專利名稱：一種提高雜交核酸檢測靈敏度的方法
背景技術(shù)：
基于探針的測定用于檢測、定量以及分析核酸。長時(shí)間以來，核酸探針一直用于細(xì)菌、真菌、病毒或其它生物體的樣品分析，以便檢查靶核酸的存在(參見美國專利號(hào)4,851,330；美國專利號(hào)5,288,611；美國專利號(hào)5,567,587；美國專利號(hào)5,601,984；美國專利號(hào)5,612,183)。此外，基于探針的測定用于診斷遺傳疾病。然而，由于在特異性、靈敏度和可靠性方面不能滿足要求，基于探針的測定還沒有商業(yè)化應(yīng)用于本領(lǐng)域中。
最近，人類基因組的序列分析已推動(dòng)了開發(fā)DNA芯片來分析基因組序列和診斷疾病。DNA芯片的制備是將已知序列的單鏈DNA探針以高密度固定在固相支持物如硅或玻璃上。一旦未知樣品反應(yīng)到芯片上，芯片上的探針與未知樣品中的互補(bǔ)DNA就發(fā)生雜交。通過檢測芯片上的所述雜交，可確定未知樣品中的核酸序列。
通過使用DNA芯片，可以簡單、同時(shí)進(jìn)行的方式分析大量的遺傳信息，并研究基因間的相互關(guān)系，從而使得DNA芯片廣泛應(yīng)用于遺傳疾病和癌癥的診斷、突變體的研究、病原微生物的檢測、基因表達(dá)的分析以及新藥開發(fā)的領(lǐng)域中。此外，芯片適用于幾乎所有的生物工業(yè)，如通過篩選編碼解毒物質(zhì)的基因來大量生產(chǎn)解毒劑，并利用其作為微生物或環(huán)境污染的傳感器，醫(yī)用植物和低脂肉的生產(chǎn)。那時(shí)，這將給生物工業(yè)帶來革命性的發(fā)展。
DNA芯片分為兩組，即依據(jù)其上的探針種類分為寡芯片和cDNA芯片，并依據(jù)芯片制作方法分為影印石版芯片、針形定點(diǎn)芯片、噴墨型定點(diǎn)芯片和電子定址DNA芯片。然而，到現(xiàn)在為止，所有DNA芯片有共同點(diǎn)，即各種單鏈DNA探針固定在芯片上，通過測量與靶DNA的雜交程度可獲得所需的信息。
因此，為了得到精確的結(jié)果，極其重要的是開發(fā)檢測方法，其可保證靶DNA與芯片上探針DNA的雜交信號(hào)準(zhǔn)確。
傳統(tǒng)DNA芯片檢測芯片表面上殘余信號(hào)的方法是給靶DNA標(biāo)記熒光并用標(biāo)記后的靶DNA與芯片上的探針反應(yīng)之后，通過共焦顯微鏡或CCD照相機(jī)進(jìn)行(參見美國專利號(hào)6,141,096)。在熒光成像分析中，為提高附著到芯片表面的熒光數(shù)量，已進(jìn)行了各種研究，以便采用相對(duì)低價(jià)的CCD型掃描儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)的昂貴的共焦型掃描儀來檢測信號(hào)。例如，運(yùn)用了多種方法，如采用三維水凝膠墊的方法(參見Anal.Biochem.，25934-41，1998)、利用樹形聚體(dendrimer)來提高探針和熒光密度的方法(參見美國專利號(hào)6,117,631)以及利用具有特異孔形的玻璃支持物將探針固定到孔狀表面上的方法(參見Microarray Biochip Technology，第87-117頁，Mark Schena編，2000 BioTechniques Books，Natick，MA，U.S.A.)。
然而，現(xiàn)有的光學(xué)檢測方法已證明在一定意義上并不令人滿意，因?yàn)闄z測少量的雜交信號(hào)、由于背景噪音準(zhǔn)確檢測信號(hào)、微型化以及得到數(shù)字化輸出是很困難的。為了克服所述缺陷，人們正實(shí)施許多方法來開發(fā)新的檢測方法，其中得到的結(jié)果是電信號(hào)而非光信號(hào)形式。
利用傳導(dǎo)金屬化合物憑借電化學(xué)技術(shù)來檢測DNA雜交的方法在本領(lǐng)域中已有報(bào)道(參見美國專利號(hào)6,096,273；美國專利號(hào)6,090,933)，其中通過測量DNA雜交后傳導(dǎo)金屬復(fù)合體的氧還標(biāo)記用電化學(xué)法檢測DNA雜交(參見Anal.Chem.，704670-4677，1998；J.Am.Chem.Soc.，1199861-9870，1997；Analytica Chimica Acta，286219-224，1994；Bioconjugate Chem.，8906-913，1997)。
此外，沒有熒光或其它標(biāo)記物質(zhì)的雜交分析的研究正處于積極進(jìn)展中。例如，一種方法是利用微型制作的懸臂測量DNA寡聚體探針和靶DNA之間結(jié)合容量，通過這種方法可分析單個(gè)核酸的差異(參見Science，288316-318，2000)。此外，利用石英晶體微型天平(參見Anal.Chem.，701288-1296，1998)或利用MALDI質(zhì)譜儀(MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization mass spectrometry)來測量由DNA雜交所導(dǎo)致的質(zhì)量差異的方法也在開發(fā)中(參見Anal.Chem.，694540-4546，1997；美國專利號(hào)6,043,031)。
如上所述，在所有利用互補(bǔ)DNA結(jié)合、DNA芯片中所用的檢測方法中，通過使雜交前信號(hào)和雜交后信號(hào)的差異最大化，可提高雜交DNA的檢測靈敏度。因此，預(yù)期通過減少或去除由未雜交單鏈探針?biāo)鶎?dǎo)致的背景信號(hào)，或通過減少或去除由靶核酸與探針的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致的信號(hào)，可提高雜交DNA的檢測準(zhǔn)確性和選擇性。
所以，本發(fā)明的主要目的是提供通過采用核酸酶從固相支持物上去除未雜交核酸探針來提高雜交核酸的檢測靈敏度的方法，所述雜交核酸固定在用于遺傳分析的傳感裝置的固相支持物上。
圖2是熒光成像圖，表示DNA芯片的表面，在其上FITC標(biāo)記的靶DNA在核酸外切酶I處理后與探針雜交。
圖3是熒光成像圖，表示DNA芯片的表面，在其上FITC標(biāo)記的靶DNA與探針雜交之后用核酸外切酶I處理。
圖4表示通過BIAcore測定DNA芯片上固定探針在數(shù)量上的變化。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，其包括下列步驟將已知序列的探針固定在用于遺傳分析的傳感裝置的固相支持物上，使靶DNA與DNA芯片雜交，以及在核酸酶作用下去除殘留的單鏈DNA探針。用于遺傳分析的傳感裝置的固相支持物包括平面、非孔狀的固相支持物，如玻璃、石英、硅、塑料等。


圖1是示意圖，表示在核酸酶作用下提高雜交核酸監(jiān)測靈敏度的原理，其中(A)、(B)和(C)分別表示DNA探針在其上固定的DNA芯片的表面、靶DNA與芯片上的探針雜交后的DNA芯片以及經(jīng)核酸酶處理后的DNA芯片。核酸探針包括DNA、RNA或PNA(肽核酸)；核酸酶包括核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶，其獨(dú)立地消化單鏈核酸或其混合物，這些酶的例子是核酸外切酶I、S1核酸酶、綠豆核酸酶、核糖核酸酶A、核糖核酸酶T1以及核酸酶P1。
本發(fā)明方法適用于所有通過雜交有效區(qū)分單鏈和雙鏈核酸的檢測方法，如檢測熒光信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)、質(zhì)量、電荷或光信號(hào)的差異的方法。
下列實(shí)例將進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其不應(yīng)看著是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1雜交前用外切核酸酶I處理去除單鏈DNA探針實(shí)施例1-1探針固定通過移液管定點(diǎn)各0.5μl寡聚體，將具有氨基取代的5′末端或3′末端的寡聚體(15聚體，100pmol/μl)固定在用醛基(SuperAldehyde底物，TeleChem International公司，美國)包被的載玻片上。定點(diǎn)后，載玻片干燥12小時(shí)，25℃下洗滌以去除未附著到玻璃表面上的探針和殘余的定點(diǎn)溶液，然后再干燥。載波片用0.2％(w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)洗滌兩次共5分鐘，用95℃的蒸餾水洗滌兩次共5分鐘，用25℃的硼氫化鈉洗滌兩次共5分鐘，用0.2％(w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)洗滌兩次共1分鐘，以及用25℃的蒸餾水洗滌兩次共1分鐘。然后，將固定的寡聚體探針用FITC(熒光素-5-異硫氰酸)標(biāo)記。
1-2核酸外切酶I的酶反應(yīng)用20μl緩沖液中的10個(gè)單位核酸外切酶I處理含有固定探針的載玻片，固定探針以實(shí)施例1-1相同方法制備，以及載玻片在37℃下溫育1-2小時(shí)。
實(shí)施例1-3成像分析利用Scanarray 5000(GSI Lumonics，美國)分析熒光信號(hào)。
圖2是熒光成像圖片，表示DNA芯片的表面，經(jīng)核酸外切酶I處理后在其上FITC-標(biāo)記的靶DNA與探針雜交。
在圖2中，(A)、(B)和(C)分別表示含有探針的芯片的表面，所述探針其3′末端固定在表面以及5′末端標(biāo)記有FITC；含有探針的芯片，所述探針其5′末端固定在表面以及3′末端標(biāo)有熒光探針；以及含有探針的芯片，所述探針其5′末端固定在表面以及3′末端為未標(biāo)記的羥基基團(tuán)。在(A)和(B)中，(I)是熒光成像圖，表示核酸外切酶I處理前的DNA芯片的表面，以及(II)是熒光成像圖，表示核酸外切酶I處理后的DNA芯片的表面。在(C)中，(I)是熒光成像圖，表示DNA芯片的表面，其探針與未經(jīng)核酸外切酶I處理的FITC-標(biāo)記的靶DNA探針雜交，以及(II)是熒光成像圖，表示DNA芯片的表面，其探針與經(jīng)核酸外切酶I處理后的FITC-標(biāo)記的靶DNA探針雜交。如圖2中所見，在兩種利用探針的情況下，所述探針如(A)中所述其3′末端固定在表面，或如(B)所述其3′末端標(biāo)記有熒光物質(zhì)，熒光成像沒有任何區(qū)別，這是因?yàn)楹怂嵬馇忻窱沒有適當(dāng)?shù)仄鸱磻?yīng)。另一方面，在利用如(C)中所述其3′末端是未標(biāo)記的羥基基團(tuán)的探針的情況下，有或沒有核酸外切酶I處理，熒光成像因?yàn)槊赣行结樁泻艽蟮牟町悺?br> 該結(jié)果與核酸外切酶I的特性一致，核酸外切酶I按照3′-5′的方向水解單鏈DNA，并僅僅識(shí)別單鏈DNA的3′末端，而不識(shí)別雙鏈DNA的末端，更具體而言，是識(shí)別帶有羥基基團(tuán)的3′末端。
實(shí)施例2與靶DNA雜交后通過核酸外切酶I處理來去除單鏈DNA實(shí)施例2-1探針的固定按照實(shí)施例1-1相似的方式固定DNA寡聚體。
實(shí)施例2-2靶DNA的雜交將雜交溶液(UniHybTM Hybridization Solution，TeleChemInternational公司，美國)中10μl的FITC標(biāo)記的靶DNA(15聚體，匹配極佳的寡核苷酸)加入到含有固定探針的載玻片上，所述固定探針按實(shí)施例1-1相同的方法制備，以及載玻片與蓋玻片一起37℃下溫育2-4小時(shí)。
實(shí)施例2-3核酸外切酶I的酶反應(yīng)在載玻片上進(jìn)行酶反應(yīng)，在其上采用實(shí)施例2-2中相同的方法以實(shí)施例1-2中相似的方式進(jìn)行DNA探針雜交。
實(shí)施例2-4成像分析熒光成像的分析方法與實(shí)施例1-3中相同。
圖3是熒光成像圖，表示DNA芯片的表面，在其上FITC-標(biāo)記的靶DNA與芯片上的探針雜交后用核酸外切酶I處理。在圖3中，(I)和(II)分別表示DNA芯片的表面，其探針與未經(jīng)核酸外切酶I處理的FITC-標(biāo)記的靶DNA雜交，以及其探針與經(jīng)核酸外切酶I處理的FITC標(biāo)記的靶DNA雜交。
如圖3所示，DNA雜交后經(jīng)核酸外切酶I處理導(dǎo)致熒光信號(hào)的少許下降。還似乎去除了非特異的背景信號(hào)，這是因?yàn)榻?jīng)核酸外切酶I處理后對(duì)照斑點(diǎn)幾乎完全去除(從上數(shù)第5個(gè)點(diǎn))。
實(shí)施例3雜交后利用核酸外切酶I處理來去除單鏈DNA探針的定量分析實(shí)施例3-1探針的固定將100nmol的35聚體DNA以10μl/分鐘的流速在作為表面反應(yīng)器的含有鏈霉抗生物素的芯片上固定5分鐘。然后，用含有1M NaCl的50mM NaOH溶液洗滌兩次共1分鐘。生物素附著于寡聚體DNA探針的末端。
通過SPR(表面胞質(zhì)基因共振)3000系統(tǒng)(BIACore)對(duì)所述過程進(jìn)行分析(參見圖4)。在圖4中，實(shí)線表示其5′末端固定于芯片的表面以及3′末端具有羥基基團(tuán)的探針，以及虛線表示其3′末端固定于芯片的表面以及5′末端具有羥基基團(tuán)的探針。
如圖4所示，在利用5′末端固定探針的情況下，共振信號(hào)的變化為842.4RU，而在利用3′末端固定探針的情況下，共振信號(hào)的變化為892.9RU?？紤]到1RU變化相當(dāng)于1pg/mm2，兩種固定探針的數(shù)量似乎是相同的。
實(shí)施例3-2核酸外切酶I的酶反應(yīng)用1單位/μl的核酸外切酶I處理芯片，采用實(shí)施例3-1中的相同方法以10μl/分鐘的流速將探針在芯片上固定5分鐘，接著進(jìn)行SPR分析。
如圖4所示，在利用5′末端固定探針的情況下，共振信號(hào)減少到602.2RU(實(shí)線)，而在利用3′末端固定探針的情況下，共振信號(hào)沒有差異(虛線)。這些結(jié)果證實(shí)核酸外切酶I僅識(shí)別并水解單鏈DNA的3′末端羥基基團(tuán)。
如上清楚地說明和論證，本發(fā)明提供了通過核酸酶的作用從固相支持物上去除未雜交核酸來提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，所述雜交核酸固定在用于遺傳分析的傳感裝置的固相支持物上。根據(jù)本發(fā)明方法，減少或去除與靶核酸未雜交的單鏈探針?biāo)鶎?dǎo)致的背景信號(hào)，或靶核酸與探針非特異性結(jié)合所導(dǎo)致的信號(hào)，這以高精確性提高雜交的檢測靈敏度，并使雜交核酸在采用傳統(tǒng)方法洗滌背景信號(hào)過程中的損失降到最低。
權(quán)利要求
1.一種提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，所述雜交核酸固定在用于遺傳分析的傳感裝置的固相支持物上，所述方法包含利用核酸酶從固相支持物上去除未雜交核酸探針的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，其中所述用于遺傳分析的傳感裝置的固相支持物是玻璃、石英、硅或塑料。
3.權(quán)利要求1所述的提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，其中所述用于遺傳分析的傳感裝置是核酸以高密度固定在其上的芯片。
4.權(quán)利要求1或3所述的提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，其中所述核酸是DNA、RNA或PNA(肽核酸)。
5.權(quán)利要求1所述的提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，其中所述核酸酶是獨(dú)立地消化單鏈核酸或其混合物的核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶。
6.權(quán)利要求5所述的提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，其中所述核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶是核酸外切酶I、S1核酸酶、綠豆核酸酶、核糖核酸酶A、核糖核酸酶T1或核酸酶P1。
7.權(quán)利要求1所述的提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，其中所述雜交核酸通過熒光、電化學(xué)信號(hào)、質(zhì)量、電荷或光學(xué)信號(hào)的差異來進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供通過核酸酶作用從固相支持物上去除未雜交核酸探針來提高雜交核酸檢測靈敏度的方法，所述雜交核酸固定在用于基因測定的傳感裝置的固相支持物上。依據(jù)本發(fā)明方法，降低或去除了未與靶核酸雜交的單鏈探針?biāo)鶎?dǎo)致的背景信號(hào)或者靶核酸與探針非特異結(jié)合所導(dǎo)致的信號(hào)，這以高精確度提高了雜交的檢測靈敏度，并使雜交核酸在采用常規(guī)方法去除背景信號(hào)過程中的損失降到最低。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1461349SQ02801273
公開日2003年12月10日 申請(qǐng)日期2002年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月17日
發(fā)明者趙允卿, 林熹均 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社