專利名稱：小球諾卡氏菌菌株及其在脫除化石燃料中有機(jī)硫的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)新菌株R-9，以及用該菌株作為催化劑斷裂含硫有機(jī)化合物中C-S鍵，在脫除化石燃料中有機(jī)硫的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
石油和煤炭是世界上最重要的能源，這些礦物燃料中含有硫化物，燃燒時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量硫氧化物排放到大氣環(huán)境中，形成酸雨，嚴(yán)重污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，直接威脅著地球人類的生存空間。據(jù)有關(guān)報(bào)道，全世界每年排入大氣中的SO2近兩億噸，在中國(guó)SO2的排放量達(dá)到了1795萬噸。同時(shí)硫化物的存在還會(huì)影響燃料及其產(chǎn)品的外觀，腐蝕燃燒及運(yùn)輸設(shè)備。為了避免有毒硫化物存在造成的危害，在燃料燃燒前，燃燒過程中或燃燒后必須把燃料中的硫脫除，這已成為全世界急待解決的重大課題。面對(duì)日益嚴(yán)峻的環(huán)保形勢(shì)，人們的環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)，對(duì)于環(huán)保的要求變得越來越嚴(yán)格。因此，發(fā)達(dá)國(guó)家越來越重視燃油質(zhì)量的提高，美國(guó)1990年就通過了清潔空氣法修正案，環(huán)保局提出了使用新配方汽油的要求。從1998年起，美國(guó)環(huán)保局采用復(fù)雜模型，進(jìn)一步降低汽車排放污染，歐洲議會(huì)1998年曾立法要求2000年實(shí)施清潔汽油配方?？傊窈?0年內(nèi)，運(yùn)輸燃料(特別是汽油和柴油)的組成和質(zhì)量指標(biāo)將會(huì)有較大的改觀，即要求燃料的H/C比有所上升，而硫及芳烴含量要大大降低。北美和歐洲國(guó)家要求到2005年汽油、柴油中硫含量要低于50ppm，2010年汽油、柴油中硫含量要低于30ppm，甚至10ppm。我國(guó)是一個(gè)發(fā)展中國(guó)家，石油生產(chǎn)和燃料消耗已成為世界大國(guó)之一，SO2的排放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過世界平均水平。面對(duì)日益嚴(yán)峻的環(huán)保形勢(shì)，我國(guó)實(shí)施了可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，大力推行清潔生產(chǎn)，并頒布了一系列環(huán)保法規(guī)。初步提出將目前柴油硫含量從5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市車用柴油中硫含量低于500ppm的要求，因此，開發(fā)和加強(qiáng)高效、低成本的燃料燃前脫硫技術(shù)，將對(duì)我國(guó)實(shí)施的環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響。
降低石油、石油產(chǎn)品和煤炭中含硫量的方法有物理、化學(xué)和生物法。物理和化學(xué)法的燃前脫硫技術(shù)能有效地脫除燃料中的無機(jī)硫，但是脫除有機(jī)硫的效果很差，因?yàn)榈V物燃料中含有的有機(jī)硫化物成分復(fù)雜，大部分是雜環(huán)化合物(如圖1)，其中的C-S化學(xué)共價(jià)鍵十分牢固，用常規(guī)的物理和化學(xué)方法無法有效去除。目前常用的加氫催化脫除燃料中有機(jī)硫(HDB)技術(shù)必須在高溫(＞300℃)，高壓(＞100atm)，加氫及金屬催化劑存在的苛刻條件下脫硫，操作費(fèi)用較高，而且金屬催化劑易受底物硫原子周圍取代基空間位阻影響，所以對(duì)于燃料中大量存在的甲基取代苯并噻吩、二苯并噻吩等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜環(huán)硫化物的脫除率較低。(e.g.Houalla，M.，Broderick，D.H.，Sapre，A.V.，Nag，N.K.，de Beer，V.H.J.，Gates，B.C.，Kwart，H.J.Catalt.，61，523-527(1980)).事實(shí)證明，在大量輕汽油和柴油中，仍存在著多種二苯并噻吩的烴基取代物(e.g.Kabe，T.，Ishihara，A.andTajima，H.Ind.Eng.Chem.Res.，31，1577-1580(1992))。低硫含量的要求使得HDS過程反應(yīng)條件越來越苛刻，設(shè)備和操作費(fèi)用增高，同時(shí)伴隨著烯烴飽和反應(yīng)，造成燃料燃燒值損失。因此，迫切需要尋找一種能從石油或石油產(chǎn)品中脫除硫卻不造成石油燃燒值降低的，經(jīng)濟(jì)可行的新工藝。
生物催化脫硫(BDS)方法選擇性高，副反應(yīng)少，反應(yīng)條件溫和，設(shè)備簡(jiǎn)單，運(yùn)行費(fèi)用低，投資少，對(duì)燃料熱值影響小，不造成二次污染的優(yōu)點(diǎn)使其成為了漸被矚目的清潔石油燃料生產(chǎn)技術(shù)，有希望成為傳統(tǒng)脫氫過程的輔助途徑來進(jìn)行含硫燃料的精加工，使它們達(dá)到要求水平，所以引起了眾多科學(xué)家和工程師的興趣。
目前，已分離了多種能脫有機(jī)硫的微生物。其中好氧菌或厭氧菌都能代謝柴油中的主要難處理化合物二苯并噻吩(DBT)，如硫酸鹽還原細(xì)菌，Desulfovibrio(去磺弧菌屬)desulfuricans M6，厭氧地降解DBT，主要的產(chǎn)物是聯(lián)苯，降解率是42％。據(jù)報(bào)道，其它的硫酸鹽還原細(xì)菌也能厭氧地將DBT轉(zhuǎn)化為聯(lián)苯，但轉(zhuǎn)化率極低。厭氧過程因?yàn)橛胁恍枰醯募尤?，可以直接?yīng)用到油井中的優(yōu)點(diǎn)具有較大的吸引力，但到目前為止還未發(fā)現(xiàn)能用于實(shí)際石油脫硫體系的高效厭氧微生物。
通過好氧途徑代謝DBT的微生物有假單胞菌(pseudomonas sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp.)、棒桿菌(Corynebacterium sp.)及短桿菌(Brevibacterium sp.)等。通過對(duì)各種微生物代謝機(jī)制的研究，得知微生物的脫硫途徑主要有三種一種是專一氧化DBT的碳架(C-C鍵)，生成水溶性的含硫碳?xì)浠衔铮珻-S鍵依然保留在化合物中(如圖2左邊的代謝途徑所示)，通過油水分離將含硫降解產(chǎn)物從石油中脫除。這一途徑是在從土壤中分離出的假單胞菌(Pseudomonas)，拜葉林克氏菌(Beijerinckia)及不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)和根瘤菌(Rhizobium)的混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的，代謝過程中DBT的一個(gè)苯環(huán)在斷裂前先變成為羥基化合物，硫原子未被釋放，順式4-[2-(3-羥基)-噻吩基]-2-氧-3-丁烯酸(tran-HTOB)和3-羥基-2-甲?；洁绶?HFBT)在培養(yǎng)基中積累，其它的細(xì)菌如P.eruginosa ERC-8，Beijerinckiasp.，Pseudomonas、Rhizobium melioti和Pseudomonas sp.C18等也有這樣的代謝途徑。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的鐘慧芳研究小組也曾分離到將DBT分解為水溶性有機(jī)硫化物的菌株，可脫除煤中有機(jī)硫22.2％～32.0％，(鐘慧芳等微生物學(xué)報(bào)35(2)130-135，1995)。這種類型的代謝，會(huì)由于含碳結(jié)構(gòu)脫除，而造成燃料能量的損失。
另一種途徑以DBT為唯一碳源、硫源、能源，直接氧化DBT的C-S鍵生成苯甲酸鹽(如圖2右邊的代謝途徑所示)，已經(jīng)報(bào)道的菌種有短桿菌(Brevibacterium)和節(jié)桿菌(Arthobacter)，它們將DBT-亞砜，DBT-砜脫硫最終生成苯甲酸脂和硫酸鹽，短桿菌(Brevibacterium)可以脫去粗油中DBT的硫而不攻擊非硫碳?xì)浠衔铩＿@一代謝途徑中，不只脫除了雜環(huán)化合物中的硫，也破壞了烴的碳骨架，同樣引起了燃料熱值的損失。
第三條途徑中，微生物專一氧化斷裂DBT的C-S鍵，而不打開C-C鍵，以特有的酶系統(tǒng)將硫從雜環(huán)中專一性地脫下來，不引起燃料熱值的損失。Atlantic Research Corporation最早報(bào)道微生物可從DBT脫去硫而不改變烴的結(jié)構(gòu)。1989年Kilbane等分離出了紅色紅球菌(Rhodococcuserythropolis) IGTS8(以前稱為R.rhodochrous)，該菌得到了最廣泛的研究，特別是近年來，通過基因工程方法將該類微生物的脫硫基因(dsz)進(jìn)行了克隆、表達(dá)、測(cè)序，并成功地改造和構(gòu)建了重組菌，提高了脫硫效率，使其具有更加廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景(Denome S.A.et al.J Bacteriol.176(21)6707-6716，1994)，而且提出了DBT的脫硫途徑該途徑經(jīng)過DBT5-亞砜(DBTO)，DBT 5-砜(DBTO2)和2-羥基聯(lián)苯基-2-亞磺酸鹽(HBPS)，最終將DBT代謝為2-HBP，因此這一途徑也稱“4S”途徑(如圖3)。專一脫硫的“4S”途徑是目前比較理想，引起大家廣泛關(guān)注的研究領(lǐng)域。繼R.erythropolis IGTS8之后，又報(bào)道了其它幾種細(xì)菌有相似的代謝途徑，如棒桿菌屬細(xì)菌(Corynebacterium)SYl，R.erythropolis D-1，土壤桿菌屬(Agrobacter)MC501，分枝桿菌屬(Mycobaterium)G3及黃單胞菌屬(Xanthomonas)。
我國(guó)在石油微生物脫硫研究方面還處于起步階段。尤其是對(duì)于燃料中含硫有機(jī)化合物中硫的專一性脫除的研究至今未見系統(tǒng)研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從自然界中分離得到的具有專一性催化斷裂有機(jī)化合物中C-S鍵能力的小球諾卡氏菌菌株及其在脫除化石燃料中有機(jī)硫的應(yīng)用，該菌具有脫硫能力強(qiáng)，可利用底物范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供的小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)為Nocardiagloberula R-9，于2002年7月29日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO.0781。
該Nocardia globerula R-9菌株可從含油污水處理池中的耗氧活性污泥、油井周圍被油污染的土壤以及含硫量較高的煤礦礦坑周圍土樣中分離得到的。取樣品5克懸浮于無硫基礎(chǔ)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成1000ml水，KH2PO4，2.44g；Na2HPO4·12H2O 14.03g；NH4Cl，2.00g；MgCl2·6H2O，0.36g；CaCl2·2H2O，1；FeCl31mg；MnCl·4H2O，4mg；CuCl2，0.755mg；丙三醇0.8ml或葡萄糖1-3g，20分鐘121℃高壓滅菌)中，置搖床中混合30分鐘后，靜置，吸取上層懸浮液轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(組成g/gNaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰蛋白胨1％，20分鐘高壓滅菌)中，置搖床中以150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時(shí)。吸取5ml菌液加入100ml滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再在其中加入二苯并噻吩DBT-乙醇溶液使培養(yǎng)液中DBT濃度為0.1mM。在搖床中以150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2-3天后在噴有DBT的瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離。分離得到的單菌落分別接種于含DBT濃度為0.2mM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在搖床中以150轉(zhuǎn)/分30℃作用2-3天。經(jīng)生物作用后的樣品用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.0，在5000轉(zhuǎn)/分下離心20分鐘，上清液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取。萃取有機(jī)相回流濃縮至1ml，進(jìn)行GC-MS分析。挑選產(chǎn)物中有二苯并噻吩DBTO2及羥基聯(lián)苯的菌株進(jìn)行優(yōu)良菌株的逐步馴化。結(jié)果，選擇到了對(duì)二苯并噻吩具有專一性脫硫能力的Nocardia globerula R-9菌株，其脫硫產(chǎn)物為不含硫的羥基聯(lián)苯。
本發(fā)明提供的Nocardia globerula R-9菌株特征如下1.其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征菌株基內(nèi)菌絲體有橫隔，并從菌落中央開始斷裂成越來越小的節(jié)段或圓形及卵圓形小體，菌落邊緣有初級(jí)分枝，形成未斷裂的波曲形的基內(nèi)菌絲體，無氣生菌絲體。斷裂小體表面光滑。
2.在各種培養(yǎng)基上的的培養(yǎng)特征該菌株適宜在中性及極弱酸性培養(yǎng)介質(zhì)中常溫培養(yǎng)，在五種培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2-5天后進(jìn)行觀察，其培養(yǎng)特征見表1；表1培養(yǎng)基 氣生基內(nèi)菌絲體 色素菌絲 呈色質(zhì)地葡萄糖天門冬素瓊 無 微粉黃色 膏狀 無脂桑塔斯瓊脂 無 污米黃色 由膏狀變?yōu)檎骋籂? 無營(yíng)養(yǎng)瓊脂 無 淡粉黃色 膏狀 無無機(jī)鹽淀粉瓊脂 無 蛋殼黃色 老齡變?yōu)檎骋籂?無馬鈴薯甘油瓊脂 無 米黃色 幼齡膏狀后變?yōu)檎骋籂? 無3.細(xì)胞壁化學(xué)組份按Hasegawa T.等快速薄層層析法進(jìn)行全細(xì)胞水解液分析的結(jié)果表明R-9細(xì)胞壁化學(xué)組分含有meso-DAP(二氨基庚二酸)和甘氨酸。細(xì)胞水解液含有特征性半乳糖和阿拉伯糖。細(xì)胞壁化學(xué)組成屬于IV型。
4.生理生化特征從D-葡萄糖、D-果糖、甘露糖、海藻糖、丙三醇、山梨醇產(chǎn)酸?？衫肈-葡萄糖、D-果糖、甘露糖、海藻糖、丙三醇、甘露醇、山梨醇、丙酸鈉、丁酸鈉、蘋果酸鈉、丙酮酸鈉作為唯一碳源。明膠不液化。牛奶不胨化。硝酸鹽不還原。水解淀粉。吲哚反應(yīng)陰性。生長(zhǎng)溫度10-40℃；生長(zhǎng)pH范圍5-10；對(duì)青霉素、溶菌酶敏感。不產(chǎn)生黑色素。不產(chǎn)生H2S。見表2；表2.
實(shí)驗(yàn)名稱 結(jié)果利用糖產(chǎn)酸結(jié)果明膠液化- D-葡萄糖 +牛奶凝固+ 麥芽糖-牛奶胨化- D-果糖+淀粉水解+ 甘露糖+
硝酸鹽還原 - 甘露醇 -吲哚試驗(yàn)- 山梨醇 +纖維素上生長(zhǎng)- 海藻糖 +H2S反應(yīng)- 甘油+黑色素產(chǎn)生 - 蜜二糖 -丙酸鈉 + 棉子糖 -丁酸鈉 +蘋果酸鈉-5.16S rDNA的序列收集適量培養(yǎng)48h的菌體(12 000r/min)于1.5mL離心管中，用溶菌酶緩沖液充分懸浮菌體，通過細(xì)胞裂解，酚/氯仿/異戊醇及氯仿抽提，無水乙醇沉淀攪絲，將攪起的DNA絲溶于TE緩沖液，加Rnase除去蛋白，再用酚/氯仿/異戊醇及氯仿抽提，上清液中加3M NaAc及無水乙醇沉淀收集DNA，吸出乙醇，用TE緩沖液溶解DNA，用于PCR擴(kuò)增。
用于16S rDNA的PCR反應(yīng)的引物為一通用引物。PCR反應(yīng)體系為PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min，94℃1min，56℃1min，72℃2min；第二步循環(huán)29次，72℃10min，60℃10min，室溫放置。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，由上海生工技術(shù)有限責(zé)任公司完成。獲得菌株16S rDNA的序列，共510bp(見圖8)，Genebank登錄號(hào)為AF543313。
參照《Bergy’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的內(nèi)容，根據(jù)形態(tài)特征與細(xì)胞壁化學(xué)組份定屬的原則，證明菌株R-9為革蘭氏陽(yáng)性菌，抗酸染色陰性。菌株基內(nèi)菌絲體有橫隔，并從菌落中央開始斷裂成越來越小的節(jié)段或圓形及卵圓形小體，菌落邊緣有初級(jí)分枝，形成未斷裂的波曲形的基內(nèi)菌絲體，無氣生菌絲體。斷裂小體表面光滑。細(xì)胞壁化學(xué)組分含有meso-DAR(二氨基庚二酸)和甘氨酸細(xì)胞水解液含有特征性半乳糖和阿拉伯糖。細(xì)胞壁化學(xué)組成屬于IV型。結(jié)合各項(xiàng)生理生化特征及16SrDNA的序列確定該菌株為小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)。
本發(fā)明的小球諾卡氏菌(Nocardia globerula)R-9菌株既可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也可在含硫源(MgSO4，二甲基亞砜，DBT或其他有機(jī)硫化合物)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。應(yīng)用前需在有機(jī)硫源存在的條件下馴化。菌株在25-35℃之間一適當(dāng)溫度下，進(jìn)行中性好氧培養(yǎng)。
本發(fā)明提供的Nocardia globerula R-9菌株脫硫能力強(qiáng)，脫硫底物范圍廣，適用于化石燃料(如煤炭，石油及其產(chǎn)品)中有機(jī)雜環(huán)硫的脫除。
Nocardia globerula R-9菌株，可以用新鮮培養(yǎng)的生長(zhǎng)期菌種或有脫硫活性的冷凍非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞及其變異菌株作脫硫生物催化劑，也可用該菌株或其變異菌株的細(xì)胞中得到的有脫硫活性的一個(gè)或幾個(gè)酶作脫硫生物催化劑，還可用吸附或包埋在載體上的固定化細(xì)胞作脫硫生物催化劑。
本發(fā)明提供的Nocardia globerula R-9菌株可作為催化劑選擇性斷裂含硫有機(jī)化合物中C-S鍵，脫除硫原子，尤其適用于化石燃料(如煤炭，石油及其產(chǎn)品)中有機(jī)雜環(huán)硫的脫除；該菌株通過專一性‘4S’途徑脫除燃料中有機(jī)化合物中的雜環(huán)硫，而不破壞有機(jī)化合物的C-C骨架，不降低燃料的燃燒熱值，解決了已有石油加氫工藝處理成本高、不易于脫除雜環(huán)化合物中硫等缺點(diǎn)。該菌廣泛存在于原油污染的環(huán)境中，具有許多作為工業(yè)應(yīng)用菌株的優(yōu)良特性，耐有機(jī)溶劑的能力強(qiáng)，因此菌株具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用潛力。


圖1為燃料中的幾類含硫有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)2為脫硫的C-C鍵斷裂途徑圖3為脫硫的C-S鍵斷裂途徑，既′4S′途徑圖4為多通道輕重相反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)圖其中1反應(yīng)器上端蓋2進(jìn)氣孔3進(jìn)樣孔4電加熱管5反應(yīng)器外筒6輕相取樣孔7進(jìn)氣管 8重相取樣孔9墊圈10螺桿 11螺母 12法蘭13測(cè)溫孔 14溫度計(jì) 15圓形環(huán)16輕相分布管圖5為十六烷、乙醇及二甲基酰胺中二苯并噻吩降解速率6A為DBT降解過程中中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物的氣相色譜6B為HBP質(zhì)譜(t＝15.23)圖6C為DBTO2質(zhì)譜(t＝27.07)圖7為DBT降解途徑圖8為本發(fā)明菌株16S rDNA的序列具體實(shí)施方式
實(shí)施例1篩選Nocardia globerula R-9菌株，其步驟如下從中國(guó)大港石油化工公司煉油廠污水處理池中取好氧活性污泥樣品，取樣品5克懸浮于無硫基礎(chǔ)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成1000ml水，KH2PO4，2.44g；Na2HPO4·12H2O 14.03g；NH1Cl，2.00g；MgCl2·6H2O，0.36g；CaCl2·2H2O，1；FeCl31mg；MnCl·4H2O，4mg；CuCl2，0.755mg；丙三醇0.8ml或葡萄糖1-3g，20分鐘121℃高壓滅菌)中，置搖床中混合30分鐘后，靜置，吸取上層懸浮液轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(組成g/gNaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰蛋白胨1％，20分鐘高壓滅菌)中，置搖床中以150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時(shí)。吸取5ml菌液加入100ml滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再在其中加入二苯并噻吩DBT-乙醇溶液使培養(yǎng)液中DBT濃度為0.1mM。在搖床中以150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2-3天后在噴有DBT的瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離。分離得到的單菌落分別接種于含DBT濃度為0.2mM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在搖床中以150轉(zhuǎn)/分30℃作用2-3天。經(jīng)生物作用后的樣品用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH為1.0，在5000轉(zhuǎn)/分下離心20分鐘，上清液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取。萃取有機(jī)相回流濃縮至1ml，進(jìn)行GC-MS分析。挑選產(chǎn)物中有二苯并噻吩DBTO2及羥基聯(lián)苯的菌株進(jìn)行優(yōu)良菌株的逐步馴化。
結(jié)果，選擇到了對(duì)二苯并噻吩具有專一性脫硫能力的Nocardiagloberula R-9菌株，其脫硫產(chǎn)物為不含硫的羥基聯(lián)苯。
實(shí)施例2制備Nocardia globerula R-9菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)的小球諾卡氏Nocardia globerula R-9菌株鉑環(huán)接種在裝有滅菌的試管中，加入已滅菌的DBT-乙醇溶液，使DBT濃度為0.1mmol，于30℃，150轉(zhuǎn)/分下在生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時(shí)。吸取培養(yǎng)獲得的菌液1ml接種在裝有100ml基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH＝7.0)的300ml錐形瓶中，再加入已滅菌的DBT-乙醇溶液，使DBT濃度為0.1-0.5mmol。將該錐形瓶放置在生物培養(yǎng)箱中于30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48小時(shí)，獲得Nocardia globerula菌株R-9細(xì)胞的液體培養(yǎng)液。
實(shí)施例3制備Nocardia globerula菌株R-9的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液將通過實(shí)施例2的方法所獲得的菌株R-9細(xì)胞的液體培養(yǎng)液離心(8000轉(zhuǎn)/分)10分鐘，倒去上層懸浮液。用適量生理鹽水洗滌離心沉淀3次，將所得離心沉淀物懸浮于生理鹽水中，然后冷凍保藏在冰箱中，即制得Nocardiagloberula菌株R-9的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液。
實(shí)施例4制備Nocardia globerula菌株R-9的粗酶萃取液將通過實(shí)施例3的方法所獲得的菌株R-9的離心細(xì)胞冷凍干燥，冷凍干燥后的細(xì)胞先在勻漿器中研磨，然后在20Hz下超聲破碎，加入適量生理鹽水后以8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄去離心沉淀的固體殘?jiān)渖蠈哟置鸽x心萃取液即為制得的Nocardia globerula菌株R-9的粗酶離心萃取液。
實(shí)施例5制備Nocardia globerula菌株R-9的固定化細(xì)胞物理吸附將清洗、干燥、滅菌后的硅藻土加入滅菌培養(yǎng)介質(zhì)，接種新鮮培養(yǎng)的Nocardia globerula菌株R-9，常溫培養(yǎng)；凝膠包埋制備海藻酸鈉溶液，滅菌，接種新鮮培養(yǎng)的Nocardiagloberula菌株R-9，把混合物分散，加入反離子溶液(鈣鹽或鋁鹽)，形成包有Nocarclia globerula株菌R-9的固定化細(xì)胞的均勻、球形、有高度微孔結(jié)構(gòu)的凝膠。
實(shí)施例6本發(fā)明在脫除二苯并噻吩(DBT)中有機(jī)硫的應(yīng)用及脫硫途徑1)將已滅菌的DBT配成 mmol/L的DBT-二甲基酰胺(也可以是乙醇)儲(chǔ)液；2)在100ml錐形瓶中依次加入滅菌培養(yǎng)基30ml、DBT-二甲基酰胺儲(chǔ)液0.06ml，使錐形瓶中DBT的濃度為0.2mmol/L；3)將實(shí)施例2獲得的Nocardia globerula菌株R-9的細(xì)胞培養(yǎng)液，或?qū)嵤├?獲得的Nocardia globerula菌株R-9的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液，或?qū)嵤├?獲得的Nocardia globerula R-9菌株的粗酶萃取液(加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)3ml或?qū)嵤├?獲得的Nocardia globerula菌株R-9的固定化細(xì)胞加入上述步驟(2)錐形瓶中，將錐形瓶放置在生物培養(yǎng)箱中，于30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，隔12小時(shí)取樣測(cè)定。
實(shí)施例2的Nocardia globerula菌株R-9的細(xì)胞培養(yǎng)液作為催化劑得到的DBT降解通過高效液相色譜測(cè)定，降解結(jié)果見圖5，圖5中的二甲基酰胺和乙醇代表的曲線即表示本方法處理DBT-二甲基酰胺或DBT-乙醇得到的降解結(jié)果圖。降解中間產(chǎn)物及產(chǎn)物通過高效液相色譜及氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀確定，降解中間產(chǎn)物及產(chǎn)物的質(zhì)譜圖見圖6，推測(cè)其降解途徑見圖7。
實(shí)施例7本發(fā)明在脫除模擬柴油體系中DBT硫的應(yīng)用其步驟如下1)將要處理的液體油品(十二烷或十六烷加二苯并噻吩)過濾滅菌，通滅菌空氣(或氧氣)使油品氧張力增加。
2)將30mL含氧液體油品從如圖4所示的反應(yīng)器進(jìn)樣孔3引入多通道輕重相反應(yīng)器，同時(shí)加入270ml滅菌水相(無機(jī)鹽培養(yǎng)基)和27mL脫硫生物催化劑；生物催化劑可以是Nocardia globerula R-9菌株的生長(zhǎng)期細(xì)菌液，也可以是Nocardia globerula R-9菌株的非生長(zhǎng)期細(xì)胞液或從細(xì)胞中萃取得到的酶液；反應(yīng)器內(nèi)徑為75mm，高120mm，體積529.9ml，有效容積300ml ml；多通道輕相分布器高30mm，上端圓形環(huán)16外徑73mm，內(nèi)徑58mm，圓形環(huán)上凹槽14外徑70mm，內(nèi)徑61mm，多通道輕相分布管17管徑為30mm。
3)將進(jìn)樣孔3密封，反應(yīng)器置于搖床培養(yǎng)箱中，空氣經(jīng)過濾滅菌后由上部通氣管2引入，搖床溫度控制為30℃，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速使多通道輕重相反應(yīng)器的上層輕油相18高于圓形環(huán)16，溢于凹槽14中，通過輕重相分布管17到達(dá)反應(yīng)器底部，呈油珠冒出，由于比重小，又會(huì)由反應(yīng)器底部浮至反應(yīng)器上方，從而完成輕油相與重相中微生物發(fā)生反應(yīng)的過程。
4)液體油品經(jīng)生物脫硫催化劑作用后，從反應(yīng)器外管上部輕相取樣孔6吸取脫硫后的液體油品，從下部重相取樣孔8放出剩余的生物催化劑及培養(yǎng)液。
5)反應(yīng)后剩余的含有生物催化劑的液體產(chǎn)物經(jīng)離心分離、洗滌，在適宜的條件下再生。
實(shí)施例3獲得的Nocardia globerula菌株R-9的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞液作為催化劑加入十六烷-二苯并噻吩中，得到的降解速率如圖5所示。
實(shí)施例8本發(fā)明在脫除加氫脫硫后柴油中的硫的應(yīng)用將實(shí)施例7中的模擬柴油系換為過濾滅菌的不同加氫脫硫后的柴油，其他操作步驟和方法同實(shí)施例7。生物催化劑作用前后柴油中硫含量的氣相色譜-原子發(fā)射光譜(GC-AED)檢測(cè)結(jié)果見表3。由表中結(jié)果可以看出，本發(fā)明提供的菌株可以深化脫除加氫柴油中的雜環(huán)有機(jī)硫，對(duì)于總硫含量為925mg/L的加氫柴油，該菌株可以脫除41％的硫，其中DBT被完全脫除，而對(duì)于總硫含量為261mg/L的加氫柴油，該菌株可以脫除65％的硫，其中DBT也被完全脫除。
表3硫含量，mg/L雜環(huán)硫化合物柴油樣品1生物脫硫 柴油樣品2生物脫硫二苯并噻吩 2.5 --- --- ---4-乙基二苯并噻吩 17.6 14.8 4.1 1.94，6-二甲基二苯并85.0 79.3 45.9 16.9噻吩 (7％) (63％)2，4-二甲基二苯并47.5 41.3 10.4 4.1噻吩2，8-二甲基二苯并63.5 56.6 12.5 4.7噻吩1，2-二甲基二苯并45.0 40.8 24.4 7.6噻吩2，4，6-三甲基二苯并 52.2 31.3 17.3 6.3噻吩C3-二苯并噻吩 49.2 40.9 13.5 7.2C3-二苯并噻吩 51.9 18.1 10.2 4.8總硫 925 545 261 91總硫脫除率％ 41％ 65％
權(quán)利要求
1.一種小球諾卡氏菌菌株Nocardia globerula R-9，保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為CGMCC NO.0570。
2.權(quán)利要求1所述的小球諾卡氏菌菌株Nocardia globerula R-9在在脫除含硫化石燃料中有機(jī)硫的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的小球諾卡氏菌菌株Nocardia globerula R-9的應(yīng)用，其特征在于在采用Nocardia globerula R-9菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物脫除含硫化石燃料由的硫。
4.如權(quán)利要求2所述的小球諾卡氏菌菌株Nocardia globerula R-9的應(yīng)用，其特征在于在采用Nocardia globerula R-9菌株的非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞脫除含硫化石燃料中的硫。
5.如權(quán)利要求2所述的小球諾卡氏菌菌株Nocardia globerula R-9的應(yīng)用，其特征在于在采用Nocardia globerula R-9菌株的粗酶萃取液脫除含硫化石燃料中的硫。
6.如權(quán)利要求2所述的小球諾卡氏菌菌株Nocardia globerula R-9的應(yīng)用，其特征在于在采用Nocardia globerula R-9菌株的固定化細(xì)胞脫除含硫化石燃料中的硫。
7.如權(quán)利要求2所述的小球諾卡氏菌菌株Nocardia globerula R-9的應(yīng)用，其特征在于在含硫化石燃料為煤炭或石油。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小球諾卡氏菌Nocardia globerulaR－9，并于2002年7月29日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO.0781。該菌株的液體培養(yǎng)、固定化細(xì)胞、非生長(zhǎng)期靜止細(xì)胞和粗酶萃取液均可通過氧化斷裂C－S鍵途徑脫除含硫有機(jī)化合物中的雜環(huán)硫。該菌株專一性地脫除燃料中的雜環(huán)硫而不破壞有機(jī)化合物的C－C骨架，不降低燃料的燃燒熱值，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12S1/02GK1508245SQ0215568
公開日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者姜成英, 邢建民, 羅明芳, 緱仲軒, 劉會(huì)洲, 安震濤, 陳家鏞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所