專(zhuān)利名稱(chēng)：用于在植物中產(chǎn)生番茄黃葉卷縮病毒抗性的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的產(chǎn)生與政府支持的研究項(xiàng)目相關(guān)，其USDA資助號(hào)為99343628423，98341356784和99341358478。政府對(duì)本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
相關(guān)申請(qǐng)的相互參照本申請(qǐng)要求2002年5月7日申請(qǐng)的、系列號(hào)為60/289,315的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)利。
背景技術(shù)：
由粉虱傳播的雙生病毒已經(jīng)成為佛羅里達(dá)、加勒比海和大多拉丁美洲地區(qū)番茄生產(chǎn)的主要限制因素。這一病毒群目前正在西半球蔓延，并且在過(guò)去的15年中，在這一區(qū)域已鑒定的感染番茄的雙生病毒的數(shù)目已經(jīng)從3種增加到超過(guò)17種(Polston和Anderson，1997)。這種蔓延還在持續(xù)，并且?guī)缀趺總€(gè)月都有關(guān)于新的流行報(bào)道。由粉虱傳播的病毒單獨(dú)出現(xiàn)，并與其他雙生病毒或其他病毒混合感染。在許多國(guó)家由粉虱傳播的雙生病毒使番茄產(chǎn)量減少，也使總的作物產(chǎn)量普遍受損(Polston和Anderson，1997)。在佛羅里達(dá)，由于番茄斑點(diǎn)病毒(ToMoV)和番茄黃葉卷縮病毒(TYLCV)感染使番茄產(chǎn)量遭受?chē)?yán)重?fù)p失(1990-91估計(jì)為12500萬(wàn)美元)，其中所述番茄斑點(diǎn)病毒在1989年首次出現(xiàn)，這些病毒感染都導(dǎo)致了作物損害和由于使用的殺蟲(chóng)劑增加帶來(lái)的生產(chǎn)成本增加。
雙生病毒科(Geminiviridae)可分為三個(gè)屬，其中由粉虱傳播的雙生病毒屬于雙生病毒(Begomovirus)屬。在雙生病毒屬中有單分基因組和雙分基因組兩個(gè)主分類(lèi)。雙生病毒的分類(lèi)還不是很清楚，因?yàn)樵谛蛄蟹治鐾瓿芍安《臼前醇膊“Y狀來(lái)命名的。這些病毒中的許多病毒在同一宿主內(nèi)引起相似的癥狀，這就導(dǎo)致在文獻(xiàn)中差別很大的病毒具有相同或相關(guān)的名稱(chēng)。這對(duì)番茄黃葉卷縮病毒(TYLCV)來(lái)說(shuō)尤其如此。有八種單獨(dú)的雙生病毒被稱(chēng)為T(mén)YLCV。最近出版了解決上述命名混淆的建議，但沒(méi)有一條被所有的病毒學(xué)家接受，結(jié)果就是不同的病毒用許多不同的方式表示。使用Fauquet和Mayo(1999)建議的方案，可將這8種病毒根據(jù)其被第一次描述時(shí)所在的國(guó)家鑒定為來(lái)自中國(guó)(TYLCV-Ch)、來(lái)自以色列(也是第一種被描述的病毒)(TYLCV-Is)、來(lái)自尼日利亞(TYLCV-Ng)、來(lái)自薩迪尼亞(TYLCV-Sar)、來(lái)自南沙特阿拉伯(TYLCV-SSA)、來(lái)自坦桑尼亞(TYLCV-Tz)、來(lái)自泰國(guó)(TYLCV-Th)和來(lái)自也門(mén)(TYLCV-Ye)。因此，雖然上述每一種病毒都被稱(chēng)為T(mén)YLCV，但每種病毒具有獨(dú)特的序列，在基因組同源性小于90％。
稱(chēng)為番茄黃葉卷縮病毒以色列株(TYLCV-Is)的雙生病毒曾導(dǎo)致多米尼加共和國(guó)的番茄生產(chǎn)遭受廣泛損失(Polston和Anderson評(píng)論，1997)，1997年在佛羅里達(dá)也發(fā)現(xiàn)了這種病毒(Polston等人，1999)。在美國(guó)(佛羅里達(dá)、佐治亞、路易斯安那和密西西比)、加勒比(巴哈馬群島、古巴、多米尼加共和國(guó)、波多黎各和牙買(mǎi)加)、墨西哥、日本、歐洲和地中海(加那利群島、埃及、以色列、塞浦路斯、意大利、西班牙、葡萄牙和摩洛哥)番茄的TYLCV-Is感染是一嚴(yán)重的問(wèn)題。TYLCV-Is的發(fā)病率在增加，最近一次的經(jīng)濟(jì)損失就發(fā)生在1998年秋。在佛羅里達(dá)TYLCV-Is病毒廣泛傳播，很可能在未來(lái)幾年中不斷增長(zhǎng)，并成為佛羅里達(dá)番茄生產(chǎn)的主要限制。目前市場(chǎng)上幾乎沒(méi)有TYLCV-Is感染抗性的番茄商業(yè)性栽培品種。將這種抗性歸類(lèi)為耐受性，因?yàn)楸桓腥镜闹参锊⒉伙@示癥狀或顯示輕微癥狀，而且產(chǎn)量也相對(duì)地不受感染影響，但是仍能在病毒接種過(guò)的植物中檢測(cè)到病毒，且這些接種植物可以作為易感染栽培品種或作物的接種物來(lái)源(Lapidot等人，2001)。
很難通過(guò)新鮮番茄的銷(xiāo)售對(duì)雙生病毒進(jìn)行經(jīng)濟(jì)地控制，也不可能在番茄加工過(guò)程中進(jìn)行實(shí)用的管理。目前，主要通過(guò)使用單一的殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉(Bayer農(nóng)業(yè)產(chǎn)品公司，堪薩斯城，MO)減少粉虱這一載體的數(shù)量來(lái)控制雙生病毒。對(duì)這種殺蟲(chóng)劑的耐受性已有報(bào)道(Cahill等人，1996；Williams等人，1996)。在美國(guó)和其他地區(qū)吡蟲(chóng)啉失去效用只是時(shí)間早晚的問(wèn)題。從1994到1997年佛羅里達(dá)的番茄種植者平均每英畝花費(fèi)近250美元用于殺蟲(chóng)劑來(lái)控制ToMoV。而對(duì)于美國(guó)的種植者來(lái)說(shuō)用于控制TYLCV-Is的花費(fèi)會(huì)增加的更多。在加勒比國(guó)家雙生病毒已使很多中小規(guī)模的番茄種植者由于生產(chǎn)成本增加和產(chǎn)量損失而破產(chǎn)。在以色列，已產(chǎn)生吡蟲(chóng)啉耐受性，只能在殺蟲(chóng)劑基礎(chǔ)上增加其他排除措施來(lái)控制TYLCV-Is將番茄種植在由能阻擋粉虱的遮蔽材料圍繞的屋內(nèi)，或田里的遮蔽隧道內(nèi)。使用這些方法費(fèi)用高而且往往并不是經(jīng)濟(jì)上或園藝上實(shí)用的選擇。最經(jīng)濟(jì)且最實(shí)用的控制由粉虱傳播的雙生病毒的方法就是使用抗性栽培品種。目前尚無(wú)對(duì)西半球本土的雙生病毒具有抗性的市售番茄栽培品種。如上文所述，在美國(guó)只有兩種對(duì)TYLCV-IS具有耐受性的栽培品種適合生產(chǎn)?？剐詠?lái)自野生的番茄屬(Lycopersicon)，可能是L.peruvianum和L.pimpinellifolium。
有一些報(bào)道表明，編碼雙生病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)的基因可用于病毒感染抗性。曾有一篇報(bào)道，將NTP結(jié)合基序突變的ToMoV Rep轉(zhuǎn)入番茄植株證實(shí)干擾病毒復(fù)制(Stout等人，1997)。Hanson等人(1999)分析了BGYMV(大豆金黃花葉病毒)的Rep基因NTP結(jié)合基序發(fā)生突變的表型，證實(shí)NTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域在復(fù)制中是必需的。他們提出該基序的突變可在反式顯性負(fù)干涉方案中用作對(duì)病原體來(lái)源的抗性(也被稱(chēng)為顯性負(fù)突變)。Nicotianabenthamiana植物中對(duì)非洲木薯花葉雙生病毒(ACMV)的抗性就是通過(guò)用ACMV Rep轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的(Hong和Stanley，1996)。
有報(bào)道用來(lái)自薩迪尼亞的雙生病毒TYLCV(TYLCV-Sar)的Rep基因可產(chǎn)生病毒抗性。但是，TYLCV-Sar是一種獨(dú)特的病毒，與TYLCV-Is只有遠(yuǎn)源關(guān)系，基因組序列也有很大不同(＜80％同源性)。Noris等人(1996)發(fā)現(xiàn)用編碼C末端截短(210個(gè)氨基酸)的蛋白質(zhì)的TYLCV-Sar C1基因可在N.benthamiana植物中產(chǎn)生TYLCV-Sar抗性。但隨著時(shí)間的推移這種抗性會(huì)被克服。Brunetti等人(1997)用同樣的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化番茄并發(fā)現(xiàn)這種抗性需要截短型Rep蛋白的大量累積，這種累積導(dǎo)致了“卷縮”表型，并且這種抗性并不擴(kuò)大至其他不相關(guān)的雙生病毒。在表達(dá)Rep基因反義RNA的Nicotiana benthamiana轉(zhuǎn)基因植物中已觀察到具有對(duì)TYLCV-Sar感染的抗性(Bendahmane和Gronenborn，1997)。根據(jù)本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的植物具有正常表型并且同樣有望獲得高產(chǎn)。
本發(fā)明克服了為產(chǎn)生病毒抗性番茄栽培品種的傳統(tǒng)植物育種程序中花費(fèi)高、耗時(shí)長(zhǎng)以及可選擇性小等缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過(guò)基因工程使植物產(chǎn)生番茄黃葉卷縮雙生病毒如TYLCV-以色列株(TYLCV-Is)的抗性，同時(shí)該植物仍具有可接受表型特征的材料和方法。本發(fā)明給出了在番茄和煙草中產(chǎn)生TYLCV-Is抗性的示例性實(shí)施方案。具體地說(shuō)，這種抗性是通過(guò)將TYLCV復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)基因的截短變體轉(zhuǎn)化植物獲得的。此處示例的是來(lái)自TYLCV-Is(佛羅里達(dá)分離株)的截短型Rep基因的用途。TYLCV-Is的全長(zhǎng)Rep基因編碼約357個(gè)氨基酸的病毒復(fù)制相關(guān)蛋白。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本方法中使用的Rep基因3’末端截短，留下5’端508個(gè)核苷酸(nt)，后者包含82個(gè)核苷酸的基因間序列和編碼142個(gè)氨基酸的Rep蛋白片段(N端)的426個(gè)核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的截短型Rep基因的反義多核苷酸來(lái)提供感染抗性。本發(fā)明顯示在番茄育種品系中應(yīng)用基因工程開(kāi)發(fā)TYLCV-Is抗性適用于佛羅里達(dá)產(chǎn)生番茄的雜種。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示含有截短型TYLCVRep基因的雙元轉(zhuǎn)化載體。
圖2表示pKYLX7135S2的表達(dá)框。TL表示T-DNA左邊界，TR表示T-DNA右邊界(參見(jiàn)An等人關(guān)于其起源的詳細(xì)描述)。pKYLX71和pKYLX7135S2(所使用的質(zhì)粒)的多克隆位點(diǎn)是HindIII*-BamHI-XhoI*-PstI-SacI*-XbaI*(*表示唯一位點(diǎn))。pKYLX7135S2中的啟動(dòng)子是一個(gè)經(jīng)雙重增強(qiáng)區(qū)改進(jìn)的35S啟動(dòng)子。箭頭指示了表達(dá)框和NPTII基因的轉(zhuǎn)錄方向。該質(zhì)粒賦予大腸桿菌(E.coli)和根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)四環(huán)素和卡那霉素抗性。
圖3A-3B表示pKYLX7135S2中表達(dá)框的序列。用于構(gòu)建35S2啟動(dòng)子的雙重區(qū)被括弧和斜體標(biāo)出(兩個(gè)重復(fù)序列中的第一個(gè))，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和rbcS-E93’區(qū)的主要3’末端用粗體字分開(kāi)。表達(dá)框限于EcoRI和ClaI位點(diǎn)之間。
圖4表示轉(zhuǎn)化了截短型Rep基因的番茄植株(后部)顯出TYLCV抗性。未轉(zhuǎn)化的番茄(前部)顯示出TYLCV病癥。這個(gè)試驗(yàn)于2000年秋在Bradenton，F(xiàn)L的田里進(jìn)行。所有被測(cè)植株在移到田里之前都暴露在帶病毒的粉虱下。SEQ ID NO.8表示pKYLX7135S2中表達(dá)框的序列。用于構(gòu)建35S2啟動(dòng)子的雙重區(qū)被括弧和斜體標(biāo)出(兩個(gè)重復(fù)序列中的第一個(gè))，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)和rbcS-E93’區(qū)的主要3’末端用粗體字分開(kāi)。表達(dá)框限于EcoRI和ClaI位點(diǎn)之間。
圖5A-5B表示從轉(zhuǎn)基因2/5 Rep的煙草植株和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株提取總RNA進(jìn)行Northern印跡分析。圖5A，泳道1表示未轉(zhuǎn)化植株；泳道2表示未接種的2/5 Rep植株；泳道3和4表示接種TYLCV的C1T1植株。圖5B表示用18SrRNA基因進(jìn)行同樣的印跡探測(cè)來(lái)確證各泳道的RNA加樣量是等量的。
序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO.1是用于對(duì)本發(fā)明的Rep基因片段進(jìn)行初次PCR擴(kuò)增的寡核苷酸。
SEQ ID NO.2是用于對(duì)本發(fā)明的Rep基因片段進(jìn)行初次PCR擴(kuò)增的寡核苷酸。
SEQ ID NO.3表示本發(fā)明的截短型Rep蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4表示本發(fā)明的截短型TYLCV-Is Rep基因的核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO.3的氨基酸序列且包括81個(gè)核苷酸的基因間區(qū)。
SEQ ID NO.5表示本發(fā)明SEQ ID NO.4的截短型TYLCV-Is Rep基因的反義核苷酸序列，其包括81個(gè)核苷酸的基因間區(qū)。
SEQ ID NO.6表示本發(fā)明的截短型TYLCV-Is(佛羅里達(dá)分離株)Rep基因的核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO.3的氨基酸序列且包括82個(gè)核苷酸的基因間區(qū)。
SEQ ID NO.7表示本發(fā)明SEQ ID NO.6的截短型TYLCV-Is(佛羅里達(dá)分離株)Rep基因的反義核苷酸序列，其包括82個(gè)核苷酸的基因間區(qū)。
SEQ ID NO.8表示本發(fā)明的pKYLX7135S2中表達(dá)框的核苷酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種在易感染TYLCV-Is(番茄黃葉卷縮病毒-以色列株)的番茄和其他作物中產(chǎn)生病毒抗性的方法。在示例性實(shí)施方案中，產(chǎn)生了對(duì)TYLCV-Is具有抗性的植株。根據(jù)本發(fā)明所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株顯示正常表型特征，因此這種植物和其收獲作物在商業(yè)上是可接受的。通過(guò)傳統(tǒng)育種培養(yǎng)TYLCV-Is抗性是緩慢的(傳統(tǒng)育種需要十多年而基因工程技術(shù)只需要3-5年)，傳統(tǒng)育種通常取決于多個(gè)基因，并且經(jīng)常由于抗性基因與不合需要的園藝學(xué)特征聯(lián)系在一起而不甚理想。本發(fā)明極大簡(jiǎn)化了TYLCV-Is抗性植株的產(chǎn)生并將TYLCV-Is抗性基因?qū)牒虾跣枰姆哑废怠?br> 本發(fā)明涉及利用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或植物組織使其產(chǎn)生對(duì)番茄黃葉卷縮病毒(TYLCV)感染抗性的方法，上述多核苷酸選自i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因間區(qū)的全部或一部分和Rep基因5’編碼序列的約400到500個(gè)核苷酸組成；ii)包含所述TYLCV Rep基因片段的反義序列的多核苷酸；和iii)包含在嚴(yán)格條件下與TYLCV Rep基因片段或與TYLCV Rep基因片段反義序列雜交的序列的多核苷酸。本發(fā)明尤其選擇對(duì)如下TYLCV的抗性TYLCV-中國(guó)株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亞株、TYLCV-薩迪尼亞株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亞株、TYLCV-泰國(guó)株和TYLCV-也門(mén)株?？商峁㏕YLCV感染抗性的植物包括番茄、煙草、補(bǔ)血草、碧冬茄、洋桔梗、粘果酸漿和其他易感染TYLCV的植物。
在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的植物，其利用編碼TYLCV截短型復(fù)制相關(guān)(Rep)蛋白以及包含Rep基因間區(qū)的多核苷酸產(chǎn)生基因工程抗性。優(yōu)選來(lái)自TYLCV-Is或TYLCV佛羅里達(dá)分離株的截短型Rep基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，TYLCV-Is佛羅里達(dá)分離株的Rep基因編碼具357個(gè)氨基酸的病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，將其3’末端截短，留下5’端的508個(gè)核苷酸(SEQ ID NO.6)，后者包含82個(gè)Rep基因間區(qū)核苷酸和編碼Rep蛋白142個(gè)氨基酸片段(SEQ ID NO.3)的426個(gè)核苷酸。示例的Rep基因片段是病毒Rep基因全長(zhǎng)的一小部分(約40％)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明用來(lái)產(chǎn)生感染抗性的是截短型Rep基因的反義多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義多核苷酸的序列如SEQ ID NO.5或7所示。與截短型Rep基因序列或其反義序列雜交的多核苷酸序列或與截短型Rep基因序列或其反義序列具有50％或更高序列同一性的多核苷酸序列也同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的截短型Rep基因片段以及本發(fā)明截短型Rep基因片段的反義序列片段也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括具有如SEQ ID NO.4-7所示中任一序列的多核苷酸片段以及雜交序列片段或具有序列同一性的序列片段，條件是當(dāng)該片段在植物中表達(dá)時(shí)能賦予植物TYLCV抗性。產(chǎn)生多核苷酸序列片段的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的(見(jiàn)，例如Wei等人，1983)。
本發(fā)明的截短型Rep基因能夠直接導(dǎo)入植物如番茄通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法或通過(guò)由轉(zhuǎn)化的育種品系的傳統(tǒng)育種的基因轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)入，來(lái)保護(hù)植物免受TYLCV-Is感染。因此本發(fā)明也涉及新的對(duì)TYLCV如TYLCV-Is具高水平抗性的植物如番茄的育種品系。利用本發(fā)明的具有改進(jìn)的Rep基因的新育種品系，育種者就能夠培養(yǎng)有病毒抗性的番茄新栽培品種，而不會(huì)丟失其它想要的農(nóng)藝學(xué)和園藝學(xué)性狀。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的病毒抗性轉(zhuǎn)基因植物品系與具有相同病毒抗性但來(lái)自不同轉(zhuǎn)化過(guò)程的轉(zhuǎn)基因植物品系雜交，以產(chǎn)生較親本品系病毒抗性高的雜交品種。上述雜交品種也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
由于本發(fā)明的方法賦予高水平抗性，因此應(yīng)用由本發(fā)明培育的具有截短型Rep基因的新番茄栽培種能極大地減少由病毒感染引起的產(chǎn)量損失，而這種病毒感染最多能引起果實(shí)產(chǎn)量減少100％。此外，利用本發(fā)明的含有截短型Rep基因的栽培種可以明顯降低為了控制粉虱這一TYLCV-Is和其他雙生病毒載體而使用殺蟲(chóng)劑造成的依賴(lài)性，并隨之可減少番茄生產(chǎn)成本和殺蟲(chóng)劑造成的環(huán)境污染?，F(xiàn)在，控制TYLCV-Is主要依賴(lài)于單一的并轉(zhuǎn)入整株植物的殺蟲(chóng)劑。一旦粉虱對(duì)這種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性，就幾乎不可能控制TYLCV-Is。所以本發(fā)明的應(yīng)用可以通過(guò)增加產(chǎn)量、減少生產(chǎn)成本和環(huán)境污染而從整體上使番茄種植者和社會(huì)受益。
優(yōu)選地，本發(fā)明的截短型Rep轉(zhuǎn)基因具有在育種過(guò)程中起輔助作用的標(biāo)記(輔助標(biāo)記選擇)。與Brunetti等人(1997)所得結(jié)果相反，使用本發(fā)明的Rep轉(zhuǎn)基因到目前為止還未在已具有病毒抗性但尚未接種的轉(zhuǎn)化植物中出現(xiàn)對(duì)表型的不利作用?？剐灾仓暝诮臃N后30-60天后未出現(xiàn)病毒復(fù)制跡象，這可通過(guò)核酸斑點(diǎn)雜交和PCR證實(shí)。本發(fā)明的截短型Rep基因可以通過(guò)轉(zhuǎn)化或傳統(tǒng)的育種技術(shù)輕易地導(dǎo)入新的園藝學(xué)背景，并將為生產(chǎn)提供更好的園藝學(xué)特性。此外在植物中使用本發(fā)明的截短型Rep基因不會(huì)像目前通用的抗性基因那樣影響果實(shí)的大小。
本發(fā)明還涉及以下的多核苷酸分子i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因間區(qū)的全部或一部分和Rep基因5’編碼序列的約400到500個(gè)核苷酸組成；ii)包含所述TYLC VRep基因片段的反義序列的多核苷酸；和iii)包含在嚴(yán)格條件下與TYLCV Rep基因片段或與TYLCV Rep基因片段反義序列雜交的序列的多核苷酸，這樣當(dāng)多核苷酸整合到植物基因組中時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生對(duì)病毒的抗性，同時(shí)又不會(huì)對(duì)植物表型特征產(chǎn)生負(fù)面影響。與截短型Rep基因序列或其反義序列雜交的多核苷酸序列或與截短型Rep基因序列或其反義序列具有50％或更高序列同一性的多核苷酸序列也同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有本發(fā)明的截短型Rep基因片段和本發(fā)明的截短型Rep基因片段反義序列的片段，包括具有任一SEQ ID NO.4-7序列的多核苷酸片段及其雜交序列的片段或具有序列同一性的序列片段，只要上述片段在植物中表達(dá)就會(huì)使植物產(chǎn)生TYLCV抗性。
此外，由于基因編碼冗余，本發(fā)明的多核苷酸可以有許多不同的序列編碼同一個(gè)截短型Rep多肽。制備其它編碼相同的或基本上相同的截短型Rep多肽的多核苷酸序列在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。這些變體或替換的多核苷酸序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這里所指的“基本上相同的”序列是指編碼一個(gè)出現(xiàn)氨基酸替換、缺失、添加或插入的截短型Rep蛋白的序列，但這些變化卻不會(huì)在本質(zhì)上改變將上述多核苷酸導(dǎo)入植物基因組時(shí)使植物產(chǎn)生病毒感染抗性的能力。本發(fā)明的多核苷酸編碼保守的替換蛋白，其中一類(lèi)(非極性，不帶電荷極性，堿性和酸性)中的一種氨基酸被同一類(lèi)中的另一種氨基酸取代都落在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這種替換在本質(zhì)上并不會(huì)改變本發(fā)明中的產(chǎn)生抗性的能力。本發(fā)明的范圍還包括比示例的多核苷酸更長(zhǎng)或更短的多核苷酸，只要這種更長(zhǎng)或更短的多核苷酸也能使植物產(chǎn)生病毒抗性，同時(shí)并不會(huì)對(duì)植物的表型特征產(chǎn)生負(fù)面沖擊。
本發(fā)明也涉及到含有本發(fā)明的截短型Rep基因的能在合適的宿主植物中表達(dá)的重組多核苷酸載體。合適的載體選自本領(lǐng)域中公知的載體，包括質(zhì)粒、噬菌體DNA、或質(zhì)粒和噬菌體DNA的重組體、酵母質(zhì)粒及衍生物和片段。本發(fā)明的多核苷酸可以插入到一個(gè)載體的多克隆位點(diǎn)，如商業(yè)上購(gòu)買(mǎi)的pUC載體和pGEM載體，本發(fā)明的多核苷酸具有可切割的限制性末端，從而使其適合插入任何所希望的植物表達(dá)或整合載體。其它植物表達(dá)載體也可用于本發(fā)明。另外，可以將調(diào)控序列如啟動(dòng)子可操作地連接到本發(fā)明的多核苷酸編碼序列上。例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S或35S2啟動(dòng)子就可以運(yùn)用在本發(fā)明中。植物啟動(dòng)子，如Ap3啟動(dòng)子、熱休克80啟動(dòng)子、苜蓿組蛋白H3.2基因啟動(dòng)子(Kelemen等人，2002)、E8啟動(dòng)子等都可以運(yùn)用在本發(fā)明中。其他合適的啟動(dòng)子包括章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子和胭脂堿合酶啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以是組成型的、組織特異型的或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
表達(dá)載體也可任選地包含選擇性標(biāo)記基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記基因表達(dá)時(shí)可產(chǎn)生抗生素或除草劑抗性?？股乜剐詷?biāo)記包括如當(dāng)表達(dá)時(shí)提供G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素和慶大霉素等抗性的多核苷酸。除草劑抗性標(biāo)記包括例當(dāng)表達(dá)時(shí)可提供草甘膦和磺酰脲類(lèi)等抗性的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，將一種編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II型的多核苷酸整合到本發(fā)明的表達(dá)載體中。這種酶賦與對(duì)抗生素卡那霉素的抗性。用含有抗生素或除草劑抗性標(biāo)記基因的本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞可通過(guò)該細(xì)胞在抗生素或除草劑中的生長(zhǎng)而得以鑒定。
載體也可包括將3’非翻譯終止片段可操作地連接到截短型Rep基因編碼序列的3’末端。3’終止片段可提供用于在mRNA的3’末端添加多聚腺苷酸信號(hào)。任何適用于植物的3’終止片段都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明也涉及用含有本發(fā)明的截短型Rep基因的多核苷酸感染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。優(yōu)選地，截短型Rep基因來(lái)自TYLCV-Is且含有編碼如SEQID NO.3所示氨基酸序列多肽的核苷酸序列。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，多核苷酸包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將多核苷酸整合入一個(gè)合適的載體，并且將該重組載體轉(zhuǎn)化能夠?qū)⑸鲜龆嗪塑账釋?dǎo)入植物細(xì)胞的細(xì)菌或其他宿主。能夠用本發(fā)明的多核苷酸感染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的合適的宿主細(xì)胞包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtiliS)。其他合適的宿主包括農(nóng)桿菌(Agrobacterium)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。含有本發(fā)明多核苷酸的農(nóng)桿菌可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中本發(fā)明的多核苷酸載體也可包括T-DNA序列。將多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞還可以通過(guò)基因槍靶向法(Carrer，1995)、電穿孔法、直接基因注射法或其他本領(lǐng)域所公知的方法。還可以利用非標(biāo)記的轉(zhuǎn)化技術(shù)將本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物(Zuo等人，2002)。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的截短型Rep基因并表現(xiàn)出對(duì)植物TYLCV雙生病毒如TYLCV-Is感染抗性的轉(zhuǎn)基因植物、植物組織(包括植物種子)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包含含有本發(fā)明截短型Rep基因的多核苷酸。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中截短型Rep基因來(lái)自TYLCV-Is并且含有編碼如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列多肽的核苷酸序列。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，多核苷酸含有如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物包含含有如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的反義序列的多核苷酸。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物和植物組織可以從下列植物中制備，如番茄(Lycopersicon esqulentum)、煙草(煙草類(lèi))、補(bǔ)血草(波狀補(bǔ)血草(Limonium sinuatum))、碧冬茄(Petunia hybrida)、洋桔梗(Eustoma grandiflora)、粘果酸漿(Physalis ixocarpa)、辣椒、大豆和其他會(huì)受或容易受TYLCV-Is感染的植物。本發(fā)明也涉及上述轉(zhuǎn)基因植物的后代。
這里所用到的術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合體，并且除非特別限定，也包括與天然存在的核苷酸具有相似功能的天然核酸的已知類(lèi)似物。上述多核苷酸序列包括可被轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA鏈序列和可被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA序列。本發(fā)明中所述的核酸或多核苷酸的互補(bǔ)序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。多核苷酸序列包括編碼本發(fā)明中Rep蛋白的全長(zhǎng)序列，也包括來(lái)自全長(zhǎng)序列的較短序列。可以理解一個(gè)特定的多核苷酸序列包括天然序列的簡(jiǎn)并密碼子或可導(dǎo)入特異宿主細(xì)胞時(shí)提供優(yōu)選的密碼子序列。示例性序列的等位基因變異也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的多核苷酸和蛋白質(zhì)也可以被定義為與實(shí)施例中的多核苷酸和蛋白質(zhì)具有較大同一性和/或相似性范圍。序列同一性一般大于60％，優(yōu)選地大于75％，更優(yōu)選地大于80％，甚至更優(yōu)選地大于90％，也可以大于95％。與本發(fā)明的實(shí)施例中序列相比較，序列的同一性和/或相似性可為49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％。除非特別強(qiáng)調(diào)，這里所述的兩種序列的同一性和/或相似性百分比可以通過(guò)Karlin和Altschul(1990)的算法確定，以及經(jīng)Karlin和Altschul(1993)的算法修正。這種算法被添加到Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST的搜索是通過(guò)NBLAST程序進(jìn)行的，記分＝100，字長(zhǎng)＝12，可得到所需百分序列同一性的序列。為比較缺口排列的目的，可以使用Altschul等人(1997)描述的Gapped BLAST程序。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的缺省參數(shù)。參見(jiàn)NCBI/NIH網(wǎng)點(diǎn)。
本發(fā)明還包括與實(shí)施例中序列具有充分同源性的多核苷酸分子，使得兩者可在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格條件和標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis，T.等人，1982)下與序列雜交。這里所指的雜交的嚴(yán)格條件是指其中雜交在低于熔解溫度(Tm)20-25℃過(guò)夜進(jìn)行，DNA雜交液為6×SSPE，5×Denhardt’s溶液，0.1％SDS，0.1mg/ml變性DNA。熔解溫度如下列公式所述(Beltz，G.A.等人，1983)Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/堿基對(duì)中雙鏈體的長(zhǎng)度。
洗滌一般如下進(jìn)行(1)室溫下1×SSPE，0.1％SDS，15分鐘，洗兩次(低嚴(yán)格條件洗滌)。
(2)Tm-20℃，0.2×SSPE，0.1％SDS，15分鐘，洗一次(中度嚴(yán)格條件洗滌)因此，尤其認(rèn)為在嚴(yán)格條件下與如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示序列雜交的多核苷酸序列也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
所有在這里參考和引用的專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和出版物都全文引用作為參考，包括所有的附圖和表格及至與本說(shuō)明書(shū)的明確講授不一致之處。
下面舉例說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的步驟。這些實(shí)施例不能作為限定。除非特別指出所有的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)，所有的溶液混合物組分均以體積表示。
實(shí)施例1-轉(zhuǎn)化番茄植株的產(chǎn)生制備來(lái)自TYLCV-Is的截短型Rep基因多核苷酸(SEQ ID NO.4)。用引物EH312和EH313從病毒中經(jīng)PCR擴(kuò)增得到截短型Rep基因并用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法克隆。引物對(duì)EH312和EH313的核苷酸序列如下EH3125′CCAAGCTTAGCCATTAGGTGTCCAAG3′HindIII(SEQ ID NO.1)EH3135′CTCTCGAGGATTTACTGCCTGAATTG3′Xho I(SEQ ID NO.2)將截短型Rep基因的cDNA克隆插入具有增強(qiáng)型35S啟動(dòng)子和rbcS-E9終止信號(hào)的雙元載體pKYLX7135S2的多克隆位點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將Rep基因片段插入番茄(Lycopersiconesculentum Mill.)基因組。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Armitage等人，1988；McCormick等人，1986)。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)NPT II選擇篩選，并用PCR擴(kuò)增確證轉(zhuǎn)基因的存在。
實(shí)施例2-番茄植株中的TYLCV-Is抗性收獲轉(zhuǎn)化植株的種子后播種，用粉虱對(duì)T1子代的幼苗接種TYLCV-Is。收獲時(shí)(接種后12周)，子代30個(gè)品系中的8個(gè)有超過(guò)41％的植株無(wú)病毒癥狀，而作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)化植株100％出現(xiàn)嚴(yán)重的病癥(表1)。該結(jié)果說(shuō)明該示例性508個(gè)核苷酸的截短型Rep基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中賦予了高水平的TYLCV-Is(佛羅里達(dá)分離株)抗性。而且?guī)缀踉谒兄仓曛修D(zhuǎn)化植株表型正常。
TYLCV截短型Rep植株的T2子代先是暴露在帶病毒的粉虱下，然后于2000年秋到2001年春種植在Bradenton，F(xiàn)L.的田里。在溫室實(shí)驗(yàn)中觀察到的TYLCV抗性在田里的這種較苛刻條件下同樣很明顯(表2，圖4)。
實(shí)施例3-煙草植株中的TYLCV-Is抗性為了檢測(cè)截短型TYLCV Rep基因在其他植物煙草中是否有效，與在番茄中所做的一樣又用相同的載體構(gòu)建體(圖1)將“Xanthi”轉(zhuǎn)入。7個(gè)轉(zhuǎn)化截短型Rep基因的煙草品系表現(xiàn)出對(duì)TYLCV的免疫性。這就證實(shí)了由截短型Rep基因在不同宿主和獨(dú)立的轉(zhuǎn)化過(guò)程中引起的抗性。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)另兩種雙生病毒卷心菜葉片卷縮病毒和番茄斑點(diǎn)病毒(ToMoV)的抗性。這種由截短型Rep基因引起的抗性機(jī)制似乎是由于基因沉默。這一結(jié)論基于用TYLCV攻擊TYLCV抗性植株時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)化的煙草做Northern雜交分析顯示截短型Rep基因轉(zhuǎn)錄本的抑制。
實(shí)施例4-番茄中Rep和C4構(gòu)建體的檢測(cè)對(duì)八個(gè)含有TYLCV Rep基因、TYLCV-Is C4基因(一個(gè)定位在Rep基因內(nèi)但具有不同閱讀框的基因)或已改變的或截短形式的Rep基因的構(gòu)建體在植物中作了評(píng)價(jià)。用飼養(yǎng)在TYLCV感染的番茄植株上的粉虱接種T1子代。在八個(gè)構(gòu)建體中有三個(gè)未觀察到病癥，也未檢測(cè)到TYLCV-Is(通過(guò)雜交和PCR檢測(cè))(明顯的免疫性)(表1)。所有植株表型正常。選擇T1子代植株的后代接種TYLCV，并在田里作出評(píng)價(jià)。如期望的那樣，T2代植株表現(xiàn)出抗性分離(表2)。田中植株可觀察到兩種抗性-免疫性和恢復(fù)性。所有抗性植株表型正常。在生長(zhǎng)季節(jié)共對(duì)植株作了3次TYLCV-Is檢測(cè)。
C4和ΔC4構(gòu)建體評(píng)價(jià)了兩種含有C4基因的構(gòu)建體，其中C4基因在Rep基因內(nèi)約220nt處起始，以正義(C4)或反義(ΔC4)定向，且不含有基因間區(qū)(IR)。它們?cè)赥1子代中不產(chǎn)生抗性(表1)。
C1，ΔC1，NC1和NΔC1構(gòu)建體含有基因間區(qū)或整個(gè)Rep基因的正義(C1)或反義(ΔC1)定向的構(gòu)建體并不能在T1子代中產(chǎn)生免疫性。雖然仍在收集非增強(qiáng)型啟動(dòng)子品系的數(shù)據(jù)，但初步的數(shù)據(jù)暗示這與啟動(dòng)子無(wú)關(guān)(增強(qiáng)型啟動(dòng)子C1和ΔC1對(duì)非增強(qiáng)型啟動(dòng)子NC1和NΔC1)。在轉(zhuǎn)化了NC1和NΔC1的T1和T2子代植株中出現(xiàn)了恢復(fù)，說(shuō)明啟動(dòng)子有一些影響。
2/5 TYLCV Rep和AS 2/5 TYLCV Rep構(gòu)建體使用含有TYLCV-Is IR和2/5 TYLCV Rep基因，起始于Rep5’末端以正義(2/5 TYLCV Rep構(gòu)建體；SEQ ID NO.6)或反義(AS 2/5 TYLCV Rep構(gòu)建體；SEQ ID NO.7)定向的構(gòu)建體得到了最好的抗性(見(jiàn)表1，2，3和4)。用2/5 TYLCV Rep構(gòu)建體觀察到最高的免疫性出現(xiàn)率。這種抗性表現(xiàn)為免疫性并且從T1到T3子代都能觀察到高出現(xiàn)率。在T2子代中也觀察到較低的恢復(fù)率，但在T3子代中恢復(fù)率更低(T3子代數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例5-建立源自TYLCV Rep的免疫性即使在生長(zhǎng)季節(jié)進(jìn)行了3次檢測(cè)(接種后的4，8和12周)，許多轉(zhuǎn)化了2/5 TYLCV Rep構(gòu)建體的T1和T2子代植株在接種TYLCV后并未表現(xiàn)出病癥和病毒DNA(通過(guò)核酸雜交和PCR檢測(cè))。
為了確定是否由于病毒水平太低而用實(shí)驗(yàn)室分析檢測(cè)不出又進(jìn)行了研究。來(lái)自易感植株的插條(接穗)嫁接到檢測(cè)不到病毒DNA的接種過(guò)的轉(zhuǎn)化植株上。嫁接建立4周后接穗未表現(xiàn)病癥也檢測(cè)不到病毒DNA。這與將易感接穗嫁接到接種過(guò)的未轉(zhuǎn)化植株形成對(duì)比。此時(shí)嫁接2-3周后，接穗表現(xiàn)出病癥。這明顯表明了在接種植株中沒(méi)有病毒存在，抗性機(jī)制阻礙了病毒的復(fù)制。
實(shí)施例6-煙草的轉(zhuǎn)化將2/5 TYLCV Rep構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum)(Freitas-Astua，J.，2001)。測(cè)定T1子代植株的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生、TYLCV抗性和對(duì)兩種非相關(guān)的二重雙生病毒番茄斑點(diǎn)病毒(ToMoV)和卷心菜葉片卷縮病毒(CabLCV)抗性?？梢詸z測(cè)到植株對(duì)TYLCV是有免疫力的，證據(jù)就是在接種后通過(guò)ELISA、PCR和核酸雜交檢測(cè)不到病毒。這種抗性與轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)無(wú)關(guān)。用TYLCV攻擊后產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本，但轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)物量明顯減少(圖5A和5B)。轉(zhuǎn)化植物不具有對(duì)ToMoV或CabLCV的抗性。
可以理解上述描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是出于闡述的目的，建議本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員對(duì)其稍作其他多種改良或變化，這些也應(yīng)包括在本申請(qǐng)的主題和范圍內(nèi)。
1排除評(píng)價(jià)期間死亡的植株。
2斜體的數(shù)據(jù)表示非最終數(shù)據(jù)，還在研究中。
1排除評(píng)價(jià)期間死亡的植株。
1排除評(píng)價(jià)期間死亡的植株。
2％逃逸-沒(méi)有病毒也未檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的植株(這些用與TYLCV基因外部的結(jié)合轉(zhuǎn)化載體的引物28和94重新評(píng)價(jià))。
3斜體的數(shù)據(jù)表示非最終數(shù)據(jù)，還在研究中。
1排除評(píng)價(jià)期間死亡的植株。
2％逃逸-沒(méi)有病毒也未檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的植株(這些用與TYLCV基因外部的結(jié)合轉(zhuǎn)化載體的引物28和94重新評(píng)價(jià))。
3斜體的數(shù)據(jù)表示非最終數(shù)據(jù)，還在研究中。
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序列表序列表<110>簡(jiǎn)·E·波爾斯東歐內(nèi)斯特·希伯特<120>用于在植物中產(chǎn)生番茄黃卷縮病毒抗性的材料和方法<130>POL-100XC1 PCT<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>26<212>DNA<213>番茄黃葉卷縮病毒<400>1ccaagcttag ccattaggtg tccaag26<210>2<211>27<212>DNA<213>番茄黃葉卷縮病毒<400>2ctctcgaggg atttactgcc tgaattg 27<210>3<211>142<212>PRT<213>番茄黃葉卷縮病毒<400> 3Met Pro Arg Leu Phe Lys Ile Tyr Ala Lys Asn Tyr Phe Leu Thr Tyr1 5 10 15Pro Asn Cys Ser Leu Ser Lys Glu Glu Ala Leu Ser Gln Leu Lys Lys20 25 30Leu Glu Thr Pro Thr Asn Lys Lys Tyr Ile Lys Val Cys Lys Glu Leu35 40 45His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Val Leu Ile Gln Phe Glu Gly50 55 60Lys Tyr Gln Cys Lys Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser Pro Asn65 70 75 80Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Ala Ala Lys Ser Ser Thr
85 90 95Asp Val Lys Thr Tyr Val Glu Lys Asp Gly Asn Phe Ile Asp Phe Gly100 105 110Val Ser Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln Ser Ala115 120 125Asn Asp Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Asn Ser Gly Ser Lys Ser130 135 140<210>4<211>506<212>DNA<213>番茄黃葉卷縮病毒<400>4gccattaggt gtcgaggtat tagtaagaca ccgatacacc gattgccata gagctttgag 60ggacaccgat tcatttcaac atgcctcgtt tatttaaaat atatgccaag aattatttcc 120taacatatcc caattgttct ctctctaaag aggaagcact ttcccaatta aaaaacatag 180aaaccccaac aaataaaaaa tacatcaaag tttgcagaga attccacgag aatggggaac 240cacatctcca tgtgcttatc caattcgaag gcaaatacca atgtaagaac caacggttct 300tcgacctggt atccccaaac aggtcagcac atttccatcc aaacattcag gcagctaaga 360gctcaacaga tgtcaagacc tacgtggaga aagacggaga cttcattgat tttggagttt 420tccaaatcga tggcagatca gctagaggag gtcagcaatc tgccaacgac gcatacgccg 480gagcactcaa ttcaggcagt aaatcc 506<210>5<211>506<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>番茄黃葉卷縮病毒的反義序列<400>5ggatttactg cctgaattga gtgctccggc gtatgcgtcg ttggcagatt gctgacctcc 60tctagctgat ctgccatcga tttggaaaac tccaaaatca atgaagtctc cgtctttctc 120cacgtaggtc ttgacatctg ttgagctctt agctgcctga atgtttggat ggaaatgtgc 180tgacctgttt ggggatacca ggtcgaagaa ccgttggttc ttacattggt atttgccttc 240gaattggata agcacatgga gatgtggttc cccattctcg tggaattctc tgcaaacttt 300gatgtatttt ttatttgttg gggtttctag gttttttaat tgggaaagtg cttcctcttt 360
agagagagaa caattgggat atgttaggaa ataattcttg gcatatattt taaataaacg 420aggcatgttg aaatgaatcg gtgtccctca aagctctatg gcaatcggtg tatcggtgtc480ttactaatac ctcgacacct aatggc 506<210>6<211>508<212>DNA<213>番茄黃葉卷縮病毒<400>6tagccattag gtgtcgaggt attagtaaga caccgataca ccgattgcca tagagctttg 60agggacaccg attcatttca acatgcctcg tttatttaaa atatatgcca agaattattt 120cctaacatat cccaattgtt ctctctctaa agaggaagca ctttcccaat taaaaaacat 180agaaacccca acaaataaaa aatacatcaa agtttgcaga gaattccacg agaatgggga 240accacatctc catgtgctta tccaattcga aggcaaatac caatgtaaga accaacggtt 300cttcgacctg gtatccccaa acaggtcagc acatttccat ccaaacattc aggcagctaa 360gagctcaaca gatgtcaaga cctacgtgga gaaagacgga gacttcattg attttggagt 420tttccaaatc gatggcagat cagctagagg aggtcagcaa tctgccaacg acgcatacgc 480cggagcactc aattcaggca gtaaatcc508<210>7<211>691<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>番茄黃葉卷縮病毒的反義序列<400>7agagcgaccc actcttcaag ttcatctgga acttgattaa aagaagaaga aagaaatgga 60gaaacataaa cttctaaagg aggactaaaa atcctatcta aatttgaatt taaattatga 120aattgtaaaa tatagtcctt tggggccttt tcttttaata tattgagggc ctcggattta 180ctgcctgaat tgagtgctcc ggcgtatgcg tcgttggcag attgctgacc tcctctagct 240gatctgccat cgatttggaa aactccaaaa tcaatgaagt ctccgtcttt ctccacgtag 300gtcttgacat ctgttgagct cttagctgcc tgaatgtttg gatggaaatg tgctgacctg 360tttggggata ccaggtcgaa gaaccgttgg ttcttacatt ggtatttgcc ttcgaattgg 420ataagcacat ggagatgtgg ttccccattc tcgtggaatt ctctgcaaac tttgatgtat 480
tttttatttg ttggggtttc tatgtttttt aattgggaaa gtgcttcctc tttagagaga 540gaacaattgg gatatgttag gaaataattc ttggcatata ttttaaataa acgaggcatg 600ttgaaatgaa tcggtgtccc tcaaagctct atggcaatcg gtgtatcggt gtcttactaa 660tacctggaca cctaatggct atttctctag a691<210>8<211>1998<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>表達(dá)載體<400>8gaattcgccc ggggatctcc tttgccccag agatcacaat ggacgacttc ctatatctct 60acgatctagt caggaagttc gacggagaag gtgacgatac catgttcacc actgataatg 120agaagattag ccttttcaat ttcagaaaga atcctaaccc acagatggtt agagacgctt 180acgcagcagg tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggag atcaaatacc 240ttcccaagaa ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag 300agaaagatat atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc 360ttcacaaacc aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat 420caaaggccat ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg 480gcgaacagtt catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca 540tggtggagca cgacacgctt gtctacctcc aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac 600caaagggaat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt 660gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat 720gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca 780aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 840caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacgcttgtc tacctccaaa 900aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggaattga gacttttcaa caaagggtaa 960tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag 1020tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg 1080aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg 1140aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg 1200acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa 1260
gttcatttca tttggagagg acacgctgaa atcaccagtc tctctctaag cttggatcct 1320cgagctgcag gagctcgaat tgatcctcta gagctttcgt tcgtatcatc ggtttcgaca 1380acgttcgtca agttcaatgc atcagtttca ttgcgcacac accagaatcc tactgagttc 1440gagtattatg gcattgggaa aactgttttt cttgtaccat ttgttgtgct tgtaatttac 1500tgtgtttttt attcggtttt cgctatcgaa ctgtgaaatg gaaatggatg gagaagagtt 1560aatgaatgat atggtccttt tgttcattct caaattaata ttatttgttt tttctcttat 1620ttgttgtgtg ttgaatttga aattataaga gatatgcaaa cattttgttt tgagtaaaaa 1680tgtgtcaaat cgtggcctct aatgaccgaa gttaatatga ggagtaaaac acttgtagtt 1740gtaccattat gcttattcac taggcaacaa atatattttc agacctagaa aagctgcaaa 1800tgttactgaa tacaagtatg tcctcttgtg ttttagacat ttatgaactt tcctttatgt 1860aattttccag aatccttgtc agattctaat cattgcttta taattatagt tatactcatg 1920gatttgtagt tgagtatgaa aatatttttt aatgcatttt atgacttgcc aattgattga 1980caacatgcat caatcgat 1998
權(quán)利要求
1.一種在植物或植物組織中提供對(duì)番茄黃葉卷縮病毒(TYLCV)感染抗性的方法，該方法包括用選自以下的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物或植物組織i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因間區(qū)的全部或一部分和Rep基因5’編碼序列的約400到500個(gè)核苷酸組成，或所述多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段；ii)包含所述的TYLCV Rep基因片段的反義序列，或包含所述反義多核苷酸的可提供感染抗性的片段的多核苷酸；以及iii)包含在嚴(yán)格條件下與所述的TYLCV Rep基因片段或與所述的TYLCV Rep基因片段的反義序列雜交的序列，或包含所述雜交多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的TYLCV Rep基因片段來(lái)自TYLCV-Is。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的TYLCV Rep基因片段來(lái)自TYLCV-Is的佛羅里達(dá)分離株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反義序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反義序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述番茄黃葉卷縮病毒選自TYLCV-中國(guó)株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亞株、TYLCV-薩迪尼亞株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亞株、TYLCV-泰國(guó)株和TYLCV-也門(mén)株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述番茄黃葉卷縮病毒是TYLCV-以色列株。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述植物或植物組織選自番茄、煙草、補(bǔ)血草、碧冬茄、洋桔梗和粘果酸漿。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述植物或植物組織是番茄。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述植物或植物組織是煙草。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用所述多核苷酸通過(guò)農(nóng)桿菌感染法、基因槍靶向法、電穿孔法或直接基因注射法轉(zhuǎn)化所述植物或植物組織。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含可操作地連接至所述Rep基因序列的調(diào)控序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述調(diào)控序列包含啟動(dòng)子。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述啟動(dòng)子選自CaMV 35S啟動(dòng)子、CaMV 35S2啟動(dòng)子、章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子、Ap3啟動(dòng)子、熱休克80啟動(dòng)子、苜蓿組蛋白H 3.2基因啟動(dòng)子和E8啟動(dòng)子。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含選擇性標(biāo)記基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述選擇性標(biāo)記基因在表達(dá)時(shí)提供抗生素抗性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述抗生素抗性選自G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素和慶大霉素抗性。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包含3’非翻譯終止序列。
22.具有增強(qiáng)的對(duì)番茄黃葉卷縮病毒(TYLCV)感染抗性的轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)化的植物或植物組織，其中所述植物或植物組織包含選自以下的多核苷酸i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因間區(qū)的全部或一部分和Rep基因5’編碼序列的約400到500個(gè)核苷酸組成，或所述多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段；ii)包含所述的TYLCV Rep基因片段的反義序列，或包含所述反義多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸；以及iii)包含在嚴(yán)格條件下與所述的TYLCV Rep基因片段或與所述的TYLCV Rep基因片段的反義序列雜交的序列，或包含所述雜交多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中所述TYLCV Rep基因片段來(lái)自TYLCV-Is。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中所述TYLCV Rep基因片段來(lái)自TYLCV-Is的佛羅里達(dá)分離株。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反義序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
28.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反義序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
29.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中所述番茄黃葉卷縮病毒選自TYLCV-中國(guó)株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亞株、TYLCV-薩迪尼亞株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亞株、TYLCV-泰國(guó)株和TYLCV-也門(mén)株。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的植物或植物組織，其中所述番茄黃葉卷縮病毒是TYLCV-以色列株。
31.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中所述植物或植物組織選自番茄、煙草、補(bǔ)血草、碧冬茄、洋桔梗和粘果酸漿。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述植物或植物組織是番茄。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述植物或植物組織是煙草。
34.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中用所述的多核苷酸通過(guò)農(nóng)桿菌感染法、基因槍靶向法、電穿孔法或直接基因注射法轉(zhuǎn)化所述植物或植物組織。
35.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中所述多核苷酸包含可操作地連接至所述Rep基因序列的調(diào)控序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的植物或植物組織，其中所述調(diào)控序列包含啟動(dòng)子。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的植物或植物組織，其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的植物或植物組織，其中所述啟動(dòng)子選自CaMV35S啟動(dòng)子、CaMV 35S2啟動(dòng)子、章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子、Ap3啟動(dòng)子、熱休克80啟動(dòng)子、苜蓿組蛋白H3.2基因啟動(dòng)子和E8啟動(dòng)子。
39.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中所述多核苷酸包含選擇性標(biāo)記基因。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的植物或植物組織，其中所述選擇性標(biāo)記基因當(dāng)表達(dá)時(shí)提供抗生素抗性。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的植物或植物組織，其中所述抗生素抗性選自G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素和慶大霉素抗性。
42.根據(jù)權(quán)利要求22的植物或植物組織，其中所述多核苷酸包含3’非翻譯終止序列。
43.權(quán)利要求22的植物或植物組織的后代。
44.選自如下的多核苷酸i)包含TYLCV Rep基因片段的多核苷酸，其中所述的Rep基因片段由Rep基因的5’基因間區(qū)的全部或一部分和Rep基因5’編碼序列的約400到500個(gè)核苷酸組成，或所述多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段；ii)包含所述的TYLCV Rep基因片段的反義序列，或包含所述反義多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸；以及iii)包含在嚴(yán)格條件下與所述的TYLCV Rep基因片段或與所述的TYLCV Rep基因片段的反義序列雜交的序列，或包含所述雜交多核苷酸的可提供對(duì)所述TYLCV感染抗性的片段的多核苷酸。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述TYLCV Rep基因片段來(lái)自TYLCV-Is。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述TYLCV Rep基因片段來(lái)自TYLCV-Is的佛羅里達(dá)分離株。
47.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
48.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的所述多核苷酸具有如SBQ ID NO.6所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
49.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反義序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
50.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中包含所述TYLCV Rep基因片段的反義序列的所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或具有所述核苷酸序列的能夠提供感染抗性的片段。
51.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述番茄黃葉卷縮病毒選自TYLCV-中國(guó)株、TYLCV-以色列株、TYLCV-尼日利亞株、TYLCV-薩迪尼亞株、TYLCV-南沙特阿拉伯株、TYLCV-坦桑尼亞株、TYLCV-泰國(guó)株和TYLCV-也門(mén)株。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的多核苷酸，其中所述番茄黃葉卷縮病毒是TYLCV-以色列株。
53.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述植物或植物組織選自番茄、煙草、補(bǔ)血草、碧冬茄、洋桔梗和粘果酸漿。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的多核苷酸，其中所述植物或植物組織是番茄。
55.根據(jù)權(quán)利要求53的多核苷酸，其中所述植物或植物組織是煙草。
56.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中用所述多核苷酸通過(guò)農(nóng)桿菌感染法、基因槍靶向法、電穿孔法或直接基因注射法轉(zhuǎn)化所述植物或植物組織。
57.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含可操作地連接至所述Rep基因序列的調(diào)控序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的多核苷酸，其中所述調(diào)控序列包含啟動(dòng)子。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
60.根據(jù)權(quán)利要求58的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子選自CaMV 35S啟動(dòng)子、CaMV 35S2啟動(dòng)子、章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子、Ap3啟動(dòng)子、熱休克80啟動(dòng)子、苜蓿組蛋白H3.2基因啟動(dòng)子和E8啟動(dòng)子。
61.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選擇性標(biāo)記基因。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的多核苷酸，其中所述選擇性標(biāo)記基因在表達(dá)時(shí)提供抗生素抗性。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的多核苷酸，其中所述抗生素抗性選自G418、潮霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素和慶大霉素抗性。
64.根據(jù)權(quán)利要求44的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含3’非翻譯終止序列。
65.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求44的多核苷酸。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體適于在植物中表達(dá)所述多核苷酸。
67.植物細(xì)胞，在其基因組中包含權(quán)利要求44的多核苷酸。
68.植物種子，在其基因組中包含權(quán)利要求44的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用TYLCV的截短型復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)基因，在植物中提供對(duì)番茄黃葉卷縮雙生病毒的基因工程抗性的材料和方法。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的抗病毒植物具有園藝上可接受的表型特征。本發(fā)明的方法包括將多核苷酸轉(zhuǎn)入植物，其中當(dāng)該多核苷酸在植物中表達(dá)時(shí)，該轉(zhuǎn)化植物就會(huì)表現(xiàn)出對(duì)植物病毒感染的抗性。一個(gè)示例性實(shí)施方案中使用的多核苷酸包含來(lái)自TYLCV－Is的佛羅里達(dá)分離株的截短型Rep基因。本發(fā)明的方法可用來(lái)在植物如番茄和煙草中提供對(duì)TYLCV感染的抗性。本發(fā)明還涉及表達(dá)包含TYLCV截短型Rep基因的多核苷酸的轉(zhuǎn)化的和轉(zhuǎn)基因的植物和植物組織。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1496367SQ02802033
公開(kāi)日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2002年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月7日
發(fā)明者簡(jiǎn)·E·波爾斯東, 歐內(nèi)斯特·希伯特, 特 希伯特, 簡(jiǎn) E 波爾斯東 申請(qǐng)人:簡(jiǎn)·E·波爾斯東, 歐內(nèi)斯特·希伯特, 簡(jiǎn) E 波爾斯東