專利名稱：新型腈水合酶的制作方法
本申請(qǐng)是1997年2月13日提交的、發(fā)明名稱為“新型腈水合酶”的97110241.4號(hào)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及一種新型氨基酸序列，它含有來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095(下文稱作嗜熱假諾卡氏菌)的腈水合酶的α-亞單位和β-亞單位，且本發(fā)明涉及一種編碼所述酶的α-亞單位和β-亞單位的新型基因序列。此外，本發(fā)明涉及一種含有所述基因地重組質(zhì)粒及一種用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體菌株，且本發(fā)明涉及一種用所述轉(zhuǎn)化體菌株生產(chǎn)腈水合酶的方法，本發(fā)明還涉及一種方法，它包括用一種經(jīng)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體菌株細(xì)胞獲得的培養(yǎng)物，用培養(yǎng)細(xì)胞或用一種經(jīng)加工培養(yǎng)細(xì)胞獲得的產(chǎn)物處理一種腈化合物，從而由所述的腈化合物生產(chǎn)相應(yīng)的酰胺化合物。
關(guān)于通過水合腈化合物的腈基而將它轉(zhuǎn)化成酰氨基，從而由所述的腈化合物生產(chǎn)相應(yīng)的酰胺化合物的技術(shù)，到現(xiàn)在為止已有的公知化學(xué)方法是在有酸或堿存在的情況下或在有銅催化劑存在的情況下加熱腈化合物。
另一方面，近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一各酶，即腈水合酶，它具有一種通過水合腈基而將它轉(zhuǎn)化成酰胺基的腈水合活性，并且已經(jīng)公開了用所述酶或含有所述酶的微生物細(xì)胞處理腈化合物，從而由所述腈化合物生產(chǎn)相應(yīng)酰胺化合物的方法(見日本專利公開56-17918，62-21519，62-31914，59-37951，4-4873和6-55148)。已知這些方法更優(yōu)于常規(guī)的化學(xué)方法，即由腈化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)酰胺化合物的轉(zhuǎn)化率和選擇性是前者高于后者。
為了用這類腈水合酶由腈化合物大規(guī)模生產(chǎn)酰胺化合物，重要的是相對(duì)于用所述酶生產(chǎn)酰胺化合物中的生產(chǎn)成本來說，要降低在所述酶生產(chǎn)中的生產(chǎn)成本。更具體地說，對(duì)于這一問題，有必要提高每單位細(xì)胞重量和每單位時(shí)間生產(chǎn)酰胺化合物(下文稱作細(xì)胞活性)的生產(chǎn)率。根據(jù)得到的情況，已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試來克隆所述的酶，即腈水合酶，以便使用所述酶的基因通過基因工程方法，來表達(dá)大量的所述酶。例如，公知的方法有使用棒狀桿菌屬的細(xì)胞(見日本未審公開的專利申請(qǐng)2-119778)，使用假單胞桿菌屬的細(xì)胞(見日本未審公開的專利申請(qǐng)3-251184)，使用玫瑰紅球菌(Rhodococcus rhodoclous)的細(xì)胞(見日本未審公開的專利申請(qǐng)4-211379)，使用根瘤菌屬的細(xì)胞(見日本未審公開的專利申請(qǐng)6-25296)，或使用克雷伯氏桿菌屬的細(xì)胞(見日本來審公開的專利申請(qǐng)6-303971)。然而，對(duì)于棒狀桿菌屬和玫瑰紅球菌(Rhodococcus rhodoclous)來說，據(jù)報(bào)道用任意這些菌轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的腈水合酶活性是極弱的(見TI BTECH Vol.10，pp.402-408，1992)。因此，通過這類基因工程方法，不可能總是獲得所需的具有高細(xì)胞活性的轉(zhuǎn)化體。
我們(本發(fā)明人)已經(jīng)首次成功地從嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的細(xì)胞(我們發(fā)現(xiàn)它具有一種腈水合酶活性)中分離出一種腈水合酶基因，并且明確了它的氨基酸序列和基因序列。我們還成功地形成了能夠表達(dá)大量所述基因的基因重組細(xì)胞。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，我們已經(jīng)完成了本發(fā)明。
具體地說，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供來源于嗜熱假諾卡氏菌腈水合酶的氨基酸序列和基因序列。本發(fā)明的其它目的是提供一種具有所述基因的重組質(zhì)粒，一種具有所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，一種用所述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞生產(chǎn)所述酶的方法，以及一種用所述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞處理腈化合物，從而由它生產(chǎn)相應(yīng)酰胺化合物的方法。


圖1表示質(zhì)粒pPT-B1的限制性內(nèi)切核酸酶的切割圖譜。
圖2表示質(zhì)粒pPT-DB1的限制性內(nèi)切核酸酶的切割圖譜。
在這些圖中
Amp表示一種編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因，
ORI表示在一種ColE1系統(tǒng)中復(fù)制起始位點(diǎn)，
lacPO表示在來源于pUC18的乳糖操縱子中的啟動(dòng)子和操作基因區(qū)，
NHα表示一種編碼來源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的α-亞單位的基因，
NHβ表示一種編碼來源于嗜熱假諾卡氏菌腈水合酶的β-亞單位的基因，
且(XbaI/Nspv)表示鈍端化后所得到XbaI和NspV之間用于自身連接的位點(diǎn)。
現(xiàn)在，下文將描述本發(fā)明。本發(fā)明的腈水合酶基因基本上含有序列表中序列號(hào)1和序列號(hào)2的氨基酸序列。然而，就是在從一種具有相同堿基序列基因的模板中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程中，可以將一種或多種接近氨基酸序列N-未端的氨基酸缺失或者可以將一種或多種氨基酸增加到氨基酸序列的N-末端上，從而得到具有與原始突變體相同酶促活性的突變體，這要取決于將基因?qū)氲乃拗黝愋?，?gòu)成用于培養(yǎng)宿主的營養(yǎng)培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)基的組成，和用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的溫度和pH值，并且還取決于通過基因表達(dá)，胞內(nèi)酶在其生產(chǎn)后的修飾。此外，隨著目前重組DNA技術(shù)的進(jìn)展，通過在酶的氨基酸序列中取代，缺失或增加一種或多種氨基酸，已經(jīng)能夠相對(duì)容易地修飾一種酶而基本上不改變其活性。而且，近來已作了各種嘗試來生產(chǎn)具有增加工業(yè)價(jià)值的突變體酶，例如，通過在酶的氨基酸序列中取代，缺失或增加一種或多種氨基酸，具有改善的有機(jī)溶劑的抗性或具有多種底物特異性。鑒于本領(lǐng)域中這類技術(shù)的水平，本文中稱作的腈水合酶不僅包括那些具有序列表中序列號(hào)1和2的氨基酸序列的酶，而且包括具有通過在所述氨基酸序列中取代，缺失或增加一種或多種氨基酸而修飾的氨基酸序列的任意其它突變體(條件是它們具有所需的腈水合酶活性)，并且本發(fā)明包括具有任意這類氨基酸序列和這類修飾的氨基酸序列的任何腈水合酶。
具體地說，本發(fā)明是指含有α-亞單位和β-亞單位的腈水合酶，其中α-亞單位具有序列表中序列號(hào)1的205個(gè)氨基酸的氨基酸序列，β-亞單位具有序列表中序列號(hào)2的233個(gè)氨基酸的氨基酸序列。不用說，本發(fā)明包括下述任何腈水合酶，即它們含有(作為組成成份)通過在序列表中序列號(hào)1和2的氨基酸序列中部分取代，缺失或增加一種或多種氨基酸而構(gòu)建的修飾的α-亞單位和β-亞單位中的一種或者兩者都含有，并且它們具有一種腈水合的活性。
在本發(fā)明中，通過序列表中序列號(hào)1的205個(gè)氨基酸的氨基酸序列來表達(dá)的α-亞單位的編碼堿基序列，落入構(gòu)成本發(fā)明腈水合酶的α-亞基的編碼基因范圍內(nèi)。此外，只要任何蛋白質(zhì)含有通過在序列表中序列號(hào)1的氨基酸序列中部分取代，缺失或增加一種或多種氨基酸來構(gòu)建的任何修飾的α-亞基，作為組成成份，且它們具有一種腈水合的活性，那么任何編碼這種修飾的α-亞單位的堿基序列都落入本發(fā)明的腈水合酶基因的范圍內(nèi)。同樣，在本發(fā)明中，通過序列表中序列號(hào)2的233個(gè)氨基酸的氨基酸序列來表達(dá)β-亞單位的編碼堿基序列落入構(gòu)成本發(fā)明腈水合酶的β-亞單位的編碼基因范圍內(nèi)。此外，還是同樣地，只要任何蛋白質(zhì)含有通過在序列表中序列號(hào)2的氨基酸序列中部分取代，缺失或增加一種或多種氨基酸而構(gòu)建的修飾的β-亞單位作為組成成份，且它們具有一種水合腈的活性，那么任何編碼這種修飾的β-亞單位的編碼堿基序列都在本發(fā)明的腈水合酶基因范圍內(nèi)。
本發(fā)明的腈水合酶基因基本上含有序列表中序列號(hào)3和4的堿基序列。然而，隨著目前重組DNA技術(shù)的進(jìn)展，使用任何其它的堿基序列，已經(jīng)能夠相對(duì)容易地取代作為基因翻譯中模板的DNA堿基序列，從而生產(chǎn)一種酶，且基本上不改變所述酶的氨基酸序列。此外，通過在作為基因翻譯中模板的DNA堿基序列中進(jìn)行取代，缺失或添加已經(jīng)能夠?qū)⒁环N酶的氨基酸序列修飾到通過在其中取代，缺失或添加一種或多種組成的氨基酸而修飾過的酶中，且基本上不改變酶的酶促活性，從而生產(chǎn)所需的酶。鑒于本領(lǐng)域中這類技術(shù)的水平，本文稱作的腈水合酶基因不僅包括那些具有序列表中序列號(hào)3和4的DNA堿基序列的基因，而且包括具有通過在所述DNA堿基序列中取代，缺失或添加一種或多種堿基而修飾的DNA堿基序列的任何其它突變體，條件是對(duì)于具有腈水合酶活性的蛋白質(zhì)來說，它們能夠起到模板作用。具體地說，本發(fā)明涉及編碼一種腈水合酶的基因，其中α-亞單位含有序列表中序列號(hào)3的618個(gè)堿基的堿基序列，而β-亞單位含有序列表中序列號(hào)4的702個(gè)堿基的堿基序列。此外，在本發(fā)明中，只要任何蛋白質(zhì)含有一種氨基酸序列的α-亞單位和一種氨基酸序列的β-亞單位中的一種或兩者都含有作為其組成成份，該蛋白質(zhì)具有一種腈水合活性，并且其中氨基酸的α-亞單位是由在序列表中序列號(hào)3的堿基序列中進(jìn)行部分取代，缺失或添加來構(gòu)建的任何修飾的堿基序列所編碼的，而其中氨基酸序列的β-亞單位是由在序列表中序列號(hào)4的堿基序列中進(jìn)行部分取代，缺失或添加來構(gòu)建的任何修飾的堿基所編碼的，那么這類修飾的α-亞單位和β-亞單位中的一種或兩種的任何編碼基因都落入本發(fā)明腈水合酶基因的范圍內(nèi)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種重組質(zhì)粒的構(gòu)建，所述的重組質(zhì)粒具有插入其中的本發(fā)明腈水合酶基因，且本發(fā)明還包括用所述重組質(zhì)粒將任何所需微生物轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化體的過程。此外，本發(fā)明還包括所需要酶的生產(chǎn)，它通過將所得的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞在普通營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)來進(jìn)行，本發(fā)明還包括酰胺化合物的生產(chǎn)，它通過將所述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞(可生產(chǎn)所所需的酶)在含水培養(yǎng)基中與腈化合物接觸而將所述腈化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)酰胺化合物。
本發(fā)明重組質(zhì)粒是一種通過將腈水合酶基因插入一種質(zhì)粒載體而構(gòu)建的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒載體中具有一種用來表達(dá)所述基因所必需的控制區(qū)和一種用于所述基因進(jìn)行自我復(fù)制所必需的區(qū)。能將這種質(zhì)粒導(dǎo)入任何所需的宿主中，從而使它生產(chǎn)酶，即腈水合酶。作為本文中有使用價(jià)值的宿主，所提到的是大腸桿菌(如下面的實(shí)施例所述)，然而，它不具有限制性。除此之外，任何其它屬的微生物，象芽胞桿菌屬(諸如枯草芽胞桿菌)，酵母菌，放線菌及其它也是有使用價(jià)值的。用于表達(dá)的必需的控制區(qū)含有一種啟動(dòng)子序列(包括用于控制轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列)，一種核糖體結(jié)合序列(SD序列)和一種轉(zhuǎn)錄終止序列。具體地說，該啟動(dòng)子序列包括來源于大腸桿菌的一種色氨酸操縱子的trp啟動(dòng)子和一種乳糖操縱子的Lac啟動(dòng)子，來源于λ噬菌體的一種PL啟動(dòng)子和一種PR啟動(dòng)子，以及來源于枯草芽胞桿菌的一種葡糖醛酸合成酶啟動(dòng)子(gnt)，一種堿性蛋白酶啟動(dòng)子(apr)，一種中性蛋白酶啟動(dòng)子(npr)和一種α-淀粉酶啟動(dòng)子(amy)。除這些之外，本文中有使用價(jià)值的還有一種tac啟動(dòng)子和已經(jīng)將它們本身修飾或設(shè)計(jì)好的類似物。核糖體結(jié)合序列包括(例如)那些來源于大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的序列和作為本發(fā)明中嗜熱假諾卡氏菌固有的序列。這些序列中的任何一種在本發(fā)明中都有使用價(jià)值，只要是它能在諸如大腸桿菌和枯草芽胞桿菌這樣所需要的宿主中起作用，即沒有特殊限制。例如，一種一致性序列含有一系列4個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的堿基，這些堿基與16S核糖體RNA的3′-末端區(qū)互補(bǔ)，通過DNA合成可以制備上述一致性序列，并可以將它在本文中用作核糖體結(jié)合序列。轉(zhuǎn)錄終止序列不總是必須的，然而，對(duì)它來說，有使用價(jià)值的是一種不依賴于任何p-因子的序列，例如，一種脂蛋白終止子或一種trp操縱因終止子。對(duì)于重組質(zhì)粒上的控制區(qū)序列，需要的是啟動(dòng)子序列，核糖體結(jié)合序列，腈水合酶基因和轉(zhuǎn)錄終止序列從區(qū)的5′-末端上游端開始，按照次序排列。在這類控制區(qū)中，可以將α-亞單位基因和β-亞單位基因表達(dá)成各自獨(dú)立的順反子，或(換句話說)可以使用為兩者共有的相同控制區(qū)，按照多順反子的方式，將上述兩者一起進(jìn)行表達(dá)。
作為滿足上述要求的質(zhì)粒載體實(shí)例，提到的是PBR 322，pUC18，BluescriptII SK(t)，pKK223-3和PSC101，它們都具有一種可在大腸桿菌中進(jìn)行自我復(fù)制的區(qū)；所提到的還有pUB110，PTZ4，PC194，P11，_1和_105，它們都具有一種可在枯草芽胞桿菌中進(jìn)行自我復(fù)制的區(qū)。作為可在兩種或多種不同宿主中進(jìn)行自我復(fù)制的質(zhì)粒載體實(shí)例，提到的是pHV14，TRp7，YEp7和PBS7。
將編碼本發(fā)明腈水合酶的基因插入到具有表達(dá)所述基因所必需區(qū)的質(zhì)粒載體中，從而構(gòu)建本發(fā)明所需的重組質(zhì)粒的方法；用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一種需要的宿主的方法和在所得的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明所需的腈水合酶的方法，對(duì)于上述三個(gè)方法來說，可以使用分子生物學(xué)，生物工程和基因工程領(lǐng)域中一般公知的任何普通方法和宿主，諸如“分子克隆，第二版”(“MokcularCloning.Znd Edition”)中所述(T.Maniatis ed al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1988)。作為用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的培養(yǎng)基，一般使用的是LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基。更優(yōu)選的是，用在本發(fā)明中的這些培養(yǎng)基含有Fe離子和Co離子，它們的量是0.1μg/ml或更多。
為了通過利用按上述方式制備的本發(fā)明的腈水合酶或轉(zhuǎn)化體細(xì)胞，而由一種腈化合物生產(chǎn)相應(yīng)的酰胺化合物，將一種需要的腈化合物在一種含水介質(zhì)中與下列物質(zhì)接觸，這些物質(zhì)是轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的培養(yǎng)物，或從轉(zhuǎn)化體細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞本身，或通過加工轉(zhuǎn)化體細(xì)胞而生產(chǎn)的一種產(chǎn)物，或從轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中分離并純化的一種腈水合酶。用于接觸的溫度不需特別確定，但優(yōu)選在半將水合酶不失活的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0℃到50℃的范圍內(nèi)。所處理的腈化合物不需特別確定，條件是它可以是一種底物，在這種底物上，本發(fā)明的腈水合酶能夠起作用。然而，優(yōu)選的是它包括(例如)具有2至4個(gè)碳原子的腈化合物，典型的諸如乙腈，丙腈，丙烯腈，甲基丙烯腈，正丁腈，異丁腈，丁烯腈和α-羥基異丁腈。腈化合物在含水介質(zhì)中的濃度不需特別確定，條件是它在不超過所述介質(zhì)中腈化合物最大溶解度的范圍內(nèi)。然而，考慮到酶的活性不被腈化合物所滅活，因此優(yōu)選腈的濃度可以是5％(按重量計(jì))或更低，更優(yōu)選2％(按重量計(jì))或更低。
將一系列步驟在下文中進(jìn)行總結(jié)，在明確來源于嗜熱假諾卡氏菌的、序列表中序列號(hào)1至4的腈水合酶的氨基酸序列和堿基序列之前，我們(本發(fā)明人)已經(jīng)使用了這些步驟。已將嗜熱假諾卡氏菌JCM3095保藏在日本的微生物保藏中心[Japan Collection of Microorganisms，The Institute ofPhysical and Chemical Research(RIKEN)of 2-1，Hirosawa，Wako-shi，Saitama-Ken，Japan)，保藏號(hào)JCM3095，現(xiàn)在任何需要它的人都能得到。
(1)將菌株細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分離，破碎，并將它們進(jìn)行硫酸銨分級(jí)分離，陰離子交換層析，凝膠過濾層析和疏水層析，由此從其中分離并純化腈水合酶，將這種腈水合酶α-亞單位和β-亞單位N-末端上7個(gè)殘基的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)序。
(2)以這樣測(cè)序的N-末端的氨基酸序列為基礎(chǔ)，制備用于基因擴(kuò)增的寡核苷酸引物。從細(xì)胞中制備一種染色體DNA。通過使用這些引物和染色體DNA作為模板的PCR，得到擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物。
(3)用限制性內(nèi)切核酸酶將染色體DNA進(jìn)行部分?jǐn)嗔眩瑥亩占瘡募s1500bp至約4000bp的DNA片段。將每個(gè)DNA片段與一種質(zhì)粒載體連接，用這種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化成一種質(zhì)粒庫。
(4)通過使用上述(2)中獲得的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物作為探針，進(jìn)行菌落雜交，從質(zhì)粒庫選擇含有編碼腈水合酶的DNA片段的陽性克隆。
(5)從陽性克隆中提取出質(zhì)粒DNA，且將插入片段的整個(gè)堿基序列進(jìn)行測(cè)序，從而確定了腈水合酶的α-亞單位和β-亞單位的編碼基因堿基序列。將可從這樣測(cè)序堿基序列推定的α-亞基和β-亞基的氨基酸序列與上述(1)中獲得的兩種亞基的7個(gè)殘基的N-末端氨基酸序列進(jìn)行比較，可以證明上述測(cè)序的堿基序列可編碼腈水合酶。
(6)將含有腈水合酶基因的DNA片段從上述(4)中獲得的陽性克隆質(zhì)粒中重新制備，并將這種DNA片段插入一種具有適合啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體。
(7)將上述(6)中獲得的質(zhì)粒導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞中以便獲得轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。將這些轉(zhuǎn)化體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并將它們從培養(yǎng)物中分離。然后將這些細(xì)胞在一種含水介質(zhì)中保持與丙烯腈接觸，因此確定了丙烯酰胺的形成。
現(xiàn)在，參照下面的實(shí)施例來更具體地描述本發(fā)明，然而，不將這些實(shí)施例用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
從嗜熱假諾卡氏菌JCM3095中純化腈水合酶
在50℃時(shí)，將嗜熱假諾卡氏菌JCM3095細(xì)胞在一種含有0.2％的甲基丙烯酰胺的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(pH7.5)中培養(yǎng)3天。通過離心培養(yǎng)物(8000×G，30分鐘)而獲得3g的濕細(xì)胞。將這些濕細(xì)胞懸浮在7g的KPB(0.1M磷酸鉀緩沖液；pH7.0)中，并使用一種超聲細(xì)胞破碎器將它們破碎，從而得到一種含有細(xì)胞碎片的液體。將2.7g的硫酸銨加入到這種含有細(xì)胞碎片的液體中，在4℃時(shí)，將這種液體緩慢地進(jìn)行攪拌1小時(shí)，然后將它離心(25000×G，30分鐘)以便從其中除去不溶性固體。將1.2g的硫酸銨加入到90g的所得上清液中，在4℃時(shí)，將這些上清液緩慢地?cái)嚢?小時(shí)，然后將它離心(25000×G，30分鐘)以便收集沉淀物。將沉淀物溶于1ml的KPB，在4℃時(shí)，用2升相同的KPB將它進(jìn)行透析，時(shí)間是48小時(shí)。使用一種Toso的DEAE-TOYOPEARL 650M柱(柱的尺寸5×6_cm)將所得透析物進(jìn)行陰離子交換層析，使用KPB作為展開劑，通過用從0M到0.5M氯化鉀進(jìn)行梯度洗脫，從其中得到一種具有腈水合酶活性的組分。接下來，使用Pharmacia的SUPERDE×200-26/60作為載體，并使用含有0.2M氯化鉀的KPB作為展開劑，將所得的活性組分進(jìn)行凝膠過濾層析，從其中回收到具有腈水合酶活性的組分。然后，使用一種Toso的TSK Gel Phenyl-5PW柱(用于HPLC)，將這些活性組分進(jìn)行疏水層析。在這一過程中，已用含有20％飽和濃度硫酸銨的KPB將柱進(jìn)行飽和，將活性成分吸附到這種柱中的載體上，然后用一種含有硫酸銨(將它的濃度按線性梯度從20％的飽和度降至0％的飽和度)的洗脫劑通過梯度洗脫而將上述活性成分進(jìn)行洗脫，從而獲得一種活性組分。
在這些層析處理中，將每個(gè)組分中的腈水合酶活性按下述方式進(jìn)行測(cè)定。將每個(gè)組分用KPB進(jìn)行適當(dāng)稀釋，向其中加入1％(按重量計(jì))的丙烯腈，并在10℃時(shí)，將它們進(jìn)行反應(yīng)10分鐘。向這種反應(yīng)混合物中加入一種1M的磷酸水溶液(與反應(yīng)混合物的量相同)，從而終止反應(yīng)。然后，通過HPLC分析來測(cè)定這樣形成的丙烯酰胺濃度。在這一過程中，所用的是ULTRON80HG(50×8_mm)作為HPLC柱，將一種10mM磷酸水溶液展開劑用于這種柱。通過測(cè)量220nm處的吸收度來測(cè)定所形成丙烯酰胺的量。
在一種還原條件下，將通過疏水層析獲得的活性組分進(jìn)行SDS-PAGE，它表明了29K道爾頓和32K道爾頓的兩種主要多肽鏈和三種45K道爾頓或更高的次要多肽鏈的存在。在一種還原條件下，普通腈水合酶的SDS-PAGE一般得到兩種30+/-3K道爾頓的多肽鏈。29K道爾頓和32K道爾頓的兩種主要多肽鏈中的每種都存在于SDS-PAGE凝膠中，使用一種Sartorius′并干電印跡儀(Sartorius′semi-dry Electrobotter)，將上述兩種主要多肽鏈中的每種都吸附到一種Bio Rad′s PVDE膜上。僅將已吸附在這種膜上的所需多肽鏈的部分從PVDE膜中切下，并使用一種Shimadzu的肽測(cè)序儀PSQ-1將多肽鏈的N-末端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)29K道爾頓多肽鏈的N-末端氨基酸序列是THr-Gl U-Asn-Ile-Leu-Arg-Lys，它與序列表中序列號(hào)1氨基酸序列的第2至第8氨基酸殘基一致，且32道爾頓多肽鏈的N-末端氨基酸序列是Met-Asn-Gly-Val-Tyr-Asp-Val，它與序列表中序列號(hào)2氨基酸序列的第1至第7氨基酸殘基一致。
實(shí)施例2
從嗜熱假諾卡氏菌JCM3095中分離腈水合酶。
按照與實(shí)施例1中相同的方式將嗜熱假諾卡氏菌JCM3095細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)物進(jìn)行離心(8000×G，30分鐘)以便從中收集2g的濕細(xì)胞。向這些中加入40ml含有0.15M NaCl的50mM EDTA·2Na(PH8.0)的水溶液，從而制備一種細(xì)胞懸浮液，然后將這種懸浮液在90℃時(shí)煮沸10分鐘。將所得懸浮液冷卻至37℃，向其中加入100mg的蛋白溶菌酶并在37℃時(shí)保持1小時(shí)。接下來，向其中加入30mg，2000U/mg的酶解酶(zymolylase)，并在37℃時(shí)保持1小時(shí)。接著，向其中加入5mg，20U/mg的蛋白酶K，并保持37℃1小時(shí)。此外，向其中加入2ml的10％SDS溶液并在65℃時(shí)保持1小時(shí)，然后立即將該體系進(jìn)行苯酚/氯仿萃取。確切地說，將用TE(含有1mM EDTA·2Na的10mM Tris-HCl緩沖液；PH8.0)飽和的42ml苯酚加入到這種反應(yīng)混合物中并將它們緩慢地進(jìn)行攪拌。將該體系進(jìn)行離心(3000rpm，10分鐘)以便將它分離成一種水相和一種有機(jī)相，并僅收集水相。向這種水相中加入21ml上述TE飽和的苯酚和21ml的氯仿，并將它緩慢地?cái)嚢琛Ｈ缓?，再次將它離心(3000rpm，10分鐘)以便將它分離成一種水相和一種有機(jī)相；并僅收集水相。向這種水相中加入42ml的氯仿并將它緩慢地?cái)嚢?。然后，仍再次將它離心(3000rpm，10分鐘)以便將它分離成一種水相和一種有機(jī)相，并僅收集水相。向這種水相中加入含有1.1M NaCl的4ml TE和92ml的乙醇，然后將它在室溫時(shí)保存一會(huì)兒。將這樣沉淀的絲狀DNA通過將它纏繞在一種玻璃棒上來收集。通過按照70％，80％和90％的順序使用乙醇的水溶液進(jìn)行處理而去除其中的水分，然后將它在空氣中干燥。接下來，將這樣收集的DNA再次溶于40ml的TE中。向其中加入30μg的RNaseA，并在37℃時(shí)保持1小時(shí)。接著，使用一種限制性內(nèi)切核酸酶BamHI將這種DNA進(jìn)行部分?jǐn)嗔?。通過苯酚/氯仿萃取，隨即經(jīng)乙醇沉淀將這樣部分?jǐn)嗔训腄NA再次純化，并將它溶于TE，從而得到一種最終濃度，是1.0μg/μl。
以29K道爾頓和32K道爾頓多肽鏈的N-末端氨基酸序列(在實(shí)施例1中已將它們測(cè)序)為基礎(chǔ)，制備下面四種PCR引物。
引物15′-ACNGARAAYATNYTNMGNAA-3′
引物25′-TTNCKNARNATRTTYTCNGT-3′
引物35′-ATGAAYGGNGTNTAYGANGT-3′
引物45′-ACNTCRTANACNCCRTTCAT-3′
序列表中序列號(hào)5的引物1，和序列表中序列號(hào)6的引物2，分別與DNA鏈的互補(bǔ)鏈相對(duì)應(yīng)，而該DNA鏈又與29K道爾頓多肽鏈的N-末端氨基酸序列相反。序列表中序列號(hào)7的引物3，和序列表中序列號(hào)8的引物4，分別與相應(yīng)的DNA鏈的互補(bǔ)鏈對(duì)應(yīng)，而該DNA鏈又與32K道爾頓多肽鏈的N-末端氨基酸序列相反。在這些引物中，N表示A，C，G或T。
將上文中已部分?jǐn)嗔训?μg染色體DNA(將它用作模板)進(jìn)行PCR。確切地說，對(duì)于PCR反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)100μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有3μg的DNA，200ng的引物1，200ng的引物4和5U的Taq DNA聚合酶。反應(yīng)1由40個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在94℃時(shí)熱變1分鐘，在37℃時(shí)退火1分鐘和在72℃時(shí)鏈擴(kuò)增1分鐘。對(duì)于PCR反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)100μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有3μg的DNA，200ng的引物2，200ng的引物3和5U的TaqDNA聚合酶。反應(yīng)2由40個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)l中的內(nèi)容相同。在PCR后，將反應(yīng)1和2每個(gè)反應(yīng)中獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)來自反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增的產(chǎn)物，這種檢測(cè)表明了僅從PCR反應(yīng)2獲得反應(yīng)混合物中約700bp擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。這證明在嗜熱假諾卡氏菌中，存在一種32K道爾頓的基因和一種29K道樂頓的基因，同時(shí)，它們按照從結(jié)合這些基因的5′末端上游區(qū)的順序彼此互相鄰接。
將上文中用BamHI部分?jǐn)嗔训娜旧wDNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)瓊脂糖，Sigma的VII型，瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是0.6％)，并將一種含有從約1500bp至約4000bp DNA片段的瓊脂糖塊從瓊脂糖凝膠中切下。將這種瓊脂糖塊(約0.5g)精細(xì)地粉碎，將其懸浮在5ml的TE中，并將其在55℃時(shí)加熱1小時(shí)，從而將這種瓊脂塊在TE中完全熔化。將所得的瓊脂糖熔化物如上所述進(jìn)行相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，由此純化DNA片段。按照這種方式，制備至少10pmol量的這樣純化的DNA片段，并使用一種Takara Shuzo的DNA連接試劑盒，將上述DNA片段插入BamHI位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于一種質(zhì)粒載體PUC18(由Takara Shuzo生產(chǎn))中的多克隆位點(diǎn)，在用于這種連接以前，用一種限制性內(nèi)切核酸酶BamHI將PUC18質(zhì)粒載體DNA進(jìn)行切割，然后通過苯酚/氯仿苯取和乙醇沉淀將其純化，使用一種堿性磷酸酶(由Takara Shuzo生產(chǎn))將它的5′末端進(jìn)行去磷酸化，并再次通過苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀將其純化。將已按這種方式加工并純化的20ngpUC質(zhì)粒載體DNA用于連接中。
使用這樣連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101的感覺態(tài)細(xì)胞(高感受態(tài)，由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))。將含有這樣轉(zhuǎn)化細(xì)胞的10μl液體加在一種含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)皿(0.5wt％Bacto酵母菌提取物，1wt％Bacto胰蛋白胨，0.5wt％氯化鈉，1.5wt％瓊脂；pH7.5)上，并將它們?cè)?7℃時(shí)培養(yǎng)過夜。這樣獲得了許多實(shí)驗(yàn)皿，它們每個(gè)都含有其中已出現(xiàn)100至1000個(gè)集落/皿的培養(yǎng)基。
使用已在上文中制備的PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物作為探針，將含有染色體DNA的質(zhì)粒文庫進(jìn)行菌落雜交，隨即進(jìn)行篩選，從而選擇含有所需腈水合酶基因的克隆。
確切地說，將一種尼龍膜(Amersham的Hybond-N)緩慢放在每個(gè)質(zhì)粒文庫的平皿上，在約1分鐘后，將該膜緩慢地剝落。然后將這種剝下的膜浸入一種變性液體(含有1.5M NaCl的0.5M NaOH水溶液)中7分鐘，隨即將這種膜用一種中和液體(含有1.5M NaCl和1mMEDTA·2Na的0.5M Tris-HCl水溶液)處理3分鐘。將這種中和作用重復(fù)兩次。接下來，將這種膜用2×SSC(1×SSC是一種含有8.76g氯化鈉和4.41g檸檬酸鈉的1升水溶液)洗滌一次，并將它放在干燥的濾紙上，在濾紙上將該膜于空氣中進(jìn)行干燥。將紫外線UV以120mJ/cm2作用于該膜；通過它將DNA固定在該膜上。在42℃時(shí)，通過將它們浸入30ml/膜的一種雜交緩沖液(5×SSC進(jìn)一步含有1wt％脫脂牛奶，0.1wt％N-月桂酰肌氨酸，0.02wt％ SDS和50wt％甲酰胺)中2小時(shí)，從而將這樣處理的膜進(jìn)行預(yù)雜交。另一方面，使用已在上文中制備的PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物作為模板，并使用一種BoehringerMannheim的DIG-DNA標(biāo)記試劑盒，制備一種熒光標(biāo)記探針。將100ng的熒光標(biāo)記探針和300ng的pUC18質(zhì)粒DNA(通過在95℃時(shí)煮沸10分鐘而已將它們加熱變性后)轉(zhuǎn)換到10ml有預(yù)雜交膜的雜交緩沖液。在42℃時(shí)，將它們?cè)隗w系中進(jìn)行雜交24小時(shí)以后，將膜在室溫下用含有0.1wt％ SDS的150ml 2×SSC洗滌兩次。接下來，在68℃時(shí)，將該膜再次用含有0.1wt％ SDS的150ml×SSC洗滌兩次，時(shí)間是5分鐘。將該膜用100ml的一種緩沖液A(含有0.3wt％吐溫20和0.15M NaCl的0.1M馬來酸緩沖液，pH7.5)進(jìn)一步洗滌5分鐘，然后在室溫時(shí)，將它在一種緩沖液B(含有0.3wt％吐溫20，0.15M NaCl和1wt％脫脂牛奶的0.1M馬來酸緩沖液；pH7.5)中阻遏30分鐘。接著，在室溫時(shí)將這種膜用300ml的緩沖液A洗滌兩次，時(shí)間是15分鐘，然后將它在一種60ml緩沖液C(含有0.1M NaCl和50mM氯化鎂的0.1M Tris-HCl水溶液；pH9.5)中飽和5分鐘。在室溫時(shí)，將這種膜浸入30ml的一種溶液中10分鐘，該溶液通過用緩沖液C將一種發(fā)光底物(Boehringer Mannheim的AMPPD100-fold)進(jìn)行稀釋來制備，然后將該膜轉(zhuǎn)移到已吸附過量AMPPD的干燥濾紙上。根據(jù)上文所述的工藝，用一種聚乙烯薄膜將這樣處理的膜進(jìn)行包封，然后用X射線將它進(jìn)行攝影。在所得X射線照片上，確定出現(xiàn)熒光信號(hào)的位置。這證明了在這種膜上有一種陽性信號(hào)存在，并且在原始實(shí)驗(yàn)平皿上證明已制備的膜來自陽性菌落。
將這樣確定的陽性菌落從平皿中移植到含有氨芐青霉素的10ml液體LB培養(yǎng)基上，在37℃時(shí)通過以250rpm攪拌將菌落在培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。按一種普通的方法從這樣培養(yǎng)的細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，然后用一種限制性內(nèi)切核酸酶BamHI進(jìn)行切割，隨后將它進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃0按重量計(jì)是0.7％)，從而測(cè)定插入片段的大小，結(jié)果是該片段的大小約是3.1kbp。將這種質(zhì)粒稱作pPT-B1(見圖1)。根據(jù)引物續(xù)展方法，使用ABI的測(cè)序試劑盒和自動(dòng)測(cè)序儀373A將插入片段的全長堿基序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果證明插入的片段含有開放閱讀框架(一種具有702bp的堿基序列，且另一種具有618bp的堿基序列)，它們從其5′末端按順序相互結(jié)合。將這些開放閱讀框架稱作ORF1和ORF2。包括翻譯終止密碼子在內(nèi)的構(gòu)成ORF1最3′末端的四種堿基與構(gòu)成ORF2最5′末端的四種堿基重疊，這恰好與通過PCR獲得的結(jié)果一致。此外，由7個(gè)氨基酸殘基組成的N-末端氨基酸序列(已從ORF1的堿基序列中推定)與已在實(shí)施例中獲得的32K道爾頓多肽鏈N末端的氨基酸序列完全相同。這種序列區(qū)與序列表中序列號(hào)2氨基酸序列的第1位至第7位氨基酸殘基的序列一致。另一方面，由7個(gè)氨基酸殘基組成的第2位至第8位N-末端氨基酸序列(已從ORF2的堿基序列中推定)與在實(shí)施例1中獲得的29K道爾頓多肽鏈的7種氨基酸殘基的N-末端氨基酸序列完全相同。這種序列區(qū)與序列表中序列號(hào)1氨基酸序列的第2位至第8位氨基酸殘基的序列一致。此外，在ORF1和ORF2的氨基酸序列之間存在高同源性，并且在不同腈水合酶各自的β-亞單位和α-亞單位之間也存在高同源性。從這些中可以證明ORF1是來源于嗜熱假諾卡氏菌腈水合酶的β-亞單位基因，且ORF2是同樣來源于嗜熱假諾卡氏菌腈水合酶的α-亞單位基因。
實(shí)施例3
轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建
pPT-B1上lac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向與ORF1和ORF2的轉(zhuǎn)錄方向完全相同。用限制性內(nèi)切核酸酶XbaI和NspV在能夠用這些限制性內(nèi)切核酸酶切割的pPT-B1位點(diǎn)處切割pPT-B1，這些位點(diǎn)存在于pPT-B1腈水合酶基因5′-末端的上游區(qū)中，且僅能在這些位點(diǎn)處將pPT-B1切割，然后將切割的pPT-B1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)瓊脂糖，Sigma的VII型，瓊脂糖的濃度是0.7％)，通過這一過程僅從質(zhì)粒中切下約4.6kbp的DNA片段。將這樣切下的瓊脂糖片段(約0.1g)進(jìn)行精細(xì)粉碎，將其懸浮在1ml的TE中，然后在55℃時(shí)，將其加熱1小時(shí)，從而將瓊脂糖片段完全熔化。將所得的熔化物進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通過這一過程將DNA片段進(jìn)行純化。用一種Takara Shuzo的DNA鈍端化試劑盒將這種DNA片段進(jìn)行鈍端化，然后用一種Takara Shuzo的DNA連接試劑盒將它進(jìn)行自身連接，從而構(gòu)建一種質(zhì)粒pPT-DB1(圖2)。將這種pPT-DB1導(dǎo)入大腸桿菌HB101(由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))的受覺態(tài)細(xì)胞，由此將HB101轉(zhuǎn)化成一種轉(zhuǎn)化體MT-10822。在這種轉(zhuǎn)化體MT-10822中，將腈水合酶基因通過存在于其中的pUC18上的lac啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。在1996年2月7日將這種轉(zhuǎn)化體MT-10822進(jìn)行保藏，并在International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chom，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan給予它保藏號(hào)FERM P-15426，在1997年1月10日將它轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯條約下的保藏，并在所述的保藏單位給予它保藏號(hào)FERM BP-5785。
實(shí)施例4
用轉(zhuǎn)化體將腈化合物轉(zhuǎn)化成酰胺化合物(1)
將含有40μg/ml的硫酸鐵7水合物和10μm/ml的氯化鈷二水合物的100ml液體LB培養(yǎng)基放入裝有擋板的500-ml錐形瓶中，并在121℃時(shí)通過將它高壓滅菌20分鐘而對(duì)它進(jìn)行滅菌處理。自該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素以得到一種最終濃度是100μg/ml。然后，將一白金圈已在實(shí)施例3中制備的MT-10822細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以130rpm進(jìn)行攪拌，將這種細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20小時(shí)。將所得培養(yǎng)物進(jìn)行離心(5000G×15分鐘)以便僅從其中分離出細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮在50ml的生理鹽水溶液中。將所得懸浮液再次離心以便從其中分離出濕細(xì)胞。將100mg的濕細(xì)胞懸浮在200ml 50mM磷酸鉀水溶液(pH7.0)中，向其中加入10ml的丙烯腈，并在10℃時(shí)進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)，同時(shí)伴隨緩慢地?cái)嚢琛Ｔ诜磻?yīng)后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行與實(shí)施例1中相同的HPLC分析，它證明在反應(yīng)混合物中僅存在丙烯酰胺，且其中不存在丙烯腈和丙烯酸。因此，在本反應(yīng)中轉(zhuǎn)化率和選擇率都是100％。
實(shí)施例5
用轉(zhuǎn)化體將腈化合物轉(zhuǎn)化成酰胺化合物(2)
將含有40μg/ml的硫酸鐵7水合物和10μg/m l的氯化鈷二水合物的100ml液體LB培養(yǎng)基放入一種裝有擋板的500-ml錐形瓶中，并在121℃時(shí)，通過將它高壓滅菌20分鐘而對(duì)它進(jìn)行滅菌處理。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素，從而得到一種最終濃度，是100μg/ml。然后，將一白金圈已在實(shí)施例3中制備的MT-10822細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以130rpm進(jìn)行攪拌，將該細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20小時(shí)。將所得培養(yǎng)物離心(5000G×15分鐘)以便僅從其中分離出細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在50ml的一種生理鹽水溶液中。將所得懸浮液再次進(jìn)行離心以便從其中分離出濕細(xì)胞。將100mg的濕細(xì)胞懸浮在200ml 50mM磷酸鉀水溶液(pH7.0)中，向其中加入50ml的甲基丙烯腈，并在10℃時(shí)通過緩慢地?cái)嚢柽M(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)。在反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行與實(shí)施例1中相同的HPLC分析，它證明在反應(yīng)混合物中僅存在甲基丙烯酰胺且其中不存在甲基丙烯腈和甲基丙烯酸。因此，在本反應(yīng)中轉(zhuǎn)化率和選擇率都是100％。
實(shí)施例6
帶有部分取代的氨基酸序列，具有腈水合酶活性的突變體(1)
這用來證明用Met取代已在實(shí)施例3中制備的質(zhì)粒DNA pPT-DB1中α-亞單位區(qū)中的第6位的Leu。用質(zhì)粒DNA pPF-DB1作為模板，使用一種Takara Shuzo的“LA PCR體外誘變?cè)噭┖?，按照下述方式將質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。該”LA PCR體外誘變?cè)噭┖性谙挛闹蟹Q作試劑盒。在用于下述突變的工藝中，根據(jù)試劑盒的原理和制造者為試劑盒寫的說明書來操作這種試劑盒。
將10ml的液體LB培養(yǎng)基放入30-ml試管中，并在121℃時(shí)，通過高壓滅菌20分鐘將它進(jìn)行滅菌處理。向這種培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素以便獲得一種100μg/ml的最終濃度。將一白金圈已在實(shí)施例3制備的MT-10822細(xì)胞接種在培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌將這種細(xì)胞培養(yǎng)約20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管中，并以15000rpm將它離心5分鐘，以便從培養(yǎng)物中分離出細(xì)胞。通過堿性SDS提取而從細(xì)胞中提取出質(zhì)粒DNA pPT1-DB1。
將1μg的質(zhì)粒DNA pPT-DB1(將它用作模板)進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。確切地說，對(duì)于PCR反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)9序列的引物和50pmol的M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒和在72℃時(shí)進(jìn)行鏈續(xù)展120秒。對(duì)于PCR反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由2個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中的每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而將由反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(如果可能)。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用Takara Shuzo的Microcon 100，從這些PCR反應(yīng)混合物中除去過量的引物和dNTP。向每種反應(yīng)混合物中加入TE以便制備每種都是50μl的TE溶液。制備總計(jì)47.5μl的退火溶液，它含有0.5μ的兩種上述TE溶液。對(duì)于退火溶液的基本組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書。將這種溶液在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性10分鐘，然后將它以恒定的冷卻速度在超過60分鐘的間隔內(nèi)冷卻至37℃，隨后將它在37℃時(shí)保持15分鐘。因此，完成了所需的退火。將0.5μl的TAKRALA Taq加入到這樣退火的溶液中，然后將它在72℃時(shí)加熱3分鐘。由此，完成了異源雙鏈DNA的形成，將它進(jìn)行PCR反應(yīng)了。確切地說，對(duì)于PCR反應(yīng)3，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有48μl的所述異源雙鏈DNA溶液，50pmol的M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)。PCR反應(yīng)3由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒和在72℃時(shí)進(jìn)行鏈延伸120秒。在PCR后，將在PCR反應(yīng)3中獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖Sigma的VII型，瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是0.8％)，從而將由反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。這種檢測(cè)表明了在PCR反應(yīng)3中生產(chǎn)出了約2.0kbp擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物。從PCR反應(yīng)混合物中取出的僅是約2.0kbp的DNA片段。將這種片段(約0.1g)精細(xì)地粉碎，將它懸浮在1ml的TE中，并在55℃時(shí)將它加熱1小時(shí)，從而完全熔化該片段。將所得熔化物進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通過這一過程將DNA片段進(jìn)行純化。最后，將該片段溶于10μl的TE中。用限制性內(nèi)切核酸酶ECORI和HindIII切割這樣純化為20kbp擴(kuò)增DNA片段，然后將它進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通過這一過程將DNA片段進(jìn)行純化。最后，將該片段溶于10ml的TE中。另一方面，將質(zhì)粒pPT-DB1用限制性內(nèi)切核酸酶在它們的切割位點(diǎn)處切割，然后將它進(jìn)行瓊脂凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma的VII型，瓊脂糖的濃度是0.7％)，通過這一過程僅將約2.7kbp的DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下。將這樣切下的瓊脂片糖段(約0.1g)精細(xì)地粉碎，將它懸浮在1ml的TE中，并將它在55℃時(shí)加熱1小時(shí)，從而在TE中將該片段完全熔化。將所得熔化物進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，通過這一過程將DNA片段進(jìn)行純化。最后，將該片段溶于10μl的TE中。用一種Takara Shuzo的DNA連接試劑盒，將擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物和上述制備的pPT-DB1片段進(jìn)行相互連接，用它轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101(由Toyobo生產(chǎn))的感覺態(tài)細(xì)胞。這樣制備出一種大腸桿菌庫。
將含有40μg/ml硫酸鐵7水合物和10μg/ml氯化鈷二水合物的10ml液體LB培養(yǎng)基(將這種培養(yǎng)基在下文中稱作一種活性表達(dá)培養(yǎng)基)放入30-ml的試管中，并在121℃時(shí)通過將它高壓滅菌20分鐘來對(duì)它進(jìn)行滅菌處理。將氨芐青霉素加入這種培養(yǎng)基中，從而得到一種100μg/ml的最終濃度。然后，將任意選自大腸菌庫五個(gè)克隆中的任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌將它在培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管中并離心(以15000rpm進(jìn)行15分鐘)，以便從培養(yǎng)物中分離出細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在200μl的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，向其中加入1％(按重量計(jì))的丙烯腈并在10℃時(shí)進(jìn)行反應(yīng)2分鐘。向反應(yīng)混合物中加入與反應(yīng)混合物相同量的1M磷酸水溶液，用它將反應(yīng)終止。通過與實(shí)施例1中相同的HPLC分析，測(cè)定這樣生產(chǎn)的丙烯酰胺在反應(yīng)混合物中的濃度。結(jié)果是在5個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出形成了丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離，并將它進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)料DNA。接下來，通過與實(shí)施例2中相同的引物延伸，使用同樣的ABI的測(cè)序試劑盒和自動(dòng)測(cè)序儀373A，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果見表1，其中已知用Met取代了來自表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第6位的Leu。
表1
實(shí)施例7
帶有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突變體(2)
這用來證明在質(zhì)粒DNA pPT-DB1中用Thr取代α-亞單位區(qū)中的第6位的Leu。用質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板將它按照與實(shí)施例6中相同的方式進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在這一過程中，將已在實(shí)施例6中制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1(用它作為模板)進(jìn)行兩種不同類型的PCR。確切地說，對(duì)于反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)13序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒，并在72℃時(shí)進(jìn)行鏈續(xù)展120秒。對(duì)于反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)反應(yīng)混合物中由DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用這些產(chǎn)物，按照與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
將任意選自大腸桿菌庫的五個(gè)克隆中任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在與實(shí)施例6中所用相同的10ml活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌，將它在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管，并按照與實(shí)施例6中相同的方式來測(cè)定其腈水合酶的活性。結(jié)果是在五個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出了形成的丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離并將它們進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接下來，按照與實(shí)施例2相同的方式，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表2，其中已知由Thr取代了來自如表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第6位的Leu。
表2
實(shí)施例8
帶有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突變體(3)
這用來證明在質(zhì)粒DNA pPT-DB1中用Ala取代α-亞單位區(qū)中的第6位的Leu。用質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，將它按照與實(shí)施例6中相同的方式進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在這一過程中，將已在實(shí)施例6中制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1(用它作為模板)進(jìn)行兩種不同類型的PCR。確切地說，對(duì)于反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)14序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒并在72℃時(shí)進(jìn)行鏈續(xù)展120秒。對(duì)于反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)反應(yīng)混合物中由DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用這些產(chǎn)物，按照與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
將任意選自大腸桿菌庫的五個(gè)克隆中任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在與實(shí)施例6中所用相同的10ml活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌，將它在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管，并按照與實(shí)施例6中相同的方式來測(cè)定其腈水合酶的活性。結(jié)果是在五個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出了形成的丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離并將它們進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接下來，按照與實(shí)施例2相同的方式，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表3，其中已知由Ala取代了來自如表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第6位的Leu。
表3
實(shí)施例9
帶有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突變體(4)
這用來證明在質(zhì)粒DNA pPT-DB1中向Val取代α-亞單位區(qū)中的第6位的Leu。用質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，將它按照與實(shí)施例6中相同的方式進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在這一過程中，將已在實(shí)施例6中制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1(用它作為模板)進(jìn)行兩種不同類型的PCR。確切地說，對(duì)于反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)15序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒并在72℃時(shí)進(jìn)行鏈續(xù)展120秒。對(duì)于反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)反應(yīng)混合物中由DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用這些產(chǎn)物，按照與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
將任意選自大腸桿菌庫的五個(gè)克隆中任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在與實(shí)施例6中所用相同的10ml活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌，將它在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管，并按照與實(shí)施例6中相同的方式來測(cè)定其腈水合酶的活性。結(jié)果是在五個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出了形成的丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離并將它們進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接下來，按照與實(shí)施例2相同的方式，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表4，其中已知由Val取代了來自如表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第6位的Leu。
表4
實(shí)施例10
帶有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突變體(5)
這用來證明在質(zhì)粒DNA pPT-DB1中用Val取代α-亞單位區(qū)中的第19位的Ala。用質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，將它按照與實(shí)施例6中相同的方式進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在這一過程中，將已在實(shí)施例6中制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的PCR，用它作為模板確切地說，對(duì)于反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μ1的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)16序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒并在72℃時(shí)進(jìn)行鏈延伸120秒。對(duì)于反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)反應(yīng)混合物中由DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用這些產(chǎn)物，按照與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
將任意選自大腸桿菌庫的五個(gè)克隆中任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在與實(shí)施例6中所用相同的10ml活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌，將這種白金圈接種物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管，并按照與實(shí)施例6中相同的方式來測(cè)定其腈水合酶的活性。結(jié)果是在五個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出了形成的丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離并將它們進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接下來，按照與實(shí)施例2相同的方式，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表5，其中已知由Val取代了來自如表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第19位的Ala。
表5
實(shí)施例11
帶有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突變體(6)
這用來證明在質(zhì)粒DNA pPT-DB1中用Leu取代α-亞單位區(qū)中的第38位的Met。用質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，將它按照與實(shí)施例6中相同的方式進(jìn)行位點(diǎn)專一突變。
在這一過程中，將已在實(shí)施例6中制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的PCR用它作為模板。確切地說，對(duì)于反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)17序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒并在72℃時(shí)進(jìn)行鏈延伸120秒。對(duì)于反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)反應(yīng)混合物中由DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用這些產(chǎn)物，按照與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
將任意選自大腸桿菌庫的五個(gè)克隆中任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在與實(shí)施例6中所用相同的10ml活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌，將它在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管，并按照與實(shí)施例6中相同的方式來測(cè)定其腈水合酶的活性。結(jié)果是在五個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出了形成的丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離并將它們進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接下來，按照與實(shí)施例2相同的方式，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表6，其中已知由Leu取代了來自如表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第38位的Met。
表6
實(shí)施例12
帶有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突變體(7)
這用來證明在質(zhì)粒DNA pPT-DB1中用Ser取代α-亞單位區(qū)中的第77位的Thr。用質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，將它按照與實(shí)施例6中相同的方式進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在這一過程中，將已在實(shí)施例6中制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的PCR用它作為模板。確切地說，對(duì)于反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)18序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒并在72℃時(shí)進(jìn)行鏈續(xù)展120秒。對(duì)于反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)反應(yīng)混合物中由DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用這些產(chǎn)物，按照與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
將任意選自大腸桿菌庫的五個(gè)克隆中任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在與實(shí)施例6中所用相同的10ml活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌，將它在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管，并按照與實(shí)施例6中相同的方式來測(cè)定其腈水合酶的活性。結(jié)果是在五個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出了形成的丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離并將它們進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接下來，按照與實(shí)施例2相同的方式，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表7，其中已知由Ser取代了來自如表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第77位的Thr。
表7
實(shí)施例13
帶有具有腈水合酶活性的部分取代的氨基酸序列的突變體(8)
這用來證明在質(zhì)粒DNA pPT-DB1中用Ala取代α-亞單位區(qū)中的第90位的Gly。用質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，將它按照與實(shí)施例6中相同的方式進(jìn)行位點(diǎn)專一突變。
在這一過程中，將已在實(shí)施例6中制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的PCR用它作為模板。確切地說，對(duì)于反應(yīng)1，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol具有序列表中序列號(hào)19序列的引物和50pmol M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)1由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)包括在98℃時(shí)進(jìn)行加熱變性15秒，在55℃時(shí)進(jìn)行退火30秒并在72℃時(shí)進(jìn)行鏈續(xù)展120秒。對(duì)于反應(yīng)2，所用的是一種總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)，它含有50pmol的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmol的M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)12的序列)(對(duì)于該系統(tǒng)的組成來說，所參照的是制造者為試劑盒寫的說明書)。反應(yīng)2由25個(gè)PCR循環(huán)組成，其中一個(gè)PCR循環(huán)與反應(yīng)1中的內(nèi)容相同。在PCR后，將在反應(yīng)1和2中每個(gè)反應(yīng)所獲得的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)是1.0％)，從而檢測(cè)(如果可能)反應(yīng)混合物中由DNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種檢測(cè)表明在兩種PCR反應(yīng)中生產(chǎn)出了擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用這些產(chǎn)物，按照與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
將任意選自大腸桿菌庫的五個(gè)克隆中任何一個(gè)用一個(gè)白金圈接種在與實(shí)施例6中所用相同的10ml活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃時(shí)，通過以300rpm攪拌，將這種白金圈接種物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物放入一種適合的離心管，并按照與實(shí)施例6中相同的方式來測(cè)定其腈水合酶的活性。結(jié)果是在五個(gè)克隆中的四個(gè)中檢測(cè)出了形成的丙烯酰胺，它證明四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從1ml四個(gè)活性克隆(在本文中保留著未被用于檢測(cè)其腈水合酶的活性)的每個(gè)培養(yǎng)物中，將細(xì)胞分離并將它們進(jìn)行堿性SDS提取，從而提取每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接下來，按照與實(shí)施例2相同的方式，將每個(gè)克隆腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表8，其中已知由Ala取代了來自如表中所示克隆腈水合酶α-亞單位中的第90位的Gly。
表8
實(shí)施例14
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(9)
本實(shí)施例是為了闡明用Ala取代質(zhì)粒DNA pPT-DB1中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第102位Val。以質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)20的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表9所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第102位Val被Ala取代了。
表9
實(shí)施例15
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(10)
本實(shí)施例是為了闡明用Ile取代質(zhì)粒DNA pPT-DB1中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第106位Val。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)21的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μm的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這種產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫度20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有兩烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排列。結(jié)果如表10所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第106位Val被Ile取代了。
表10
實(shí)施例16
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(11)
本實(shí)施例是為了闡明用Tyr取代質(zhì)粒DNApPT-DBl中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第126位Phe。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)22的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合醚鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合鏈酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表11所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第126位Phe被Tyr取代了。
表11
實(shí)施例17
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(12)
本實(shí)施例是為了闡明用Glu取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第130位Gln。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)23的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表12所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第130位Gln被Glu取代了。
表12
實(shí)施例18
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(13)
本實(shí)施例是為了闡明用Val取代質(zhì)粒DNA pPT-DB1中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第142位Leu。以質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)24的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表13所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第142位Leu被Val取代了。
表13
實(shí)施例19
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(14)
本實(shí)施例是為了闡明用Asp取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第146位Glu。以質(zhì)粒DNA pPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)25的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例1與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表14所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第146位Glu被Asp取代了。
表14
實(shí)施例20
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(15)
本實(shí)施例是為了闡明用Thr取代質(zhì)粒DNA pPT-DB1α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第187位Ala。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)26的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表15所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第187位Ala被Thr取代了。
表15
實(shí)施例21
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(16)
本實(shí)施例是為了闡明用Leu取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第194位Ser。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DBl進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)27的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表16所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第194位Ser被Leu取代了。
表16
實(shí)施例22
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(17)
本實(shí)施例是為了闡明Glu取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中α-亞單位區(qū)域內(nèi)的第203位Ala。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)28的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表17所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的α-亞單位中的第203位Ala被Glu取代了。
表17
實(shí)施例23
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(18)
本實(shí)施例是為了闡明用Val取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第20位Ala。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)29的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表18所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第20位Ala被Val取代了。
表18
實(shí)施例24
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(19)
本實(shí)施例是為了闡明用Asn取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第21位Asp。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)30的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表19所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第21位Asp被Asn取代了。
表19
實(shí)施例25
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(20)
本實(shí)施例是為了闡明用Asp取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第108位Glu。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)31的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表20所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第108位Glu被Asp取代了。
表20
實(shí)施例26
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(21)
本實(shí)施例是為了闡明用Pro取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第108位Glu。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)32的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表21所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第108位Glu被Pro取代了。
表21
實(shí)施例27
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(22)
本實(shí)施例是為了闡明用Ser取代質(zhì)粒DNApPT-DBl中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第108位Glu。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)33的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表22所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第108位Glu被Ser取代了。
表22
實(shí)施例28
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(23)
本實(shí)施例是為了闡明用Arg取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第108位Glu。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)34的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基列進(jìn)行排序。結(jié)果如表23所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第108位Glu被Arg取代了。
表23
實(shí)施例29
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(24)
本實(shí)施例是為了闡明用Cys取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第108位Glu。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)35的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表24所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第108位Glu被Cys取代了。
表24
實(shí)施例30
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(25)
本實(shí)施例是為了闡明用Leu取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第108位Glu。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)36的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表25所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第108位Glu被Leu取代了。
表25
實(shí)施例31
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(26)
本實(shí)施例是為了闡明用Thr取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第108位Glu。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)37的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表26所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第108位Glu被Thr取代了。
表26
實(shí)施例32
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(27)
本實(shí)施例是為了闡明用Asp取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第200位Ala。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)38的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相司的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表27所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第200位Ala被Asp取代了。
表27
實(shí)施例33
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(28)
本實(shí)施例是為了闡明用Ile取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第200位Ala。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)39的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10m1與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表28所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第200位Ala被Ile取代了。
表28
實(shí)施例34
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(29)
本實(shí)施例是為了闡明用Val取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第200位Ala。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNA pPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)40的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表29所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第200位Ala被Val取代了。
表29
實(shí)施例35
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(30)
本實(shí)施例是為了闡明用Glu取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第200位Ala。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)41的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表30所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第200位Ala被Glu取代了。
表30
實(shí)施例36
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(31)
本實(shí)施例是為了闡明用Tyr取代質(zhì)粒DNApPT-DB1中β-亞單位區(qū)域內(nèi)的第212位Ser。以質(zhì)粒DNApPT-DB1作為模板，并按實(shí)施例6中同樣的方法將它進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
在此過程中，將實(shí)施例6中已制備的1μg質(zhì)粒DNApPT-DB1進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)42的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘的熱變性，在55℃時(shí)30秒鐘的退火以及在72℃時(shí)120秒鐘的鏈延伸。對(duì)于第二種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols MUT4引物(帶有序列表中序列號(hào)11的序列)和50pmols M13引物RV(帶有序列表中序列12的序列)(對(duì)于此體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第二種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)與第一種反應(yīng)中的相同。聚合酶鏈反應(yīng)后，將第一和第二種反應(yīng)分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖濃度為1.0Wt％)，如果有的話，用此方法可測(cè)定反應(yīng)混合物中DNA擴(kuò)增所得的產(chǎn)物。這一測(cè)定表明了兩種聚合酶鏈反應(yīng)中有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物產(chǎn)生。使用這些產(chǎn)物，根據(jù)實(shí)施例6所述的同樣方法制備大腸桿菌庫。
用一個(gè)白金圈將從大腸桿菌庫中任意選擇的五個(gè)克隆中的任意一個(gè)接種在10ml與實(shí)施例6中所用的相同的活性表達(dá)培養(yǎng)基中，并在37℃溫育20小時(shí)，以300rpm震蕩。將1ml所得的培養(yǎng)物放在合適的離心管中，按實(shí)施例6中同樣的方法測(cè)定其腈水合酶活性。結(jié)果，在五個(gè)克隆中有四個(gè)發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺形成，這證實(shí)了四個(gè)克隆具有腈水合酶活性。
從保留著未被用于測(cè)定其腈水合酶活性的有活性的四個(gè)克隆的各1ml培養(yǎng)物中，分離出細(xì)胞，并進(jìn)行堿性SDS提取，由此提取到每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。接著，按實(shí)施例2中同樣的方法將每個(gè)克隆的腈水合酶結(jié)構(gòu)基因的堿基序列進(jìn)行排序。結(jié)果如表31所示，其中可以看出，表中所示克隆中的腈水合酶的β-亞單位中的第212位Ser被Tyr取代了。
表31
實(shí)施例37
具有腈水合酶活性帶有部分取代的氨基酸序列的突變體(32)
本實(shí)施例是為了闡明帶有多種取代的氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶活性，這種氨基酸序列包括來源于第5個(gè)克隆(其α-亞單位中的第19位Ala被Val取代)和第11個(gè)克隆(其α-亞單位中的第126位Phe被Tyr取代)的兩個(gè)突變位點(diǎn)。
將10ml液體LB培養(yǎng)基放在一個(gè)30ml的試管中，并用高壓滅菌器在121℃滅菌20分鐘。在這種培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素得到最終濃度為100μg/ml。用一個(gè)白金圈將在實(shí)施例16已制備的第11個(gè)克隆接種在培養(yǎng)基上，在37℃溫育約20小時(shí)，并以300rpm震蕩。將1ml所獲得的培養(yǎng)基放在合適的離心管中，以15000rpm離心5分鐘以便從培養(yǎng)物中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取從細(xì)胞中提取出第11個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA。
將1μg第11個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈反應(yīng)，用它作為模板。具體地，對(duì)于第一種聚合酶鏈反應(yīng)，使用的是總量為50μl的反應(yīng)體系，它包括50pmols帶有序列表中序列號(hào)16的序列的引物以及50pmols M13引物M4(帶有序列表中序列號(hào)10的序列)(對(duì)于這一體系的組成，所參照的是制造商對(duì)試劑盒的說明)。第一種反應(yīng)包括25個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)包括在98℃時(shí)15秒鐘熱變性、在55℃退火30秒，并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的非限定性地選自大腸桿菌庫中的五種克隆中的任何一種接種到10ml的與實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃將其在300rpm的攪拌下溫育大約20小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物放入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并以與實(shí)施例6相同的方式測(cè)定該腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得有丙烯酰胺的形成，這證實(shí)了四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中而不用于測(cè)定腈水合酶活性的四種活性克隆的培養(yǎng)的各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基團(tuán)的堿基序列。結(jié)果顯示在表32中，其中已知在所制備的質(zhì)烊DNA的氨基酸序列中，用Val取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第19位的Ala，并用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶α-亞單位中的第126位的Phe。
表32
實(shí)施例38
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(33)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.1的突變位(其中用Met取代了α-亞單位中第6位的Leu)和克隆No.32的突變位(其中用Val取代了α-亞單位中的第19位Ala和用Tyr取代了α-亞單位中第126位的Phe)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
把10ml的LB液體培養(yǎng)基裝入一只30ml的試管中，并將其在121℃高壓滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素到最終濃度為100μg/ml。把一鉑環(huán)已在實(shí)施例37中制得的克隆No.32接種在該培養(yǎng)基上，并在37℃ 300rpm攪拌溫育20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物放入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，以15,000rpm離心分離5分鐘，從該培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取法從該細(xì)胞中提取出克隆No.32的質(zhì)粒DNA。
用1μg的克隆No.32的質(zhì)粒DNA作模板，將其進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，精確地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為9的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒，并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃ 300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取，從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表33中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Met取代了野生型腈水合腈α-亞單位中第6位的Leu，用Val取代了相同的野生型腈水合酶α-亞單位中的第19位的Ala和用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶α-亞單位中的第126位的Phe。
表33
實(shí)施例39
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(34)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.2的突變位(其中用Thr取代了α-亞單位中第6位的Leu)和克隆No.32的突變位(其中用Val取代了α-亞單位中的第19位的Ala和用Tyr取代了α-亞單位中第126位的Phe)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
用1μg的已在實(shí)施例38中制得的克隆No.32的質(zhì)粒DNA作模板，將其進(jìn)行兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，確切地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為13的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1m所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各lml中，分離細(xì)胞并經(jīng)過堿性SDS提取，從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表34中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Thr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第6位的Leu，用Val取代了相同的野生腈水合酶α-亞單位中的第19位的Ala和用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶α-亞單位中的第126位的Phe。
表34
實(shí)施例40
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(35)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.3的突變位(其中用Ala取代了α-亞單位中第6位的Leu)和克隆No.32的突變位(其中用Val取代了相同的野生型腈水合酶α-亞單位中的第19位的Ala和用Tyr取代了α-亞單位中第126位的Phe)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
用1μg的已在實(shí)施例38中制得的克隆No.32的質(zhì)粒DNA作模板將其經(jīng)過兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，確切地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為14的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS鈉提取從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表35中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Ala取代了野生型腈水酶α-亞單位中第6位的Leu，用Val取代了相同的野生腈水合酶α-亞單位中的第19位的Ala和用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶α-亞單位中的第126位的Phe。
表35
實(shí)施例4l
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(36)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.20的突變位(其中用Asp取代了β-亞單位中第108位的Glu)和克隆No.31的突變位(其中用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
把10ml的LB液體培養(yǎng)基裝入一只30ml的試管中，并將其在121℃高壓滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素到最終濃度為100μg/ml。把一鉑環(huán)已在實(shí)施例36中制得的克隆No.31接種在該培養(yǎng)基上，并在37℃ 300rpm攪拌下溫育20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物放入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，以15,000rpm離心分離5分鐘，從該培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取法從該細(xì)胞中提取出克隆No.31的質(zhì)粒DNA。
用1μm的克隆No.31的質(zhì)粒DNA作模板，將其經(jīng)過兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，確切地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為31的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表36中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Asp取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第108位的Glu，用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表36
實(shí)施例42
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(37)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.23的突變位(其中用Arg取代了β-亞單位中第108位的Glu)和克隆No.31的突變位(其中用Tyr取代了β-亞單位中的第212位的Ser)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
用1μg的已在實(shí)施例41中制得的克隆No.31的質(zhì)粒DNA作模板將其經(jīng)過兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，確切地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為34的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)，把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表37中，其中已知的所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Arg取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第108位的Glu，用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表37
實(shí)施例43
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(38)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.27的突變位(其中用Asp取代了β-亞單位中第200位的Ala)和克隆No.31的突變位(其中用Tyr取代了β-亞單位中的第212位的Ser)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
用1μg的已在實(shí)施例41中制得的克隆No.31的質(zhì)粒DNA作模板將其經(jīng)過兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，確切地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為38的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)，把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表38中，其中已知的所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Asp取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第200位的Ala，用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表38
實(shí)施例44
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(39)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.30的突變位(其中用Glu取代了β-亞單位中第200位的Ala)和克隆No.31的突變位(其中用Tyr取代了β-亞單位中的第212位的Ser)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
用lμg的已在實(shí)施例41中制得的克隆No.31的質(zhì)粒DNA作模板將其經(jīng)過兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，確切地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為41的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μl反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)，把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表39中，其中已知的所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Glu取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第200位的Ala，用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表39
實(shí)施例45
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(40)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.23的突變位(其中用Arg取代了β-亞單位中第108位的Glu)和克隆No.39的突變位(其中用Glu取代了β-亞單位中的第200位的Ala和用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser)的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
把10ml的LB液體培養(yǎng)基裝入一只30ml的試管中，并將其在121℃高壓滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素到最終濃度為100μg/ml。把一鉑環(huán)已在實(shí)施例44中制得的克隆No.39接種在該培養(yǎng)基上，并在37℃ 300rpm攪拌下溫育20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物放入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，以15,000rpm離心分離5分鐘，從該培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取法從該細(xì)胞中提取出克隆No.39的質(zhì)粒DNA。
用1μg的克隆No.39的質(zhì)粒DNA作模板將其經(jīng)過兩種不同類型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在第一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，確切地說，使用總共50μl的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols具有序列表中序列號(hào)為34的序列的引物和50pmols一種M13引物M4(具有序列表中序列號(hào)為10的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第一種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)包括在98℃熱變性15秒、在55℃退火30秒并在72℃鏈擴(kuò)增120秒。在第二種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用總共50μ的一種反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括50pmols的MUT4引物(具有序列表中序列號(hào)為11的序列)和50pmols一種M13引物RV(具有序列表中序列號(hào)為12的序列)(對(duì)該系統(tǒng)的組成來說，把生產(chǎn)商對(duì)試劑盒的說明書作為參考)。第二種反應(yīng)是由25個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)組成，其中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)與在第一種反應(yīng)中的循環(huán)相同。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)之后，把在第一種和第二種反應(yīng)中分別得到的5μm反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(其中瓊脂糖的濃度按重量計(jì)為1.0％)，由此測(cè)定該反應(yīng)混合物中從DNA的擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物。這種測(cè)定能證實(shí)在兩種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生。用這些產(chǎn)物以與實(shí)施例6中相同的方式制備一種大腸桿菌庫。
把一鉑環(huán)的從大腸桿菌庫中非限定性選擇的五種克隆的任何一種接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)，把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，在五種克隆中的四種測(cè)得丙烯酰胺的形成，這證實(shí)這四種克隆有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的四種克隆的培養(yǎng)物各1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取各克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定各克隆的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表40中，其中已知的所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Arg取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第108位的Glu，用Glu取代了野生腈水含酶β-亞單位中第200位的ALa和用Tyr取代了相同的野生腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表40
實(shí)施例46
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(41)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.34的突變位和克隆No.36的突變位的多重取代氨基酸序列的突變體具有腈水合酶的活性。
把10ml的LB液體培養(yǎng)基裝入一只30ml的試管中，并將其在121℃高壓滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素到最終濃度為100μm/ml。其中制備了兩種該類型的相同培養(yǎng)基。把一鉑環(huán)已在實(shí)施例39中制得的克隆No.34和一鉑環(huán)已在實(shí)施例41中制得的克隆No.36接種在這些培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物分別放入適當(dāng)?shù)碾x心試管中，以15,000rpm離心分離5分鐘從該培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取法從該細(xì)胞中提取出克隆No.34的質(zhì)粒DNA和克隆No.36的質(zhì)粒DNA。
用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和NotI在其切割位切割克隆No.36的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為1.0％)，通過這種方法把大約770bp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。以相同的方式，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和NotI在其切割位切割克隆No.34的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為0.7％)，通過這種方法把大約3.8Kbp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。把這樣切割的瓊脂糖片斷(分別大約0.1g)都粉碎成細(xì)粉，然后分別懸浮于1ml的TE，并在55℃加熱1小時(shí)，由此把該片斷完全解鏈。把所得到的解鏈蛋白分別進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯/氯仿提取和乙醇沉淀，由此純化該片段。最后，將其分別溶于10μl的TE中。
用Takara Shuzo DAN連接試劑盒把從克隆No.36中得到的大約770bp的DNA片段和從克隆No.34中得到的大約3.8Kbp的DNA片段連接在一起構(gòu)建成一種質(zhì)粒pPT-DB41。把該質(zhì)粒DNA pPT-DB41導(dǎo)入大腸桿菌HB101(由Toyobo生產(chǎn))的感受態(tài)細(xì)胞中。這樣得到一種大腸桿菌克隆No.41。
把一鉑環(huán)的大腸桿菌克隆No.41接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，測(cè)得有丙烯酰胺的形成，這證實(shí)該克隆No.41有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的培養(yǎng)物1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取該克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定克隆No.41的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表41中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Thr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第6位的Leu，用Val取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第19位的Ala，用Tyr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第126位的Phe，用Asp取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第108位的Glu和用Tyr取代了相同的野生型腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表41
實(shí)施例47
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(42)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.34的突變位和克隆No.37的突變位的多重取代氨基酸序列的突變體具有腈水合酶的活性。
把10ml的LB液體培養(yǎng)基裝入一只30ml的試管中，并將其在121℃高壓滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素到最終濃度為100μm/ml。其中制備了兩種該類型的相同培養(yǎng)基。把一鉑環(huán)已在實(shí)施例42中制得的克隆No.37接種在這些培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物分別放入適當(dāng)?shù)碾x心試管中，以15,000rpm離心分離5分鐘從該培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取法從該細(xì)胞中提取出克隆No.37的質(zhì)粒DNA。
用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和NotI在其切割位切割克隆No.37的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為1.0％)，通過這種方法把大約770bp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。用相同的方式，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和NotI在其切割位切割已在實(shí)施例46中所制備的克隆No.34的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為0.7％)，通過這種方法把大約3.8Kbp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。把這樣切割的瓊脂糖片段(分別大約0.1g)都粉碎成細(xì)粉，然后分別懸浮于1ml的TE，并在55℃加熱1小時(shí)，由此把該片斷完全解鏈。把所得到的解鏈蛋白分別進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯/氯仿提取和乙醇沉淀，由此純化該片段。最后，將其分別溶于10μl的TE中。
用Takara Shuzo DNA連接試劑盒把從克隆No.37中得到的大約770bp的DNA片段和從克隆No.34中得到的大約3.8Kbp的DNA片段連接在一起構(gòu)建成一種質(zhì)粒pPT-DB42。把該質(zhì)粒DNA pPT-DB42導(dǎo)入大腸桿菌HB101(由Toyobo生產(chǎn))的感受態(tài)細(xì)胞中。這樣得到一種大腸桿菌克隆No.42。
把一鉑環(huán)的大腸桿菌克隆No.42接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，測(cè)得有丙烯酰胺的形成，這證實(shí)該克隆No.42有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的培養(yǎng)物1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取該克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定克隆No.42的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表42中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Thr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第6位的Leu，用Val取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第19位的Ala，用Tyr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第126位的Phe，同時(shí)，用Arg取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第108位的Glu和用Tyr取代了相同的野生腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表42
實(shí)施例48
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(43)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.34的突變位和克隆No.39的突變位的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
把10ml的LB液體培養(yǎng)基裝入一只30ml的試管中，并將其在121℃高壓滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素到最終濃度為100μg/ml。把一鉑環(huán)已在實(shí)施例44中制得的克隆No.39接種在這些培養(yǎng)基上，并在37℃ 300rpm攪拌下溫育20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物分別放入適當(dāng)?shù)碾x心試管中，以15,000rpm離心分離5分鐘從該培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取法從該細(xì)胞中提取出克隆No.39的質(zhì)粒DNA。
用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和NotI在其切割位切割克隆No.39的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為1.0％)，通過這種方法把大約770bp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。用相同的方式，用限制性核酸內(nèi)酶EcoRI和NotI在其切割位切割已在實(shí)施例46中所制備的克隆No.34的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為0.7％)，通過這種方法把大約3.8Kbp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。把這樣切割的瓊脂糖片段(分別大約0.1g)都粉碎成細(xì)粉，然后分別懸浮于1ml的TE，并在55℃加熱1小時(shí)，由此把該片斷完全解鏈。把所得到的解鏈蛋白分別進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯/氯仿提取和乙醇沉淀，由此純化該片段。最后，將其分別溶于10μl的TE中。
用Takara Shuzo DNA連接試劑盒把從克隆No.39中得到的大約770bp的DNA片段和從克隆No.34中得到的大約3.8Kbp的DNA片段連接在一起構(gòu)建成一種質(zhì)粒pPT-DB43。把該質(zhì)粒DNA pPT-DB43導(dǎo)入大腸桿菌HB101(由Toyobo生產(chǎn))的感受態(tài)細(xì)胞中。這樣得到一種大腸桿菌克隆No.43。
把一鉑環(huán)的大腸桿菌克隆No.43接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，測(cè)得有丙烯酰胺的形成，這證實(shí)該克隆No.43有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的培養(yǎng)物1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取該克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定克隆No.43的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表43中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Thr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第6位的Leu，用Val取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第19位的Ala，用Tyr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第126位的Phe，同時(shí)，用Glu取代了野生腈水合酶β-亞單位中的第200位的Ala和用Tyr取代了相同的野生腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表43
實(shí)施例49
具有腈水合酶活性的含有多重取代的氨基酸序列的突變體(44)
這是用來證實(shí)含有包括克隆No.34的突變位和克隆No.40的突變位的多重取代氨基酸序列的突變體仍具有腈水合酶的活性。
把10ml的LB液體培養(yǎng)基裝入一只30ml的試管中，并將其在121℃高壓滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素到最終濃度為100μg/ml。把一鉑環(huán)已在實(shí)施例45中制得的克隆No.40接種在這些培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物分別放入適當(dāng)?shù)碾x心試管中，以15,000rpm離心分離5分鐘從該培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。用堿性SDS提取法從該細(xì)胞中提取出克隆No.40的質(zhì)粒DNA。
用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和NotI在其切割位切割克隆No.40的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為1.0％)，通過這種方法把大約770bp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。用相同的方式，用限制性核酸內(nèi)酶EcoRI和NotI在其切割位切割已在實(shí)施例46中所制備的克隆No.34的質(zhì)粒DNA，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(用一種低熔點(diǎn)的瓊脂糖，Sigma VII型，瓊脂糖濃度為0.7％)，通過這種方法把大約3.8Kbp的DNA片段切出瓊脂糖凝膠。把這樣切割的瓊脂糖片段(分別大約0.1g)都粉碎成細(xì)粉，然后分別懸浮于1ml的TE，并在55℃加熱1小時(shí)，由此把該片斷完全解鏈。把所得到的解鏈蛋白分別進(jìn)行與實(shí)施例2中相同的苯/氯仿提取和乙醇沉淀，由此純化該片段。最后，將其分別溶于10μl的TE中。
用Takara Shuzo DNA連接試劑盒把從克隆No.40中得到的大約770bp的DNA片段和從克隆No.34中得到的大約3.8Kbp的DNA片段連接在一起構(gòu)建成一種質(zhì)粒pPT-DB44。把該質(zhì)粒DNA pPT-DB44導(dǎo)入大腸桿菌HB101(由Toyobo生產(chǎn))的感受態(tài)細(xì)胞中。這樣得到一種大腸桿菌克隆No.44。
把一鉑環(huán)的大腸桿菌克隆No.44接種到10ml的與在實(shí)施例6中所用的相同活性表達(dá)培養(yǎng)基上，并在37℃300rpm攪拌下溫育大約20個(gè)小時(shí)。把1ml所得到的培養(yǎng)物裝入一只適當(dāng)?shù)碾x心試管中，并用與實(shí)施例6中相同的方式測(cè)定腈水合酶的活性。結(jié)果，測(cè)得有丙烯酰胺的形成，這證實(shí)該克隆No.44有腈水合酶的活性。
從已保留在其中沒有用于測(cè)定腈水合酶活性的培養(yǎng)物1ml中分離細(xì)胞，并經(jīng)過堿性SDS提取從而由此提取該克隆的質(zhì)粒DNA。接著，用與實(shí)施例2的相同方式測(cè)定克隆No.44的腈水合酶的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。結(jié)果顯示在表44中，其中已知在所制備的質(zhì)粒DNA的氨基酸序列中，用Thr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第6位的Leu，用Val取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第19位的Ala，用Tyr取代了野生型腈水合酶α-亞單位中第126位的Phe，同時(shí)，用Arg取代了野生型腈水合酶β-亞單位中第108位的Glu，用Glu取代了野生腈水合酶β-亞單位中的第200位的Ala和用Tyr取代了相同的野生腈水合酶β-亞單位中的第212位的Ser。
表44
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
按照本發(fā)明，它提供了來自嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的氨基酸序列和堿基序列，還提供了一種改變?cè)撾嫠厦傅陌被嵝蛄泻蛪A基序列而幾乎不改變其功能的方法，和具有根據(jù)所述方法改變的堿基序列和氨基酸序列的腈水合酶，并提供了具有該腈水合酶基因的重組質(zhì)粒，含有該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該酶的方法，以及用該轉(zhuǎn)化體由一種腈化合物生產(chǎn)相關(guān)酰胺化合物的方法。
序列表
(1)序列號(hào)No1
序列長度205
序列類型氨基酸
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型蛋白質(zhì)
起始來源
微生物名稱嗜熱假諾卡氏菌
菌株名JCM3095
中間體來源
克隆名pPT-DB1
序列特征
鑒定方法E
其他信息腈水合酶α亞單位
序列描述
Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu
5 10 15
Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly
20 25 30
Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn
35 40 45
Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr
50 55 60
Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys
65 70 75 80
Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val
85 90 95
Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser
100 105 110
Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu
115 120 125
Pro Gln TyL Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys
130 135 140
Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp
145 150 155 160
Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala
165 170 175
Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg
180 185 190
Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala
195 200 205
(2)序列號(hào)No2
序列長度233
序列類型氨基酸
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型蛋白質(zhì)
起始來源
微生物名稱嗜熱假諾卡氏菌
菌株名JCM3095
中間體來源
克隆名pPT-DB1
序列特征
鑒定方法E
其他信息腈水合酶β亞單位
序列描述
Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile
5 10 15
Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val
20 25 30
Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu
35 40 45
Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gin Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu
50 55 60
Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly
65 70 75 80
Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys
100 105 110
Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro
115 120 125
Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val
130 135 140
Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg
145 150 155 160
Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr
165 170 175
Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His
180 185 190
Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly
195 200 205
Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu
210 215 220
Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala
225 230 233
(3)序列號(hào)No3
序列長度618
序列類型核酸
股數(shù)雙股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型基因組DNA
起始來源
微生物名稱嗜熱假諾卡氏菌
菌株名JCM3095
中間體來源
克隆名pPt-DB1
序列特征
鑒定方法E
其他信息腈水合酶α亞單位
序列描述
ATGACCGAGA ACATCCTGCG CAAGTCGGAC GAGGAGATCC AGAAGGAGAT CACGGCGCGG 60
GTCAAGGCCC TGGAGTCGAT GCTCATCGAA CAGGGCATCC TCACCACGTC GATGATCGAC120
CGGATGGCCG AGATCTACGA GAACGAGGTC GGCCCGCACC TCGGCGCGAA GGTCGTCGTG180
AAGGCCTGGA CCGACCCGGA GTTCAAGAAG CGTCTGCTCG CCGACGGCAC CGAGGCCTGC240
AAGGAGCTCG GCATCGGCGG CCTGCAGGGC GAGGACATGA TGTGGGTGGA GAACACCGAC300
GAGGTCCACC ACGTCGTCGT GTGCACGCTC TGCTCCTGCT ACCCGTGGCC GGTGCTGGGG360
CTGCCGCCGA ACTGGTTCAA GGAGCCGCAG TACCGCTCCC GCGTGGTGCG TGAGCCCCGG420
CAGCTGCTCA AGGAGGAGTT CGGCTTCGAG GTCCCGCGGA GCAAGGAGAT CAAGGTCTGG480
GACTCCAGCT CCGAGATGCG CTTCGTCGTC CTCCCGCAGC GCCCCGCGGG CACCGACGGG540
TGGAGCGAGG AGGAGCTCGC CACCCTCGTC ACCCGCGAGT CGATGATCGG CGTCGAACCG600
GCGAAGGCGG TCGCGTGA 618
(4)序列號(hào)No4
序列長度702
序列類型核酸
股數(shù)雙股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型基因組DNA
起始來源
微生物名稱嗜熱假諾卡氏菌
菌株名CM3095
中間體來源
克隆名pPt-DB1
序列特征
鑒定方法E
其他信息腈水合酶β亞單位
序列描述
ATGAACGGCG TGTACGACGT CGGCGGCACC GATGGGCTGG GCCCGATCAA CCGGCCCGCG 60
GACGAACCGG TCTTCCGCGC CGAGTGGGAG AAGGTCGCGT TCGCGATGTT CCCGGCGACG120
TTCCGGGCCG GCTTCATGGG CCTGGACGAG TTCCGGTTCG GCATCGAGCA GATGAACCCG180
GCCGAGTACC TCGAGTCGCC GTACTACTGG CACTGGATCC GCACCTACAT CCACCACGGC240
GTCCGCACCG GCAAGATCGA TCTCGAGGAG CTGGAGCGCC GCACGCAGTA CTACCGGGAG300
AACCCCGACG CCCCGCTGCC CGAGCACGAG CAGAAGCCGG AGTTGATCGA GTTCGTCAAC360
CAGGCCGTCT ACGGCGGGCT GCCCGCAAGC CGGGAGGTCG ACCGACCGCC CAAGTTCAAG420
GAGGGCGACG TGGTGCGGTT CTCCACCGCG AGCCCGAAGG GCCACGCCCG GCGCGCGCGG480
TACGTGCGCG GCAAGACCGG GACGGTGGTC AAGCACCACG GCGCGTACAT CTACCCGGAC540
ACCGCCGGCA ACGGCCTGGG CGAGTGCCCC GAGCACCTCT ACACCGTCCG CTTCACGGCC600
CAGGAGCTGT GGGGGCCGGA AGGGGACCCG AACTCCAGCG TCTACTACGA CTGCTGGGAG660
CCCTACATCG AGCTCGTCGA CACGAAGGCG GCCGCGGCAT GA 702
(5)序列號(hào)No5
序列長度20
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸合成DNA
序列特征N是A，C，G或T.
序列描述
A C N G A R A A Y A T N Y T N M G N A A 20
(6)序列號(hào)No6
序列長度20
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸合成DNA
序列特征N是A，C，G或T.
序列描述
T T N C K N A R N A T R T T Y T C N G T
(7)序列號(hào)No7 20
序列長度20
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列特征N是A，C，G或T.
序列描述
A T G A A Y G G N G T N T A Y G A N G T 20
(8)序列號(hào)No8
序列長度20
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列特征N是A，C，G或T.
序列描述
A C N T C R T A N A C N C C R T T C A T 20
(9)序列號(hào)No9
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
A A C A T C A T G C G C A A G T C G 18
(10)序列號(hào)No10
序列長度17
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C A G G A A A C A G C T A T G A C17
(11)序列號(hào)No11
序列長度20
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
G G C C A G T G C C T A G C T T A C A T 20
(12)序列號(hào)No12
序列長度17
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
G T T T T C C C A G T C A C G A C 17
(13)序列號(hào)No13
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
A A C A T C A C G C G C A A G T C G18
(14)序列號(hào)No14
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
A A C A T C G C G C G C A A G T C G
(15)序列號(hào)No15
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
A A C A T C G T G C G C A A G T C G 18
(16)序列號(hào)No16
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
A T C A C G G T G C G G G T C A A G18
(17)序列號(hào)No17
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
A C G T C G T T G A T C G A C C G G18
(18)序列號(hào)No18
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
G A C G G C T C C G A G G C C T G C18
(19)序列號(hào)No19
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C A G G C C G A G G A C A T G18
(20)序列號(hào)No20
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
G A C G A G G C C C A C C A C G T C18
(21)序列號(hào)No21
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
CACGTCATCG TGTGCACG
(22)序列號(hào)No22
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
AACTGGTACA AGGAGCCG 18
(23)序列號(hào)No23
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
G A G C C G G A G T A C C G C T C C 18
(24)序列號(hào)No24
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C G G C A G G T G C T C A A G G A G 18
(25)序列號(hào)No25
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
A A G G A G G A C T T C G G C T T C 18
(26)序列號(hào)No26
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
G A G C T C A C C A C C C T C G T C 18
(27)序列號(hào)No27
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C G C G A G T T G A T G A T C G G C18
(28)序列號(hào)No28
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
G C G A A G G A G G T C G C G T G A18
(29)序列號(hào)No29
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C G G C C C G T G G A C G A A C C G18
(30)序列號(hào)No30
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C C C G C G A A C G A A C C G G T C 18
(31)序列號(hào)No31
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C C C G A T C A C G A G C A G 18
(32)序列號(hào)No32
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C C C C C G C A C G A G C A G 18
(33)序列號(hào)No33
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C C C T C G C A C G A G C A G 18
(34)序列號(hào)No34
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C C C C G G C A C G A G C A G18
(35)序列號(hào)No35
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C C C T G C C A C G A G C A G18
(36)序列號(hào)No36
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C C C C T G C A C G A G C A G18
(37)序列號(hào)No37
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C T G C C C A C G C A C G A G C A G18
(38)序列號(hào)No38
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
T T C A C G G A C C A G G A G C T G 18
(39)序列號(hào)No39
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
T T C A C G A T C C A G G A G C T G 18
(40)序列號(hào)No40
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
T T C A C G G T C C A G G A G C T G 18
(41)序列號(hào)No41
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
T T C A C G G A G C A G G A G C T G 18
(42)序列號(hào)No42
序列長度18
序列類型核酸
股數(shù)單股
拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
分子類型其他核酸；合成DNA
序列描述
C C G A A C T A C A G C G T C T A C 18
權(quán)利要求
1.一種腈水合酶，它含有一個(gè)通過用任何其他氨基酸取代序列表中序列號(hào)1的氨基酸序列中的第6位、第19位、第38位、第77位、第90位、第102位、第106位、第126位、第130位、第142位、第146位、第187位、第194位和第203位氨基酸中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸而從所述序列衍生出來的α-亞單位作為組分。
2.一種核酸序列，它編碼具有序列表中序列號(hào)1的氨基酸序列的腈水合酶α-亞單位。
3.一種核酸序列，它編碼具有序列表中序列號(hào)3的核酸序列的腈水合酶α-亞單位。
4.一種核酸序列，它編碼腈水合酶α-亞單位，該序列包含序列表中序列號(hào)3的核酸序列，該序列由于在至少一個(gè)選自以下位點(diǎn)的位點(diǎn)上發(fā)生取代而被修飾
(i)16-18位核苷酸；
(ii)55-57位核苷酸；
(iii)112-114位核苷酸；
(iv)229-231位核苷酸；
(v)268-270位核苷酸；
(vi)304-306位核苷酸；
(vii)316-318位核苷酸；
(viii)376-378位核苷酸；
(ix)388-390位核苷酸；
(x)424-426位核苷酸；
(xi)436-438位核苷酸；
(xii)559-561位核苷酸；
(xiii)580-582位核苷酸；
(xiv)607-609位核苷酸；
其中所述至少一個(gè)取代突變所產(chǎn)生的核酸序列在與編碼腈水合酶β-亞單位的核酸序列共表達(dá)時(shí)產(chǎn)生具有酶活性的腈水合酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了來自嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的氨基酸序列和堿基序列，還提供了一種改變?cè)撾嫠厦傅陌被嵝蛄泻蛪A基序列而幾乎不改變其功能的方法，和具有根據(jù)所述方法改變的堿基序列和氨基酸序列的腈水合酶，并提供了具有該腈水合酶基因的重組質(zhì)粒，含有該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該酶的方法，以及用該轉(zhuǎn)化體由一種腈水化合物生產(chǎn)相關(guān)酰胺化合物的方法。
文檔編號(hào)C12N9/78GK1492043SQ0215618
公開日2004年4月28日 申請(qǐng)日期1997年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月14日
發(fā)明者伊藤潔, 八卷俊文, 文, 夫, 有井輝夫, 行, 鶴岡三行, 中村武史, 史 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社