專利名稱：L－蘇氨酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有微生物參與的L-蘇氨酸的生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的高產(chǎn)方法，在該方法中，將額外的一個或多個拷貝的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因和蘇氨酸操縱子插入到微生物染色體DNA的特殊位點，同時保留微生物固有的ppc基因和蘇氨酸操縱子，以提高ppc基因和某些基因的表達(dá)，其中ppc基因編碼能夠?qū)⒘姿嵯┐急徂D(zhuǎn)化為蘇氨酸生物合成的前體——草酰乙酸的酶；所述的某些基因能夠編碼參與從草酰乙酸到蘇氨酸生物合成路徑的酶，例如天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶(thrA)，高絲氨酸激酶(thrB)，和蘇氨酸合成酶(thrC)。
增加特定基因表達(dá)水平的常用方法是使用能夠為微生物提供更多拷貝數(shù)的質(zhì)粒，以便增加微生物中的基因數(shù)(Sambrook等.，分子克隆，第二版，1989，1.3-1.5)。將一種目的基因整合入質(zhì)粒，然后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主微生物，導(dǎo)致宿主微生物體內(nèi)的基因數(shù)隨著質(zhì)?？截悢?shù)目的增加而增加。在美國專利No.5,538,873中報道了用此類方法提高蘇氨酸產(chǎn)率而獲得部分成功。然而，使用這類重組質(zhì)粒過表達(dá)一種特定基因的大多數(shù)技術(shù)對宿主微生物是不理想的，產(chǎn)生質(zhì)粒不穩(wěn)定的問題，以致于在重組菌株培養(yǎng)過程中質(zhì)粒丟失。
為了解決這一問題，報道過在培養(yǎng)基中添加抗生素或使用一種表達(dá)調(diào)節(jié)質(zhì)粒的方法(Sambrook等.，分子克隆，第二版，1989，1.5-1.6-1.9-1.11)。在使用表達(dá)調(diào)節(jié)質(zhì)粒來生產(chǎn)特定產(chǎn)物時，細(xì)胞培養(yǎng)要在生長期的非表達(dá)條件下進(jìn)行，為的是降低宿主微生物的負(fù)荷，在微生物完全生長以后誘導(dǎo)暫時表達(dá)。但是，大多數(shù)表達(dá)調(diào)節(jié)質(zhì)粒指向蛋白合成。生產(chǎn)初級代謝產(chǎn)物與微生物的生長聯(lián)系緊密，除非目標(biāo)基因在生長期表達(dá)，否則增加初級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量非常困難。作為一種初級代謝產(chǎn)物的蘇氨酸的生產(chǎn)，就是這樣。
為了彌補(bǔ)這一缺點，將一種特定的蘇氨酸生物合成基因插入到染色體DNA中來生產(chǎn)蘇氨酸(美國專利號5,939,307)。然而，這種方法用一種可誘導(dǎo)的啟動子-替代基因來替換染色體基因，很難預(yù)料蘇氨酸操縱子基因的表達(dá)會有顯著提高。
因此，與常規(guī)替代方法不同，本發(fā)明的發(fā)明者將一種額外的ppc基因和蘇氨酸操縱子插入到微生物染色體DNA的特定位點(lacZ基因)，而保留了宿主微生物的原有染色體基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固有的染色體基因以及插入的ppc基因和操縱子產(chǎn)生了雙重效果。大多數(shù)目前應(yīng)用于增加蘇氨酸產(chǎn)量的遺傳工程技術(shù)，都集中于由草酰乙酸開始的生物合成途徑。但是，本發(fā)明還涉及ppc，它是作用于在先步驟中的草酰乙酸誘導(dǎo)酶，以及蘇氨酸生物合成酶，它有目的地引導(dǎo)碳原子從磷酸烯醇丙酮酸流向草酰乙酸合成途徑。如果必要，本發(fā)明還可以插入2個和更多的基因拷貝。
本發(fā)明的目的是通過下面的方法實現(xiàn)的使用微生物來生產(chǎn)L-蘇氨酸，微生物固有的ppc基因和蘇氨酸操縱子被保留，一個或多個拷貝的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因和一個或多個拷貝的蘇氨酸操縱子被額外地整合到微生物染色體DNA的特殊位點。
按照本發(fā)明，通過在染色體DNA中插入兩個或更多拷貝的ppc基因和蘇氨酸操縱子，使編碼下述酶的基因的表達(dá)水平提高，所述酶是將磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為蘇氨酸生物合成的前體——草酰乙酸的酶，以及參與從草酰乙酸到蘇氨酸生物合成路徑的酶例如天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶(thrA)，高絲氨酸激酶(thrB)，和蘇氨酸合成酶(thrC)。
按照本發(fā)明，可以使用能夠生產(chǎn)L-蘇氨酸的任何微生物，包括大腸桿菌、棒狀桿菌、沙雷氏菌屬、和Providencia，但更優(yōu)選大腸桿菌。
額外插入到微生物中的ppc基因和蘇氨酸操縱子，優(yōu)選來源于對蘇氨酸類似物、賴氨酸類似物、異亮氨酸類似物、和甲硫氨酸類似物有抗性的微生物(人工突變體)。
按照本發(fā)明，ppc基因和蘇氨酸操縱子可以額外地插入到染色體DNA的任何位點，除了原始蘇氨酸操縱子，但優(yōu)選插入到lacZ基因位點。
在本發(fā)明的L-蘇氨酸生產(chǎn)方法中，優(yōu)選將從生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株TF4076(KFCC10718)的染色體中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得的ppc基因，和從相同的染色體中通過克隆獲得的蘇氨酸操縱子，插入到宿主大腸桿菌菌株TF4076的染色體中。1、蘇氨酸操縱子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因所使用的蘇氨酸操縱子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因從TF4075(保藏號KFCC10718，韓國專利申請?zhí)?0-22965)的染色體中通過克隆得到。該菌株對甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷，對蘇氨酸類似物(AHVα-氨基-β-羥基戊酸)，賴氨酸類似物(AECS-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸)，異亮氨酸類似物(α-氨基丁酸)和甲硫氨酸類似物(乙硫氨酸)具有抗性。2、整合載體使用pBRINT-TsGm，一種用于染色體整合的質(zhì)粒載體(Sylvie LeBeatriz等.，1998，pBRINT-Ts一種有溫度敏感復(fù)制子的質(zhì)粒家族，為染色體整合入大腸桿菌的lacZ基因而設(shè)計，基因，223，pp213-219)。該載體有溫度敏感性；當(dāng)在37℃培養(yǎng)條件下，該質(zhì)粒將質(zhì)粒的克隆基因整合到染色體DNA的lacZ基因位點，而當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到44℃時，原生質(zhì)中的剩余質(zhì)粒丟失。3、重組載體將ppc基因和蘇氨酸操縱子克隆到pBRINT-TsGm的BamH I和EcoR I位點以構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pGmTN-PPC，其中ppc基因通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從TF4076的染色體中獲得，蘇氨酸操縱子來源于克隆有蘇氨酸操縱子的載體pAT94(韓國專利申請?zhí)?2-24732)。菌株TF4076用重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，隨后在37℃培養(yǎng)，以誘導(dǎo)克隆的ppc基因和蘇氨酸操縱子整合到染色體DNA的lacZ基因位點。而后，繼續(xù)在44℃培養(yǎng)，以去除宿主菌株中的剩余質(zhì)粒。4、篩查方法通過視覺篩查重組菌株，集落的特征如下對慶大霉素有抗性，對羧芐青霉素敏感，在含有X-gal和IPTG的固體培養(yǎng)基里顯白色，不顯藍(lán)色。這種篩查方法的原理基于ppc基因和蘇氨酸操縱子整合入染色體DNA的lacZ基因，使lacZ基因失活，從而丟失了分解發(fā)色團(tuán)X-gal的能力。
比較這些挑選的重組菌株與宿主菌株的蘇氨酸生產(chǎn)能力。結(jié)果，宿主菌株在48小時內(nèi)產(chǎn)生20克/升的蘇氨酸，而pGmTN-PPC(保藏號KCCM-10236)，一種染色體DNA中整合有ppc基因和蘇氨酸操縱子的重組菌株，顯示了最高蘇氨酸生產(chǎn)能力27.0克/升，產(chǎn)量大約是35％(見實施例4)。通過在5升發(fā)酵罐中發(fā)酵，pGmTN-PPC菌株生產(chǎn)了102克/升的蘇氨酸，比宿主菌株的產(chǎn)量高35.4％(見實施例5)。
實施本發(fā)明的最佳方式通過以下實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。以下的實施例是用來舉例的目的，并不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例1磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的克隆克隆磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因的方法描述于

圖1中。ppc基因是從蘇氨酸產(chǎn)生菌株-TF4076中獲得的。分離染色體DNA，用限制酶Sal I消化，將其電泳以選擇性地分離4-5Kb DNA片段。將分離的DNA片斷作為模板，使用引物1(5’-aggaattcttccgcagcatttgacgtcac-3’)和引物2(5’-aggaagcttttagccggtattacgcatacc-3’)，擴(kuò)增ppc基因。用EcoRI和HindIII消化擴(kuò)增產(chǎn)物，而后再次將其電泳以最終分離一種2.8Kb的ppc基因片段。用來一種自墨西哥國立大學(xué)的7.6Kb的pBRINT-TsGm(一種pBRINT-Ts載體)來克隆(Sylvie Le Beatriz等.，1998，pBRINT-Ts一種有溫度敏感復(fù)制子的質(zhì)粒家族，為染色體整合入大腸桿菌的lacZ基因而設(shè)計，基因，223，pp213-219)。用相同的限制酶EcoR I和HindIII雙消化pBRINT-TsGm，用T4 DNA連接酶將其與分離的ppc基因片段連接。通過電穿孔，用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，在含有抗生素50毫克/升羧芐青霉素和5毫克/升慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基(酵母抽提物5克/升；細(xì)菌用胰蛋白胨10克/升、氯化鈉10克/升；細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂1.7％；pH7.0)上培養(yǎng)。接下來，收集單集落。將單集落在含有相同抗生素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)以從生長菌株中分離質(zhì)粒。首先鑒別每個質(zhì)粒的大小并且用限制酶EcoR I和HindIII雙消化，以分離出2.8Kb的DNA片段。鑒別所得到的DNA片段，由此完成含有ppc基因的重組質(zhì)粒pGmPPC(10.7Kb)的構(gòu)建。實施例2含有蘇氨酸操縱子和ppc基因的染色體DNA整合載體用TF4076的染色體DNA克隆構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體pAT94(韓國專利申請?zhí)?2-24732)，被用于蘇氨酸操縱子，實施例1中的重組質(zhì)粒pGmPPC被用于ppc基因。來自墨西哥國立大學(xué)的pBRINT-TsGm(一種pBRINT-Ts載體)被用作染色體DNA整合載體(Sylvie Le Beatriz等.，1998，pBRINT-Ts一種有溫度敏感復(fù)制子的質(zhì)粒家族，為染色體整合入大腸桿菌的lacZ基因而設(shè)計.，基因.，pp213-219)。圖2闡述了重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。用限制酶HindIII和BamHI雙消化pAT94。用電泳從雙消化物中分離出6.4千堿基對的蘇氨酸操縱子DNA片段。用HindIII和EcoRI雙消化pGmPPC以分離出2.8千堿基對的ppc基因片斷。用EcoRI和BamHI消化pBRINT-TsGm質(zhì)粒載體，用同樣方法分離完全消化的DNA片段。將得到的質(zhì)粒載體消化產(chǎn)物、分離的蘇氨酸操縱子DNA片段、和ppc基因片斷混和，用T4 DNA連接酶連接。通過電穿孔用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，在含有抗生素50毫克/升羧芐青霉素、5毫克/升慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基(酵母抽提物5克/升；細(xì)菌用胰蛋白胨10克/升、氯化鈉10克/升；細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂1.7％；pH7.0)上培養(yǎng)。接下來，收集單集落。將單集落在含有相同抗生素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)以從生長菌株中分離質(zhì)粒。首先鑒別每個質(zhì)粒的大小并且用限制酶EcoR I和HindIII雙消化以分離出9.2和7.9千堿基對的DNA片段。鑒別所得到的DNA片段，由此完成對含有蘇氨酸操縱子和ppc基因的重組質(zhì)粒pGmTN-PPC(17.1千堿基對)的構(gòu)建。實施例3整合有染色體重組質(zhì)粒菌株的篩查用從大腸桿菌菌株DH5α中分離出來的重組質(zhì)粒pGmTN-PPC轉(zhuǎn)化TF4076(一種蘇氨酸產(chǎn)生株)，在含有5毫克/升慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基(酵母抽提物5克/升；細(xì)菌用胰蛋白胨10克/升、氯化鈉10克/升；細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂1.7％；pH7.0)上培養(yǎng)，在30攝氏度培養(yǎng)60個小時。將每個單集落接種到0.5毫升的LB中，30攝氏度下培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)物的等分試樣轉(zhuǎn)移到10毫升的LB中，30攝氏度下培養(yǎng)6小時，而后37攝氏度下過夜。將培養(yǎng)物的10-3-10-6的稀釋物接種到含有5毫克/升慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基中。此時，也將12微升的IPTG(0.1M)和60微升的X-gal(2％)接種到LB固體培養(yǎng)基上。44攝氏度下培養(yǎng)24小時，篩查對羧芐青霉素敏感的、呈白色集落狀的重組菌株，該集落不能在含有15毫克/升的羧芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上生長。經(jīng)篩查的重組菌株確證存在預(yù)期的質(zhì)粒，其中ppc基因和蘇氨酸操縱子被整合到每個菌株染色體DNA的lacZ基因位點。實施例4燒瓶培養(yǎng)重組菌株的蘇氨酸生產(chǎn)能力比較通過使用錐形燒瓶中的蘇氨酸滴度培養(yǎng)基，篩查了30個重組菌株的單集落來對蘇氨酸的生產(chǎn)能力作比較，其中重組菌株的染色體中整合有重組質(zhì)粒。每種情況所用的蘇氨酸滴度培養(yǎng)基組合物列在表1中。集落在32攝氏度的培養(yǎng)箱中，在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。用一鉑環(huán)量的每種培養(yǎng)物接種20毫升的滴度培養(yǎng)基，在32攝氏度，250轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘的條件下培養(yǎng)48小時。分析結(jié)果見表2。重組菌株的所有30個集落都顯示出極好的生產(chǎn)能力，包括有8個集落生產(chǎn)出26克/升或更高蘇氨酸，與宿主菌株TF3076比較，TF3076只生產(chǎn)出20克/升的蘇氨酸。這種重組菌株被命名為“pGmTN-PPC12”，該重組菌株記錄了最高蘇氨酸生產(chǎn)能力27.0克/升，比宿主菌株的產(chǎn)量高了35％。pGmTN-PPC12菌株于2001年1月5日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號KCCM10236。
表1.蘇氨酸滴度培養(yǎng)基組合物
表2.重組菌株燒瓶滴度測試的結(jié)果
實施例5使用發(fā)酵罐比較蘇氨酸生產(chǎn)能力發(fā)酵罐中蘇氨酸的生產(chǎn)能力在重組菌株pGmTN-PPC12與宿主菌株TF4076之間作比較，其中的重組菌株選自實施例4中的其最高蘇氨酸滴度。使用的初始培養(yǎng)基組合物見表3。還包含有10克/升的葡萄糖和0.1克L-甲硫氨酸的LB培養(yǎng)基用來作種子培養(yǎng)，接種到發(fā)酵罐中的初始體積被確定在3-5％目的初始培養(yǎng)的體積。每次加入葡萄糖使終濃度為5％重量，伴隨加入的KH2PO4為1％重量，加入次數(shù)超過6次。在這里，每一次葡萄糖的添加取決于葡萄糖的缺失。培養(yǎng)的起始體積為1.5升，終末體積為3.0升。通過發(fā)酵作用添加的葡萄糖總濃度為250克/升。在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基攪動率為700-1000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘，溫度控制在32攝氏度，用25-28％的氨水將PH值調(diào)節(jié)在7.0?？諝饬鲃勇收{(diào)節(jié)到0.1vvm。結(jié)果見表4。如表4所示，宿主菌株TF4076生產(chǎn)出75.3克/升的蘇氨酸，產(chǎn)量相對于葡萄糖消耗量為30.1％。相比較，重組菌株pGmTN-PPC12生產(chǎn)出102克/升的蘇氨酸，產(chǎn)量為40.8％，比宿主菌株TF4076高出35.4％。此外，在重組菌株中觀察到了與宿主菌株類似的發(fā)酵模式，在發(fā)酵過程中沒有糖耗的降低，由于生長抑制，這種情況常常出現(xiàn)在重組菌株中。
表3. 5升發(fā)酵罐中的初始培養(yǎng)基組合物
表4.重組菌株的蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)果
如上所述，依照本發(fā)明，2個或多個ppc基因和蘇氨酸操縱子被包含在染色體DNA中，由此提高ppc基因和某些基因的表達(dá)，其中，ppc基因編碼一種酶，該酶能夠?qū)⒘姿嵯┐急徂D(zhuǎn)化為蘇氨酸生物合成的前體——草酰乙酸；所述的某些基因能夠編碼酶，這些酶參與從草酰乙酸到蘇氨酸的生物合成路徑，例如thrA(天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶)，thrB(高絲氨酸激酶)，thrC(蘇氨酸合成酶)。本發(fā)明可以顯著提高L-蘇氨酸的生產(chǎn)能力，比宿主菌株高出35％。
權(quán)利要求
1.一種使用微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，其中，微生物固有的ppc基因和蘇氨酸操縱子被保留，一個或多個拷貝的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和蘇氨酸操縱子被額外地插入到微生物染色體DNA的特定位點。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的微生物是大腸桿菌。
3.權(quán)利要求1的方法，其中被額外整合到微生物中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和蘇氨酸操縱子來源于微生物，該微生物對蘇氨酸類似物、賴氨酸類似物、異亮氨酸類似物、和甲硫氨酸類似物有抗性。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和蘇氨酸操縱子被額外地整合到染色體DNA的lacZ基因位點。
5.權(quán)利要求1的方法，其中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和蘇氨酸操縱子被整合到宿主菌株大腸桿菌TF4076的染色體中，所述的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從蘇氨酸生產(chǎn)大腸桿菌菌株，保藏號為KFCC10718的TF4076的染色體中獲得，所述的蘇氨酸操縱子從所述的大腸桿菌染色體中通過克隆獲得。
6.權(quán)利要求1的方法，其中的微生物用圖2中的重組質(zhì)粒pGmTN-PPC構(gòu)建。
7.能夠生產(chǎn)L-蘇氨酸的、保藏號為KCCM10236的大腸桿菌菌株pGmTN-PPC12。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用微生物生產(chǎn)L－蘇氨酸的方法。在該方法中，微生物固有的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因和蘇氨酸操縱子被保留，額外的一個或多個拷貝的每種ppc基因和蘇氨酸操縱子被整合到微生物染色體DNA的特殊位點。因此，微生物染色體DNA中包含了兩個或兩個以上的ppc基因和蘇氨酸操縱子，從而提高了ppc基因和某些基因的表達(dá)，其中ppc基因編碼一種能將磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為蘇氨酸生物合成前體——草酰乙酸的酶；所述的某些基因能夠編碼參與從草酰乙酸到蘇氨酸生物合成路徑的酶，包括thrA(天冬氨酸激酶－高絲氨酸脫氫酶)，thrB(高絲氨酸激酶)，和thrC(蘇氨酸合成酶)，因此顯著提高了L－蘇氨酸的生產(chǎn)能力。
文檔編號C12R1/19GK1457365SQ02800304
公開日2003年11月19日 申請日期2002年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月13日
發(fā)明者魯甲秀, 金永哲, 樸宰鏞, 金大哲, 李珍鎬, 玉承漢 申請人:第一制糖株式會社