三個循環(huán)超低溫度PCR分方法的其他循環(huán)的變性溫度低于87℃，顯然，Taq聚合酶的活力在反應前后活力保持穩(wěn)定，有利于進一步進行套嵌PCR。也有利于整個反應的穩(wěn)定性。
應用方面，對PCR反應過程的機制分析和我們的實際試驗表明，超低變性溫度PCR方法具有極大的優(yōu)越性。本方法能通過控制退火溫度和控制變性溫度雙重機制有效地阻止或完全消除非專一擴增產(chǎn)物的形成，而非專一產(chǎn)物形成在標準PCR方法中隨處可見，往往是令PCR科學研究和臨床分析人員深感頭痛的問題。下面的試驗實例表明超低變性溫度方法能有效地控制非專一產(chǎn)物的形成，在這些例子中，即使采用非常低的退火溫度，即在放寬退火溫度控制的情況下也不形成任何非專一擴增產(chǎn)物。
具體實施例方式
實施例1.
超低溫變性PCR引物設計的可行性。
我們用引物設計軟件Oligo以乙型肝炎病毒基因、人肌動球蛋白基因和人甘油醛3-磷酸-脫氫酶基因為例，測試能擴增產(chǎn)100堿基以下短產(chǎn)物的目標引物的出現(xiàn)頻率，結果表明對每一個測試基因的每一個長度，都可以搜尋到幾十至幾百對具有高嚴謹性的優(yōu)秀引物，而且其中30-80％的引物的擴增產(chǎn)物的解鏈溫度小于80℃，表2列述對人肌動蛋白球基因測試的結果。
表2在人肌動蛋白球基因中找到的優(yōu)秀引物對數(shù)

表2說明超低變性溫度PCR方法能普遍用于小于100堿基產(chǎn)物的擴增。對于100-150堿基的產(chǎn)物也部分適用，其平均解鏈溫度在83℃-87℃，最高與最低解鏈溫度之差在10度以上，提示找到一些引物其擴增產(chǎn)物的解鏈溫度在80℃以下是普遍可行的。
實施例2.
超低溫變性PCR引物設計實例。
利用Oligo引物設計軟件以人肌動球蛋白基因全基因序列為例設計下列引物。(設計結果見表3)表3.人肌動球蛋白基因序列為例設計超低溫變性PCR的引物

實施例3.
對實施例2所設計的引物對進行超低溫變性PCR反應。
反應條件為先95℃變性60秒，62℃(對于9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(對于9A3和9A4)退火并延伸5秒進行2或3個循環(huán)；再68-82℃變性5秒，62℃(9A1、9A2、9A5和9A6)或者45℃(9A3和9A4)退火及延伸5秒，共25個后續(xù)循環(huán)。結果見表4。
表4.超低溫變性PCR反應結果

+表示陽性結果；-表示陰性結果；±表示弱陽性結果。
實施例4.
超低溫變性PCR在排除非專一性產(chǎn)物中的應用。
用引物設計軟件Oligo設計的正常長度HBV引物，任選2對如下(5′-3′)9A8 5′CCT CAT CAT CCT GCT GCT ATG CC 產(chǎn)物解鏈溫度85.5℃9A8 3′GGG GAA AGC CCT ACG AAC CAC TG 產(chǎn)物長度315
9A9 5′TCA AGG TAT GTT GCC CGT TTG TC產(chǎn)物解鏈溫度84.1℃9A9 3′CGA ACC ACT GAA CAA ATG GCA 產(chǎn)物長度251將上述9A8和9A9與9A1-9A6同樣以如下條件反應先95℃變性60秒，45℃退火15秒，62℃延伸15秒進行2或3個循環(huán)；再85℃變性5秒，45℃退火15秒，62℃延伸15秒，共25個后續(xù)循環(huán)。
結果顯示低溫退火條件下，常規(guī)變性溫度的9A8和9A9反應均有大量的非專一產(chǎn)物而無315bp和251bp正常產(chǎn)物；相反，在9A1-9A6仍能獲得預期長度的正常產(chǎn)物。
實施例5.
超低溫變性PCR在排除假陰性中的應用。
采用引物分析軟件Oligo對預先設計的人肌動球蛋白基因引物對(表5)作性能分析(表6)，以及實際PCR反應試驗(表7)均表明當引物與目標模板順序最多有5個錯配時仍能專一地擴增目標產(chǎn)物，即用一個引物可以應對各種不同的，含多個順序突變的變種。
表5.人肌動球蛋白基因序列上設計的帶有錯配的引物對


表6.引物分析軟件Oligo對人肌動球蛋白基因引物對的性能分析

表7.人肌動球蛋白引物對在不同退火延伸溫度下的超低變性溫度(72℃)PCR反應試驗結果


反應條件先95℃變性15秒，46-66℃或32-46℃退火及延伸15秒，共3個循環(huán)；再72℃變性15秒，46-66℃或32-46℃退火及延伸15秒，共25個循環(huán)。
結論(1)完全匹配引物可在65℃左右高溫下退火完成擴增；(2)一個引物完全匹配而另一引物有1-4個錯配，與模板專一結合強度在192-248點，仍能在約54-58℃下退火完成擴增；(3)一個引物完全匹配而另一個引物有5個錯配，與模板專一結合強度為165點時，還能在36℃左右退火完成擴增；(4)當一對引物都有1-5個錯配，也都能完成擴增，最高允許退退火溫度比一個引物完全匹配時略低；(5)在上述低溫度退火下，仍均只形成目標擴增產(chǎn)物。
權利要求
1.一種超低變性溫度的聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)模板變性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進行擴增反應；其特征在于，模板變性溫度在前2或3個循環(huán)為93-98℃，在后續(xù)的循環(huán)中為60-87℃。
2.根據(jù)權利要求1所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于后續(xù)的循環(huán)中模板變性溫度為70-82℃。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于擴增反應產(chǎn)物長度為40-1000堿基。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于擴增反應產(chǎn)物長度為40-400堿基。
5.權利要求1所述的超低變性溫度聚合酶鏈式反應方法在排除非專一性擴增產(chǎn)物中的應用，其特征在于原始模板與產(chǎn)物的解鏈溫度之差為7-28℃。
6.根據(jù)權利要求5所述的聚合酶鏈式反應方法在排除非專一性擴增產(chǎn)物中的應用，其特征在于原始模板與產(chǎn)物的解鏈溫度之差為10-20℃。
7.權利要求1所述的超低變性溫度聚合酶鏈式反應方法在排除假陰性結果中的應用，其特征在于原始模板與引物有1-5個堿基的錯配且產(chǎn)物解鏈溫度為60-87℃。
8.根據(jù)權利要求7所述的聚合酶鏈式反應方法在排除假陰性結果中的應用，其特征在于原始模板與引物有1-3個堿基的錯配。
9.根據(jù)權利要求7所述的聚合酶鏈式反應方法在排除假陰性結果中的應用，其特征在于引物與模板退火的溫度為32-65℃。
10.根據(jù)權利要求7或8所述的聚合酶鏈式反應方法在排除假陰性結果中的應用，其特征在于引物與模板退火的溫度為46-58℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈式反應的方法及其應用。提供了一種在超低變性溫度下進行PCR反應的方法，采用的模板變性溫度在前2或3個循環(huán)為93－98℃，在后續(xù)的循環(huán)中為60－87℃，大大低于常規(guī)的94－96℃的變性溫度，實驗發(fā)現(xiàn)該方法不但同樣可以成為一種普遍應用的PCR，而且利用超低溫下模板的選擇性變性來控制反應的專一性，使本發(fā)明在排除非專一性擴增產(chǎn)物和排除假陰性結果中有著獨特的作用，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12P19/34GK1508257SQ0215518
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權日2002年12月18日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 林先貴, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧