專利名稱：棉花事件mon15985以及檢測它的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是植物昆蟲保護(hù)和植物育種領(lǐng)域，并且涉及棉花植物——陸地棉的新的轉(zhuǎn)化事件，包括插入棉花細(xì)胞基因組中的特定位點(diǎn)上的多核苷酸序列，所述序列編碼Cry2Ab鱗翅目昆蟲抑制蛋白。另外，本發(fā)明涉及由所述轉(zhuǎn)化事件產(chǎn)生的棉花植物，并且涉及檢測所述事件在樣品中的存在的測定方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及以前業(yè)已商業(yè)化的能表達(dá)嵌合形式的Cry1A昆蟲抑制蛋白的，用于抗鱗翅目昆蟲的被稱為MON531的棉花植物事件。在世界上栽培植物的所有地方，棉花植物都容易受到昆蟲的采食。重組DNA技術(shù)在棉花植物細(xì)胞上的應(yīng)用已有大約10年時(shí)間，自從大約1990s初期，業(yè)已通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)出了具有改善了的特征的棉花植物，這是因?yàn)椴迦肓水愒碊NA序列。由重組棉花植物所表現(xiàn)出來的某些改良包括除草劑耐受性，改善了的纖維特征，和對昆蟲采食的抗性。
生產(chǎn)出了能防止鱗翅目昆蟲采食的第一種重組棉花植物，并且得到了商業(yè)銷售管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，并且隨后于1996年商業(yè)化。這種棉花植物含有編碼嵌合Cry1α鱗翅目昆蟲抑制蛋白的、主要來自MON531事件的DNA序列。業(yè)已通過常規(guī)育種將這種特殊性狀和與它相鄰連接的編碼選擇標(biāo)記的DNA序列轉(zhuǎn)移到多種棉花品種中，每一種品種都特別適合于在世界上的各種地理位置上高產(chǎn)生產(chǎn)棉花。由于多種原因，所述重組品種業(yè)已獲得了巨大的商業(yè)成功。一個(gè)原因是，由于在這種棉花植物的每一個(gè)細(xì)胞中都存在昆蟲抑制蛋白，導(dǎo)致了昆蟲采食的減少，因而大大改善了棉花生產(chǎn)的每英畝的平均產(chǎn)量。所述商業(yè)化成功的另一個(gè)主要原因是，由于減少了保護(hù)棉花作物免受昆蟲損害的化學(xué)除草劑的應(yīng)用，因而減少了勞動(dòng)力和費(fèi)用。另外，化學(xué)殺蟲劑應(yīng)用的減少改善了環(huán)境的整體健康狀況，因?yàn)楸苊饬藢Υ嬖谟谕{大田中的作物的材料上的昆蟲或蛛形綱昆蟲和其他物種的滅絕，減少了應(yīng)用于環(huán)境中的化學(xué)殺蟲劑毒素的負(fù)荷，并且使得農(nóng)民能避免與接觸化學(xué)殺蟲劑的潛在有害作用相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。
很快就會(huì)明白，具有較寬的抗昆蟲效力的產(chǎn)品是理想的。盡管從化學(xué)角度來看，提供用于這一目的的昆蟲抑制蛋白的組合可以被認(rèn)為是簡單的，并且可以推遲或避免由目標(biāo)昆蟲群體所產(chǎn)生的毒素抗性，但實(shí)際上培育滿足上述特征的植物是存在問題的，并且需要大量的資源、技術(shù)能力，以及嘗試和誤差實(shí)驗(yàn)，以便獲得單一的重組植物轉(zhuǎn)化事件，該事件會(huì)產(chǎn)生具有理想的昆蟲抑制蛋白組合的形態(tài)學(xué)上正常的植物，這種蛋白能夠在植物生長期的適當(dāng)時(shí)間，并且在目標(biāo)害蟲物種采食的組織中以足夠的水平產(chǎn)生。
因此，有必要培育并鑒定具有增強(qiáng)了的昆蟲抗性特征的棉花植物，這種增強(qiáng)的昆蟲抗性是由于整合到植物細(xì)胞的基因組中的DNA序列所產(chǎn)生的兩種或兩種以上昆蟲抑制蛋白的存在而導(dǎo)致的。另外，對于所述昆蟲抑制特征來說，還希望(i)能彼此獨(dú)立地分離，(ii)不會(huì)對所述植物的生理學(xué)和代謝產(chǎn)生任何負(fù)面影響，和(iii)對由所述植物所產(chǎn)生的纖維的產(chǎn)量或質(zhì)量只有很小的負(fù)面影響(如果有的話)。
為了確定有性雜交的后代是否含有感興趣的轉(zhuǎn)基因，如果能夠檢測一種特定事件的存在將是有利的。另外，用于檢測特定事件的方法將有助于符合要求種子銷售在上市前得到批準(zhǔn)的規(guī)定，以便生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物類植物，以及由所述作物所制成的食品，例如，或者用于環(huán)境監(jiān)測，監(jiān)測作物在大田中的性狀，或監(jiān)測由作物收獲物所產(chǎn)生的產(chǎn)品，以及用于確保符合有關(guān)管理或條約的規(guī)定。
可以通過本領(lǐng)域公知的任何核酸檢測方法檢測轉(zhuǎn)基因的存在，包括，但不限于熱擴(kuò)增(PCRTM)或用核酸DNA探針及其DNA雜交(通常，為了簡便起見，用統(tǒng)一的試劑和方法檢測業(yè)已被用于轉(zhuǎn)化各種植物品種的特定DNA結(jié)構(gòu)，所述檢測方法通常集中在經(jīng)常使用的遺傳因子，例如啟動(dòng)子，終止子，標(biāo)記基因等，因?yàn)閷τ诤芏郉NA結(jié)構(gòu)來說，編碼序列區(qū)是可以交換的。結(jié)果是，所述方法不能用于區(qū)分由相同的DNA結(jié)構(gòu)或非常相似的結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的獨(dú)立的事件。不過，如果靠近插入的DNA的染色體DNA序列(旁側(cè)DNA)，就可以使用上述方法。例如，Windels等披露了一種事件專一性熱擴(kuò)增(PCRTM)測定方法(Med.Fac.Landbouww，Univ.Gent64/5b459-462，1999)，該作者利用跨越插入片段和旁側(cè)DNA之間的接頭的熱擴(kuò)增引物組鑒定了草甘膦抗性大豆事件40-3-2。具體地講，一種包括引物的序列來自插入片段內(nèi)部，而第二種包括引物的序列包括旁側(cè)DNA。還開發(fā)了用于事件MON531的所述方法，并且它是一份獨(dú)立專利申請的主題，需要一種能夠檢測本發(fā)明的新的事件的存在，即使是在存在事件MON531的條件下檢測的方法。業(yè)已通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了上述和其他有利的進(jìn)步。
發(fā)明概述用包括編碼Cry2Ab——一種昆蟲抑制蛋白的編碼序列的被命名為PV-GHBK11的遺傳結(jié)構(gòu)——再次轉(zhuǎn)化上述棉花事件MON531，并且業(yè)已選擇了該轉(zhuǎn)化工作的一種事件用于潛在的商業(yè)化推廣。將其命名為MON15985。因?yàn)樗且环N新的插入事件，在自交時(shí)它會(huì)從MON531的Cry1Ac基因中分離。僅含有MON15985插入片段的棉花品系被命名為MON15985X。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于所述棉花品系的組合物。業(yè)已在2000年9月29日將包括棉花事件MON15985的棉花組織交給美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，并且所確定的ATCC保藏號為PTA-2516。
在本發(fā)明的另一方面，提供了用于檢測MON15985事件存在的方法。提供了用于鑒定插入的DNA序列和MON15985的天然棉花旁側(cè)序列的DNA序列。根據(jù)所述DNA序列可以設(shè)計(jì)出用于PCR診斷測定的引物。提供了典型的引物，如在存在MON15985 DNA的條件下進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)使用所述引物所產(chǎn)生的擴(kuò)增子。
應(yīng)當(dāng)指出的是，對于棉花事件MON15985插入的序列診斷的檢測，可能不足以回答有關(guān)種子樣品的所有問題。被命名為MON15985的所述種子體系含有所述插入片段以及以前被鑒定的MON531。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了用于區(qū)分MON15985和MON15985X，一種缺乏MON531事件的品系的方法。該方法使用一種或多種以前已知的診斷MON531的序列。
這里的一種連接序列跨越DNA插入所述基因組連接在位于插入點(diǎn)旁側(cè)的棉花天然基因組DNA上的位點(diǎn)，植物遺傳材料中一種或其他連接序列的鑒定或檢測就足以診斷所述事件。其中包括跨越棉花事件MON15985的插入點(diǎn)并具有旁側(cè)DNA的類似長度的DNA序列。所述診斷序列的例子是SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ ID NO18的二十聚體結(jié)合序列。不過，與所述插入點(diǎn)或連接點(diǎn)的結(jié)合部分重疊的小到15個(gè)堿基對的其他序列和基因組序列同樣是診斷性的，并且可以使用。使用本文所提供的引物或由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所設(shè)計(jì)的引物對來自所述事件的基因組DNA進(jìn)行的核酸擴(kuò)增，生產(chǎn)出了含有所述診斷DNA序列的擴(kuò)增子。另外，檢測能專一性結(jié)合本文所披露的診斷序列的寡核苷酸的結(jié)合也可以診斷所述事件。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于區(qū)別棉花事件MON15985和天然的、未轉(zhuǎn)化過的和未受到破壞的序列的寡核苷酸序列引物對。具體地講，所述旁側(cè)序列引物對包括選自SEQ ID NO11或SEQ ID NO12的兩種分離核酸分子，所述序列的擴(kuò)增子與插入的DNA的一個(gè)或多個(gè)連接序列重疊，在圖1中用編號2、4、6、9和11表示。例如，人們還可以選擇來自SEQ ID NO11所示的大約1-361號堿基對位置的含有至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的分離的核酸，所述核酸來自位于插入的DNA5’末端旁側(cè)的棉花基因組DNA序列，在圖1中用編號1表示，以及來自SEQ IDNO11的674-1361號堿基對位置的含有至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的至少1個(gè)分離的核酸，該序列位于插入的DNA內(nèi)，在圖1中用編號3和5的部分表示。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可用于分析棉花事件MON15985的其他引物對，該引物對包括來自SEQ ID NO11的1-1885號核苷酸的具有至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的至少一種分離的核酸，該核酸與來自SEQ ID NO11的362-2267號核苷酸的具有至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的至少一種分離的核酸配對。類似地，引物對可以來自SEQ ID NO12的1-673號核苷酸，以及來自SEQ ID NO12的350-1361號核苷酸的核苷酸，每一種引物的長度至少為15個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了可用于核酸擴(kuò)增的特殊引物組。具體地講，SEQ ID NO26和SEQ ID NO27就是這樣的引物組，并且可用于生產(chǎn)能診斷棉花事件MON15985DNA存在的擴(kuò)增子。SEQ ID NO28和SEQ ID NO29是另一種這樣的引物組。相反，SEQ ID NO26和SEQ ID NO27能夠用從除了棉花事件MON15985之外的來源獲得的以及從包括位于MON15985序列整合到基因組上的位點(diǎn)上的野生型序列和MON15985整合序列的半純合基因組獲得的DNA樣品生產(chǎn)擴(kuò)增子，并且所述擴(kuò)增子似乎可以診斷一種樣品中來自棉花事件MON15985的插入DNA的缺乏，并且在含有所述事件的DNA的樣品中不能生產(chǎn)擴(kuò)增子。不過，在在理解所述結(jié)果時(shí)應(yīng)當(dāng)注意，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)作為染色體對的半純合成員存在時(shí)，用SEQ ID NO26和SEQ IDNO29作為診斷工具來證實(shí)陰性或陽性結(jié)果可能是錯(cuò)誤的。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測樣品中相應(yīng)于棉花事件MON15985的DNA存在的方法。所述方法包括(a)讓含有DNA的樣品與一種引物組接觸，所述引物組在用于棉花事件MON15985的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，能產(chǎn)生可以診斷棉花事件MON15985的擴(kuò)增子；(b)實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生所述擴(kuò)增子；和(c)檢測所述擴(kuò)增子。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測相應(yīng)于樣品中棉花事件MON15985的DNA存在的方法，該方法包括(a)讓含有DNA的樣品與一種探針接觸，所述探針能在嚴(yán)格條件下與來自棉花事件MON15985的基因組DNA雜交，但是，在嚴(yán)格雜交條件下不能與來自對照棉花植物的DNA雜交；(b)讓所述樣品和探針經(jīng)歷嚴(yán)格雜交條件；和(c)檢測所述探針與所述DNA的雜交。
本發(fā)明的另一方面是用于檢測靶位點(diǎn)，即至少一個(gè)結(jié)合點(diǎn)存在的方法和組合物，所述結(jié)合點(diǎn)的鑒定和檢測，可以診斷源于棉花事件MON15985或從棉花事件MON15985的基因組獲得的核酸樣品中與棉花事件MON15985中的棉花植物基因組整合的DNA的存在，使用多種檢測方法，包括TAQMAN(Perkin Elmer)或相關(guān)的熒光團(tuán)/淬火方法，熱擴(kuò)增，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Southern雜交，ELISA方法，和比色和熒光檢測方法。具體地講，本發(fā)明提供了用于檢測靶序列存在的試劑盒，即含有來自棉花事件MON15985的基因組核酸的樣品中棉花事件MON15985上的至少一個(gè)結(jié)合序列。所述試劑盒包括至少一種能夠結(jié)合所述靶位點(diǎn)或基本上靠近所述靶位點(diǎn)的多核苷酸，以及至少一種用于檢測所述多核苷酸與所述靶位點(diǎn)結(jié)合的方法。所述檢測方法可以選自熒光、化學(xué)發(fā)光、比色或同位素方法，并且可以與用于檢測結(jié)合的至少一種免疫學(xué)方法組合。還設(shè)計(jì)了一種可以檢測靶位點(diǎn)在一種樣品中的存在的一種試劑盒，即插入的DNA與MON15985事件中的棉花植物的基因組DNA的至少一個(gè)結(jié)合點(diǎn)，利用了兩種或兩種以上多核苷酸序列，這些序列組合在一起之后能夠與靠近靶序列的或位于大約100個(gè)堿基對之內(nèi)的核苷酸序列結(jié)合，或位于大約200個(gè)堿基對內(nèi)，或位于大約500個(gè)堿基對內(nèi)或位于大約1000個(gè)堿基對內(nèi)，并且可以彼此相互延伸形成至少含有所述靶位點(diǎn)的擴(kuò)增子。
通過以下詳細(xì)說明和附圖，可以更好地理解本發(fā)明的上述方面和其他方面。


圖1是位于插入序列旁側(cè)的DNA和插入序列本身的序列比較的曲線圖，包括棉花事件MON15985中的Cry2Ab基因。插入的DNA以單鏈形式表示，從左側(cè)的5’到右側(cè)的3’。本文所鑒定的單一的DNA序列按以下方法標(biāo)記編號1是5’末端旁側(cè)基因組序列(SEQ ID NO19)，編號2是與編號1和3的序列重疊的結(jié)合序列，它是一種如SEQ ID NO14所示的診斷序列；編號3是核外DNA的與葉綠體相關(guān)的序列(SEQ IDNO20)；編號4是與編號3和5的序列重疊的結(jié)合序列，它是SEQ IDNO15所示的診斷序列；編號5是棉花基因組序列的殘跡(SEQ ID NO21)；編號6是與編號5和7重疊的結(jié)合序列，它是SEQ ID NO16所示的診斷序列；編號7是有意插入的序列的5’末端的一部分(SEQ IDNO22)；編號8是有意插入的序列的3’末端的一部分(SEQ ID NO23)；編號9是與編號8和10的序列重疊的結(jié)合序列，它是SEQ ID NO17所示的診斷序列；編號10是另一種非故意插入的棉花基因組序列的殘跡(SEQ ID NO24)；SEQ ID NO11是與編號10和12的序列重疊的結(jié)合序列，它是SEQ ID NO18所示的診斷序列；而編號12是SEQ IDNO25所示的3’旁側(cè)棉花基因組序列。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述業(yè)已通過遺傳學(xué)方法將陸地棉(棉花)修飾成抗鱗翅目害蟲，這種修飾會(huì)對棉花產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響。這一目的是通過插入源于蘇云金芽孢桿菌的編碼殺昆蟲Cry1Ac蛋白的第一種DNA框和源于蘇云金芽孢桿菌的編碼殺昆蟲Cry1Ab蛋白的第二種DNA框而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明優(yōu)選涉及至少包括含右所述第二種DNA框的序列的植物、植物部分、植物后代，并且涉及用于檢測所述序列在樣品中的存在的方法和組合物。
通過農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化利用源于質(zhì)粒PV-GHBK04(在US5500365中是pMON10518)將所述第一種DNA框插入棉花栽培品種Coker312的基因組中，以便產(chǎn)生棉花事件MON531，業(yè)已利用該事件培育了很多不同的棉花品種，并且成功地進(jìn)入了世界上的棉花市場。業(yè)已通過粒子加速技術(shù)用凝膠純化的線性DNA片段，即質(zhì)粒PV-GHBK11(或者被稱為pB1579)的上文所披露的第二種框，重新轉(zhuǎn)化了棉花事件MON531，所述DNA片段含有Cry2Ab和β-葡糖醛酸酶(uidA)編碼區(qū)(John，M.E.，1997，Cotton crop improvement through genetic engineering.CriticalReviews in Biotechnology，17，3185-208)。用uidA基因作為選擇標(biāo)記，幫助鑒定含有Cry2Ab編碼區(qū)的細(xì)胞。源于質(zhì)粒pvGHBK11的Cry2Ab編碼區(qū)包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，具有重復(fù)的增強(qiáng)子區(qū)(US5530196；5424200；和359142)可操作地連接在矮牽牛熱激蛋白非翻譯前導(dǎo)序列(pEThsp70-前導(dǎo)序列)上，可操作地連接或結(jié)合在源于擬南芥EPSPS基因的N-末端葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽上(AEPSPS/CTP2)(Van denBroeck等，1985，通過與源于核糖1，5-二磷酸羧化酶的小亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合，將外源蛋白導(dǎo)向葉綠體，Nature313，358-61)，可操作地連接或結(jié)合在編碼Cry2Ab蛋白的合成序列上(Widner，W.R.和Whiteley，H.R.1990，在來自蘇云金芽孢桿菌的鱗翅目-雙翅目結(jié)晶蛋白上的定位雙翅目專一性區(qū)，J.Bacteriol，172，2826-32)，它可操作地連接或結(jié)合在源于根瘤農(nóng)桿菌的胭脂氨酸合成酶(NOS)基因的3’非翻譯區(qū)上，它能終止轉(zhuǎn)錄并指導(dǎo)聚腺苷酸化(Fraley，R.T.等，1983，細(xì)菌基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，15，4803-07)。β-葡糖醛酸酶編碼區(qū)同樣是由強(qiáng)化的CaMV35S啟動(dòng)子和NOS3’聚腺苷酸化序列操縱的。將含有Cry2Ab和uidA編碼序列的所述框或基本上所述框的全部插入棉花事件MON531，產(chǎn)生了一種MON15985的事件，該事件包括Cry1A編碼序列以及編碼Cry2Ab編碼序列的框。對MON15985事件進(jìn)行的遺傳學(xué)分析業(yè)已證實(shí)，這兩種插入的框位于不同的染色體上，因此可以在育種過程中分離，這種分離產(chǎn)生了原始的MON531事件基因型，以及被稱為MON15985X的第二種基因型，第二種基因型是包括單一的插入框，該插入框包括決定編碼Cry2Ab蛋白的基因。能產(chǎn)生棉花基因型MON15985和MON15985X基因型的轉(zhuǎn)化事件被認(rèn)為是本發(fā)明的主題。
提供以下定義和方法是為了更好地定義本發(fā)明，并且指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非另有說明，術(shù)語是按照相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)使用方法理解的。分子生物學(xué)領(lǐng)域的常用術(shù)語的定義還可以參見Riger等，Glossary of GeneticsClassical and Molecular，5thedition，Springer-Verlag，New York，1991；和Lewin，Genes V，Oxford UniversityPressNew York，1994。采用在37CFR§1.822中所規(guī)定的對DNA堿基的命名。
含有在本文中，術(shù)語“含有”表示“包括但不限于”。
事件在本文中，轉(zhuǎn)基因“事件”表示通過以下方法生產(chǎn)的重組植物用異源DNA，即包括感興趣的轉(zhuǎn)基因的核酸結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再生通過將所述轉(zhuǎn)基因插入所述植物基因組所產(chǎn)生的植物群體，以及篩選以插入特定基因組位點(diǎn)為特征的特定植物。術(shù)語“事件”表示包括所述異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體和該轉(zhuǎn)化體的后代。術(shù)語“事件”還表示通過所述轉(zhuǎn)化體和含有所述異源DNA的另一種品種之間的有性遠(yuǎn)交所產(chǎn)生的后代。即使在與輪回群體重復(fù)回交之后，來自轉(zhuǎn)化親本的插入的DNA和旁側(cè)DNA仍然存在于雜交后代的相同染色體位點(diǎn)上。術(shù)語“事件”還表示來自所述原始轉(zhuǎn)化體的DNA，它含有插入的DNA和緊靠插入的DNA的旁側(cè)序列，預(yù)計(jì)該DNA能轉(zhuǎn)移到接受了包括感興趣的轉(zhuǎn)基因的插入DNA的后代，所述后代是通過一個(gè)包括所述插入DNA的親本系(例如，原始轉(zhuǎn)化體和通過自交產(chǎn)生的后代)和不含有所述插入DNA的親本系有性雜交而產(chǎn)生的。
探針和引物“探針”是在它上面連接了常規(guī)的可檢測標(biāo)記或報(bào)導(dǎo)分子的分離的核酸，例如，放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光試劑或酶。所述探針與靶核酸的一股鏈互補(bǔ)，對本發(fā)明來說，即與來自棉花事件MON15985的基因組DNA的一股鏈互補(bǔ)(來自棉花植物或來自包括源于所述事件的DNA的樣品)。本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，而且還包括聚酰胺和其他探針材料，這種材料能專一性地結(jié)合靶DNA序列，并且可用于檢測靶DNA序列的存在。
“引物”是能夠通過核酸雜交與互補(bǔ)的靶DNA鏈退火形成引物和靶DNA鏈之間的雜合體的分離的核酸，然后通過諸如DNA聚合酶的聚合酶沿靶DNA鏈延伸?？梢杂靡飳蚪M擴(kuò)增核酸序列，例如，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRTM(又被稱為熱擴(kuò)增方法，或其他常規(guī)核酸擴(kuò)增方法)。
所述探針和引物可以小到10個(gè)核苷酸，不過其長度通常為15個(gè)核苷酸或更長，優(yōu)選20個(gè)核苷酸或更長，更優(yōu)選25個(gè)核苷酸，最優(yōu)選30個(gè)核苷酸或更長。所述探針和引物能在高嚴(yán)格條件下專一性地與靶序列雜交。本發(fā)明的探針和引物優(yōu)選具有與所述靶序列的完整的序列互補(bǔ)性，不過，通過常規(guī)方法可以設(shè)計(jì)出與靶序列不同并且保留了與靶序列雜交的能力的探針。探針或引物或其他DNA序列的所有專一性序列都包括它的互補(bǔ)性序列。
例如，制備和使用探針和引物的方法披露于以下文獻(xiàn)中MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd.vol.1-3，ed.Sambrook等，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(以下稱之為“Sambrook et al.1989”)；Current Protocols in Molecular Biology，ed.S.Ausubel et al.，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York，1992(定期更新)(以下稱之為“Ausubel et al.，1992”)；和Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic PressSanDiego，1990。PCRTM-引物對可以來自已知序列，例如通過使用用于引物設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序(Version0.5，1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，MA)。
可以利用基于本文所披露的旁側(cè)DNA和插入序列的引物和探針通過常規(guī)方法來證實(shí)(如果需要的話，校正)所披露的序列，例如通過對所述序列進(jìn)行再克隆和測序。
核酸雜交；嚴(yán)格的條件；專一性本發(fā)明的核酸探針和引物能在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可用于鑒定來自轉(zhuǎn)基因事件的DNA在一種樣品中的存在。
術(shù)語“嚴(yán)格條件”是通過披露于Sambrook et al.1989，9.52-9.55中的專一性雜交方法對核酸探針與靶核酸(即與感興趣的特定核酸序列)的雜交進(jìn)行的功能性定義。還可以參見Sambrook et al.1989，9.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa，Nucl.Acids Res.12203-213，1984；和Wetmur和Davidson，J.Biol.31349-370，1968。
對于用特定的擴(kuò)增引物對進(jìn)行的靶核酸序列的擴(kuò)增(例如PCRTM)來說，“嚴(yán)格條件”是使得所述引物對只能與靶核酸序列雜交的條件，引物與它具有相應(yīng)的野生型序列(或補(bǔ)體)的靶核酸序列能夠結(jié)合，并且優(yōu)選產(chǎn)生特殊的擴(kuò)增產(chǎn)物。
術(shù)語“對(靶序列)專一”表示一種探針或引物在嚴(yán)格條件下只能與含有靶序列的樣品中的靶序列雜交。
核酸擴(kuò)增在本文中，“擴(kuò)增的DNA”或“擴(kuò)增子”表示作為核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為了確定通過有性雜交所產(chǎn)生的棉花植物是否含有來自棉花植物的轉(zhuǎn)基因事件基因組DNA，可以用一種引物對擴(kuò)增核酸，所述引物對包括源于所述植物基因組的靠近插入的異源DNA的插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列的引物，和源于插入的異源DNA的第二種引物，以便產(chǎn)生用于診斷所述事件存在的擴(kuò)增子(例如所述擴(kuò)增子具有用于診斷所述事件的長度和序列)。另外，引物對可以源于所述插入的DNA兩側(cè)的旁側(cè)序列，以便產(chǎn)生包括整個(gè)插入片段的擴(kuò)增子。
核酸擴(kuò)增可以通過本領(lǐng)域已知的多種核酸擴(kuò)增方法中的任一種進(jìn)行，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRTM)。有多種擴(kuò)增方法為本領(lǐng)域所公知，并且特別批露于以下文獻(xiàn)中US4683195和4683202，以及PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，ed.Innis et al.，AcademicPressSan Diego，1990。用于核酸擴(kuò)增的任何已知方法都可用于實(shí)施本發(fā)明。
可以通過以下方法證實(shí)(并且校正，如果需要的話)源于棉花事件MON15985的異源DNA插入片段或旁側(cè)序列的序列用源于本發(fā)明所提供的序列的引物擴(kuò)增源于所述事件的所述序列，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)DNA測序。
檢測試劑盒在本文中，“檢測試劑盒”表示用于檢測樣品中源于MON15985事件的DNA的存在或缺乏的試劑盒，該試劑盒包括能在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交的本發(fā)明的核酸探針和引物，以及實(shí)施核酸雜交或擴(kuò)增方法所需要的其他材料。另外，檢測試劑盒可以包括使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤╊愃朴谠诒皇兆鞅疚膮⒖嫉腜CT國際申請?zhí)朩O97/22719中所批露的方法所需要的材料，以便檢測樣品中源于MON15985事件的DNA的存在或缺乏。
例1業(yè)已將棉花(陸地棉)通過遺傳學(xué)方法修飾成抗鱗翅目害蟲，這種修飾對棉花產(chǎn)量有負(fù)面影響。這一目的是通過本文所批露的方法實(shí)現(xiàn)的，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，利用源于質(zhì)粒PV-GHBK04(在US5500365中被稱為pMON10518)的DNA片段插入源于蘇云金芽孢桿菌的編碼殺昆蟲Cry1Ac蛋白的DNA框。這種轉(zhuǎn)化導(dǎo)致在棉花基因組上插入了三個(gè)獨(dú)立的片段，決定在棉花事件531中表達(dá)Cry1Ac蛋白的主要的、功能性插入片段包括上文所批露的強(qiáng)化35S啟動(dòng)子、Cry1Ac編碼區(qū)和與編碼抗生素選擇標(biāo)記的序列連接的終止序列?？拷龅谝粋€(gè)插入片段并位于該序列上游的第二個(gè)插入片段包括部分Cry1Ac編碼區(qū)和終止序列。第二個(gè)插入片段僅包括部分終止序列，并且業(yè)已證實(shí)與上文所述的前兩種序列獨(dú)立地分離。第一種和第二種插入序列是緊密連鎖的，因此不會(huì)彼此分離。棉花基因組序列位于所有三個(gè)插入片段的5’和3’末端。因此，通過所述轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生了六種獨(dú)特的棉花基因組/插入片段結(jié)合?？梢詫σ陨狭N結(jié)合中的任一種進(jìn)行分析，以便確定MON531事件是否存在于棉花種子樣品中。
對棉花事件MON531進(jìn)行分子分析，以便確定所述轉(zhuǎn)基因DNA插入片段之一的末端，并且鑒定所述轉(zhuǎn)基因DNA插入片段的旁側(cè)棉花基因組DNA?；蚪M步移研究與核苷酸測序組合進(jìn)行得到了所述主要插入片段的兩種棉花基因組/插入片段結(jié)合的DNA序列，SEQ ID NO1和SEQID NO2及其互補(bǔ)體。然后按照以下方法鑒定可用于診斷MON531的旁側(cè)序列和插入片段序列SEQ ID NO3，所述主要插入片段的5’末端序列；SEQ ID NO4，5’末端的旁側(cè)棉花基因組序列；SEQ ID NO5，位于3’的所述插入片段序列；和SEQ ID NO6，3’末端旁側(cè)的基因組序列。如上文所述，引物可源于用于DNA擴(kuò)增方法的序列，例如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。SEQ ID NO9是一部分DNA的序列，它與棉花基因DNA和插入的DNA的一端重疊；SEQ ID NO10是一部分DNA的序列，它與棉花基因組DNA和所述插入的DNA的另一個(gè)末端重疊。
下面提供了如何利用所述新的核酸序列檢測樣品中的棉花事件MON531的非限定性例子，包括被命名為MON15985的種子品系，以及檢驗(yàn)其在被命名為MON15985X的種子品系中的缺乏。
分離用于PCRTM分析的DNA從種子組織中提取棉花事件MON531的DNA。從對照物質(zhì)(非轉(zhuǎn)基因棉花種子和葉片組織)的種子和葉片組織中提取DNA，通過用可以從商業(yè)渠道獲得的攪拌器將種子加工成細(xì)粉，以便從種子中提取DNA。將大約2克加工過的種子轉(zhuǎn)移到50毫升錐形試管中，并且將大約16毫升CTAB提取緩沖液[1.5％(w/w)CTAB，75mM Tris-HCl，pH8.0，100mMEDTA，pH8.0，1.05M氯化鈉和0.75％(w/w)PVP(MW40000)]添加到所述處理過的種子中。在65℃下培養(yǎng)所述樣品大約30分鐘，進(jìn)行間歇性地混合，然后冷卻到室溫。將等體積的(大約16毫升)室溫下的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)或氯仿添加到所述樣品中。通過倒轉(zhuǎn)混合該懸浮液，并通過以大約16000xg的速度離心5分鐘分離兩種相。用移液管取出含水層(上層)，并且放入一只干凈的50毫升的錐形試管中。將大約1/10倍體積(大約1.6毫升)的大約10％CTAB緩沖液[10％(w∶w)CTAB，0.7M氯化鈉]添加到所述水相中，然后通過倒轉(zhuǎn)混合。以大約16000xg的速度將所述樣品離心5分鐘，以便分離各相。取出水相(上部)與等體積的(大約15毫升)CTAB沉淀緩沖液[1％(w∶w)CTAB，50mMTris，pH8.0和10mMEDTA，pH8.0]混合，并且在室溫下放置大約1小時(shí)。以大約10000xg的速度對樣品進(jìn)行離心，以便使DNA沉淀，倒出上清液，并且將沉淀溶解在大約2毫升的高鹽TE[10mM Tris-HCl，pH8.0，10mMEDTA，pH8.0，和1M氯化鈉]中，在37℃下培養(yǎng)大約2小時(shí)，同時(shí)輕柔地?cái)嚢琛Ｒ源蠹s23000xg的速度離心，使所有殘余的雜質(zhì)沉淀。取出上清液，放入一只干凈的15毫升試管中，并且添加大約1/10體積的(大約150微升)3M乙酸鈉，pH5.2，和2體積的(相對上清液，大約4毫升)冰鎮(zhèn)100％乙醇，使DNA沉淀。將沉淀的DNA卷繞到裝有大約1毫升70％乙醇的微型離心機(jī)試管中。在微型離心機(jī)上以最大速度(14000rpm)離心5分鐘使DNA沉淀，干燥，并且重新溶解在TE，pH8.0中，在4℃的冰箱中過夜。
被用作對照的非轉(zhuǎn)基因棉花基因組DNA是從在液氮中冷凍并且用研缽和研棒研磨成細(xì)粉的葉片組織中分離的。將大約1克研磨的葉片組織轉(zhuǎn)移到13毫升的離心管中，并且添加6毫升提取緩沖液[2.5毫升DNA提取緩沖液(350mM山梨醇，100mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，0.38％(w/v)硫酸氫鈉)，2.5毫升細(xì)胞核裂解緩沖液(200mM Tris，pH7.5，50mM EDTA，2M氯化鈉，2％(w/v)CTAB)，和1毫升十二烷基肌氨酸鈉(5％(w/v)溶液)]。在65℃下將所述樣品培養(yǎng)大約30分鐘，進(jìn)行間歇性混合。將室溫下的4.5毫升氯仿∶異戊醇(24∶1(v/v))添加到所述樣品中。將所述懸浮液混合2-3分鐘，并通過在4℃下以大約2000xg的速度離心分離兩種相。用移液管取出含水層(上部)，并且放入13毫升的離心管中。添加5毫升100％的異丙醇，并通過倒轉(zhuǎn)混合所述試管，使DNA沉淀。將DNA的沉淀卷繞到裝有500微升70％乙醇的微型離心管中，在微型離心機(jī)上以最大速度(14000rpm)離心2分鐘使DNA沉淀。干燥所述DNA，并且溶解在TE緩沖液中，在4℃的冰箱中過夜。
PCRTM證實(shí)棉花事件MON531中的特殊插入片段-棉花基因組結(jié)合。
使用基于PCRTM的通用基因組步移試劑盒TM，按照生產(chǎn)商的方法鑒定四種基因組/插入片段結(jié)合的DNA序列，然后對PCRTM產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸測序。然后，使用一種互補(bǔ)于棉花基因組DNA的引物和互補(bǔ)于插入的轉(zhuǎn)基因DNA的另一種引物進(jìn)行PCR測定。例如，將一種引物設(shè)計(jì)成互補(bǔ)于基因組旁側(cè)序列的主要的功能性插入片段的3’末端(例如，SEQ IDNO6)，該引物與位于互補(bǔ)于插入的轉(zhuǎn)基因序列的所述主要的功能性插入片段的3’末端的第二種引物(例如，SEQ ID NO5)配對。使用10-100納克的棉花事件MON531基因組DNA模板在50微升反應(yīng)體積中進(jìn)行PCRTM測定，所述反應(yīng)體積中合有終濃度為1.1mM鎂離子，0.4μM每一種引物，200μM每一種dNTP，和2.5單位的TaqDNA聚合酶。PCRTM測定的反應(yīng)是在以下循環(huán)條件下進(jìn)行的1輪94℃3分鐘；30輪94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒；1輪72℃1分鐘；通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCRTM產(chǎn)物。通過溴化乙錠染色觀察，從凝膠上切除，并且用染料終止子化學(xué)方法對DNA進(jìn)行測序證實(shí)所述序列。
在上述實(shí)施例中，正如所預(yù)料的，沒有模板DNA和Coker312非轉(zhuǎn)基因負(fù)對照DNA的對照反應(yīng)不能產(chǎn)生PCRTM產(chǎn)物。所述棉花事件MON531樣品產(chǎn)生了3’旁側(cè)序列的264bp的預(yù)期大小的PCRTM產(chǎn)物。因此，將位于棉花事件MON531中的插入的DNA和棉花基因組DNA的結(jié)合部分的新的核酸序列用于檢測樣品中的源于棉花事件MON531的DNA。
將品種Coker312背景中的MON531雜交轉(zhuǎn)移到品種DP50(Delta&Pine Land Company)中，以便產(chǎn)生含有編碼Cry1Ac蛋白的MON531事件的品種，該品種被命名為DP50B。
例2本實(shí)施例披露了被命名為MON15985的源于DP50B的含有編碼Cry2Ab昆蟲抑制蛋白的額外插入事件的轉(zhuǎn)化過的棉花植物的生產(chǎn)，以及位于MON15985 5’和3’末端旁側(cè)的5’和3’DNA序列的分離和鑒定。
通過粒子加速技術(shù)，使用源于質(zhì)粒PV-GHBK11的線性DNA片段轉(zhuǎn)化靶DP50B植物細(xì)胞。通過用限制性酶KpnI消化質(zhì)粒PV-GHBK11制備線性DNA片段。通過瓊脂糖凝膠電泳分離質(zhì)粒片段，并且提取包括含有Cry2Ab編碼序列和uidA編碼序列(GUS)的框的DNA片段。在分離和純化和制備用于棉花組織轟擊的片段和序列內(nèi)不包括質(zhì)粒主鏈。所述表達(dá)框包括受強(qiáng)化CaMV35S植物表達(dá)啟動(dòng)子和根瘤農(nóng)桿菌NOS3’轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸化序列調(diào)控的Cry2Ab編碼區(qū)。將Cry2Ab設(shè)計(jì)成針對作為葉綠體輸入植物細(xì)胞的前體蛋白的表達(dá)產(chǎn)物(披露于WO0026371和美國專利申請流水號09/186002中，申請日為1998年11月4日，所述專利的完整內(nèi)容被收作本文參考)。
通過用靜電放電方法轟擊用DNA包衣的金顆粒，利用上述DNA框轉(zhuǎn)化棉花品種DP50B(John，M.E.，通過遺傳工程技術(shù)對棉花作物進(jìn)行改良。Critical Reviews in Biotechnology，17185-208，1997)。篩選不同事件的抗昆蟲害蟲的效力、表現(xiàn)型、以及Cry2Ab蛋白的表達(dá)的遺傳學(xué)分離。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，選擇了6個(gè)品系對所述插入事件作進(jìn)一步的鑒定。將Southern印跡作為評估一個(gè)或多個(gè)拷貝數(shù)的插入事件的插入和互補(bǔ)性的存在的主要方法。選擇其中的一個(gè)品系15985對插入DP50B基因組的插入事件進(jìn)行充分的分子鑒定。分離并鑒定所述插入事件周圍的DNA。
分離插入事件旁側(cè)的DNA通過購自Amersham的改進(jìn)的Phyto-Pure從幼小的棉花葉片中提取DNA，該方法被設(shè)計(jì)成從具有大量污染性碳水化合物的植物中提取DNA。為了界定插入的Cry2Ab編碼序列周圍的DNA的序列，使用了Clone Tech，Inc.的基因組步移方法。采用生產(chǎn)商推薦的條件，只進(jìn)行了一種改進(jìn)在用內(nèi)切核酸酶裂解之后，不是用苯酚提取來純化DNA，而是用Qiagen QIAquick螺旋柱按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)手冊純化DNA。
在接頭連接之前，用于裂解基因組DNA的酶是DraI、PvuII、ScaI和StuI。按照Qiagen提供的方法在5倍體積的PB緩沖液中提取DNA，結(jié)合到所述柱上，用0.75毫升的PE洗滌，然后從所述柱上洗脫到20毫升的10mM Tris pH8.5中。然后將該DNA用作接頭文庫的來源。精心選擇引物位點(diǎn)，使其遠(yuǎn)離將DNA線性化的末端，以便在每一個(gè)末端可以有一定量的缺失。將第一種引物(SEQ ID NO30和SEQ ID NO31)設(shè)計(jì)成與Cry2Ab編碼序列的特有序列退火，因?yàn)樵诿藁ɑ蚪M中存在重復(fù)的DNA因子。使用直接靠近用于第一種反應(yīng)的嵌套引物(SEQ ID NO32和SEQ ID NO33)對所得到的PCRTM產(chǎn)物進(jìn)行第二種PCRTM反應(yīng)。所使用的PCRTM參數(shù)是由CloneTech推薦的。主要擴(kuò)增參數(shù)如下7輪94℃2秒，72℃3分鐘，32輪94℃2秒，68℃3分鐘，第二種擴(kuò)增參數(shù)如下5輪94℃2秒，72℃3分鐘，20輪94℃2秒，68℃3分鐘，以及在最后1輪中為68℃40分鐘。所有PCRTM反應(yīng)是在Perkin-Elmer9700儀器上進(jìn)行的。
將來自第二次擴(kuò)增的PCRTM產(chǎn)物克隆到購自Stratagene的pBS(SK+)載體上，所述載體業(yè)已用SmaI裂解過，以便產(chǎn)生平端，并且用堿性磷酸酶處理，以便抑制自我連接。在第二種PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA片段用T4DNA激酶，以便添加5’磷酸，然后在標(biāo)準(zhǔn)連接條件下連接到所述平端載體上。
基因組步移方法用嵌套引物對進(jìn)行的二級PCRTM反應(yīng)，產(chǎn)生了從5’和3’末端合成的多種片段。克隆5’末端的三個(gè)獨(dú)立的片段，并且用本領(lǐng)域眾所周知的方法測序，同時(shí)對來自3’末端的兩個(gè)片段進(jìn)行克隆和測序。對每一個(gè)獨(dú)立的片段來說，獲得了至少兩個(gè)獨(dú)立的克隆。
將來自每一種引物的克隆的序列與另一種進(jìn)行比較。確定相應(yīng)克隆之間的所述序列是相同的，并且含有相同的植物反式基因結(jié)合。
例3本實(shí)施例說明了如何利用MON15985插入事件旁側(cè)的DNA序列測定接合性。
基于PCRTM的測定方法的設(shè)計(jì)和開發(fā)，用于檢測MON15985插入事件的純合性將位于MON15985插入事件旁側(cè)的兩個(gè)部分的DNA序列用于設(shè)計(jì)基于PCRTM的純合性測定。如果這種測定能夠檢測專一性MON15985插入事件和野生型染色體，就認(rèn)為這種測定是有用的。為了檢驗(yàn)開發(fā)一種同樣能夠檢測野生型染色體的測定方法的可行性，根據(jù)直接與所述插入事件相鄰的序列設(shè)計(jì)引物，并且檢驗(yàn)它是否能用于在非轉(zhuǎn)基因棉花以及在15985品系中合成DNA片段。所選擇的引物能夠合成完整的MON15985插入事件，但是在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袥]有出現(xiàn)產(chǎn)物。以上結(jié)果表明，所述插入事件不是簡單地破壞了所述DNA以及所述DNA序列的插入以及編碼Cry2Ab蛋白的框。不過，這一結(jié)果確定了所述兩個(gè)末端確實(shí)與含有Cry2Ab的完整的基因框連接并且位于該基因旁側(cè)。
設(shè)計(jì)插入片段3’末端旁側(cè)的氨基酸序列的引物，以便通過基因組步移方法在用非轉(zhuǎn)基因棉花DNA制備的接頭文庫中擴(kuò)增片段。由非轉(zhuǎn)基因棉花克隆一個(gè)620bp的片段，并且測序。然后利用該序列設(shè)計(jì)用于野生型染色體的引物，所述野生型染色體存在于雜合型個(gè)體中。制備了若干組引物，并且在一起檢測，以便發(fā)現(xiàn)能在單一反應(yīng)中起作用并且不會(huì)產(chǎn)生背景帶的一組引物。發(fā)現(xiàn)包括SEQ ID NO34(3’棉花植物旁側(cè)序列)和SEQ ID NO35(5’棉花植物旁側(cè)序列)的引物組能夠由野生型或非轉(zhuǎn)基因棉花DNA產(chǎn)生800bp的擴(kuò)增子。不過，如果存在至少一個(gè)插入片段的話，包括SEQ ID NO36的引物將會(huì)與Cry2Ab專一性序列退火，并且產(chǎn)生1.5kb的擴(kuò)增子，其中的一個(gè)引物與3’棉花植物旁側(cè)序列(SEQ ID NO34)退火。因此，用包括SEQ ID NO36、SEQ ID NO34和SEQ ID NO35的PCRTM引物獲得的測定結(jié)果如下如果一種個(gè)體的MON15985插入事件是純合的話，就僅存在1.5kb的一條帶；但是，如果它是雜合的話，就還會(huì)存在另一個(gè)0.8kb的帶。
對這兩條帶(1.5kb和0.8kb)進(jìn)行克隆和測序，以便證實(shí)其身份。在雜合性個(gè)體中產(chǎn)生的800bp片段的DNA序列與用來自3’末端和非轉(zhuǎn)基因DNA的引物產(chǎn)生的基因組步移片段的序列相同。
證實(shí)基于PCRTM的接合測定為了驗(yàn)證接合測定的精確性，用MON15985的已知的純合型、雜合型和陰性轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。
R2
表現(xiàn)型對來自三種推測的R1基因型的15個(gè)R2個(gè)體植物進(jìn)行鑒定，通過ELISA確定Cry2Ab蛋白的存在或缺乏，在該研究中呈陽性的感興趣的植物含有MON15985-2和MON15985-34。業(yè)已確定植物MON15985-71對于Cry2Ab蛋白來說是陰性的。
R3表現(xiàn)型將來自所選擇的每一個(gè)R2植物的15個(gè)單個(gè)R3種子種植在4英寸的花盆中，然后通過定性ELISA篩選Cry2Ab蛋白的存在。該ELISA結(jié)果表明，MON15985-2的所有R3植物都是陽性的，因此可以確定R2親本的Cry2Ab基因是純合的。MON15985-34的R3后代是陽性和陰性植物的混合，R2親本被確定為Cry2Ab基因雜合的。MON15985-71的所有R3植物是陰性的，并且證實(shí)了R2親本也是陰性的。
基因型對MON15985-2和MON15985-71的5個(gè)R3植物進(jìn)行基于PCRTM的結(jié)合測定。使用上文所述的引物和技術(shù)。該測定的結(jié)果提供了預(yù)期的帶型。MON15985-2的所有后代只產(chǎn)生了支持上述ELISA結(jié)果的單一的1.5kb的帶，這表明MON15985-2品系的Cry2Ab基因是純合型陽性的。MON15985-71的所有后代僅產(chǎn)生存在于野生型中的單一的0.8kb的帶，因此支持了證實(shí)該品系的Cry2Ab基因是純合陰性的ELISA結(jié)果。同樣對MON15985-34的14個(gè)單個(gè)R2家族的每一個(gè)家族的每一個(gè)后代進(jìn)行篩選，得到純合型、雜合型和陰性植物的組合。
R4讓來自所有三個(gè)R3群體的5個(gè)單株進(jìn)行自花授粉，并且生長到收獲。將來自每一個(gè)R3植物的15個(gè)R4后代種植到4英寸的花盆中，通過PCRTM進(jìn)行檢測，以便證實(shí)R3植物的結(jié)果。因此，如果R3PCRTM的結(jié)果是純合的話，所有的R4后代都應(yīng)當(dāng)是純合的，而如果R3PCR結(jié)果是雜合的話，R4后代就會(huì)是純合型、雜合型和陰性植物的混合。所有R4后代家族都產(chǎn)生了基于R3PCRTM測定的預(yù)期結(jié)果。因此，基于PCRTM的測定方法提供了用于對植物的接合性進(jìn)行分型的可靠方法。
例4本實(shí)施例說明了位于棉花事件MON15985中的插入片段的5’和3’末端的旁側(cè)DNA序列。
來自MON15985的DNA是從在液氮中冷凍并且用研缽和研棒研磨成細(xì)粉的葉片組織中分離的。將大約1克研磨的葉片組織轉(zhuǎn)移到13毫升的離心管中，并且添加6毫升提取緩沖液[2.5毫升DNA提取緩沖液(350mM山梨醇，100mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，0.38％(w/v)硫酸氫鈉)，2.5毫升細(xì)胞核裂解緩沖液(200mM Tris，pH7.5，50mM EDTA，2M氯化鈉，2％(w/v)CTAB)，和1毫升十二烷基肌氨酸鈉(5％(w/v)溶液)]。在65℃下將所述樣品培養(yǎng)大約35分鐘，進(jìn)行間歇性混合。將室溫下的4.5毫升氯仿∶異戊醇(24∶1(v/v))添加到所述樣品中。將所述懸浮液混合2-3分鐘，并通過在4℃下以大約2000xg的速度離心分離兩種相。用移液管取出含水層(上部)，并且放入13毫升的離心管中。添加5毫升100％的異丙醇，并通過倒轉(zhuǎn)混合所述試管，使DNA沉淀。將DNA的沉淀卷繞到裝有500微升70％乙醇的微型離心管中，在微型離心機(jī)上以最大速度(14000rpm)離心2分鐘使DNA沉淀。干燥所述DNA，并且溶解在TE緩沖液中，在4℃的冰箱中過夜。
從種子組織中提取棉花事件DP50對照的DNA。通過用可以從商業(yè)渠道獲得的攪拌器將種子加工成細(xì)粉，以便從種子中提取DNA。將大約2克加工過的種子轉(zhuǎn)移到50毫升錐形試管中，并且將大約16毫升CTAB提取緩沖液[1.5％(w/w)CTAB，75mM Tris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，pH8.0，1.05M氯化鈉和0.75％(w/w)PVP(MW40000)]添加到所述處理過的種子中。在65℃下培養(yǎng)所述樣品大約30分鐘，進(jìn)行間歇性地混合，然后冷卻到室溫。將等體積的(大約15毫升)室溫下的氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)或氯仿添加到所述樣品中。通過倒轉(zhuǎn)混合該懸浮液，并通過以大約16000xg的速度離心5分鐘分離兩種相。用移液管取出含水層(上層)，并且放入一只干凈的50毫升的錐形試管中。將大約1/10倍體積(大約1.5毫升)的10％CTAB緩沖液[10％(w∶w)CTAB，0.7M氯化鈉]添加到所述水相中，然后通過倒轉(zhuǎn)混合。以大約16000xg的速度將所述樣品離心5分鐘，以便分離各相。取出水相(上部)與等體積的(大約15毫升)CTAB沉淀緩沖液[1％(w∶w)CTAB，50mM Tris，pH8.0和10mM EDTA，pH8.0]混合，并且在室溫下放置大約1小時(shí)。以大約10000xg的速度對樣品進(jìn)行離心，以便使DNA沉淀，倒出上清液，并且將沉淀溶解在大約2毫升的高鹽TE[10mM Tris-HCl，pH8.0，10mMEDTA，pH8.0，和1M氯化鈉]中，在37℃下培養(yǎng)大約2小時(shí)，同時(shí)輕柔地?cái)嚢琛Ｒ源蠹s23000xg的速度離心，使所有殘余的雜質(zhì)沉淀。取出上清液，放入一只干凈的15毫升試管中，并且添加大約1/10體積的(大約150微升)3M乙酸鈉，pH5.2，和2體積的(相對上清液，大約4毫升)冰鎮(zhèn)100％乙醇，使DNA沉淀。將沉淀的DNA卷繞到裝有大約1毫升70％乙醇的微型離心機(jī)試管中。在微型離心機(jī)上以最大速度(14000rpm)離心5分鐘使DNA沉淀，干燥，并且重新溶解在TE，pH8.0中，在4℃的冰箱中過夜。
在產(chǎn)生所述DNA的研究中，在開始研究之前對分別來自DP50和MON15985的DNA進(jìn)行定量。DNA定量是使用Hoefer DyNA Qua nt200熒光計(jì)，用Boehringer Mannheim分子大小標(biāo)記IX作為DNA校正標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行的。
位于棉花事件MON15985中的編碼Cry2Ab蛋白的插入片段5’末端旁側(cè)的基因組序列的PCR分析是用源于5’基因組旁側(cè)序列的引物進(jìn)行的，該引物與位于插入的DNA上的靠近強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子序列的跨越1894bp區(qū)的第二種引物配對(SEQ ID NO26和SEQ ID NO27)。對編碼Cry2Ab蛋白的棉花、事件MON15985種的插入片段3’末端的旁側(cè)基因組序列的PCR分析是用MON3’聚腺苷酸化序列上的靠近插入片段3’末端的引物進(jìn)行的，該引物與源于3’基因組旁側(cè)序列的跨越763bp片段的第二種引物配對(SEQ ID NO28和SEQ ID NO29)。
用源于棉花事件MON15985或非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌废礑P50的基因組DNA進(jìn)行PCR分析。PCR分析是使用35-50納克棉花事件MON15985或非轉(zhuǎn)基因品系DP50基因組DNA模板在50微升反應(yīng)體積中進(jìn)行的，反應(yīng)混合物中含有終濃度為1.5mM的鎂離子，0.2μM每一種引物，200μM dNTP，和2.5單位Platinum TaqDNA聚合酶(Gibco BRL)。插入片段5’末端的反應(yīng)是在以下循環(huán)條件下進(jìn)行的1輪94℃3分鐘；35輪94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃2分鐘；1輪72℃10分鐘。插入片段3’末端的反應(yīng)是在以下循環(huán)條件下進(jìn)行的1輪94℃3分鐘；35輪94℃1分鐘，5℃1分鐘，72℃45秒；1輪72℃10分鐘。在1.0％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物。在100V電壓下進(jìn)行電泳大約1.5-2小時(shí)，通過溴化乙錠染色進(jìn)行觀察。
通過在1.0％瓊脂糖凝膠上對20微升的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離用兩種引物對制備的含有棉花事件MON15985中的編碼Cry2Ab蛋白的插入片段的5’和3’末端的旁側(cè)序列的預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。從凝膠中切除代表5’或3’旁側(cè)序列的PCR產(chǎn)物，并且用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照生產(chǎn)商提供的方法進(jìn)行純化。對兩種分析來說，用PCR引物通過染料終止子化學(xué)方法對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。由于PCR產(chǎn)物的長度，利用用于制備產(chǎn)物的引物以及被設(shè)計(jì)成擴(kuò)增序列的內(nèi)部序列的引物進(jìn)行測序。
對從棉花事件MON15985和非轉(zhuǎn)基因品系DP50提取的基因組DNA進(jìn)行PCR分析，以便證實(shí)位于棉花事件MON15985中的插入片段的5’和3’末端的旁側(cè)DNA序列。正如所預(yù)料的，不含模板DNA的對照反應(yīng)以及含有DP50非轉(zhuǎn)基因棉花DNA的反應(yīng)不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。對棉花事件MON15985 DNA進(jìn)行PCR分析產(chǎn)生了1894bp的預(yù)期大小的產(chǎn)物，它代表編碼Cry2Ab蛋白的插入片段的旁側(cè)序列和5’末端的一部分。正如所預(yù)料的，不含模板DNA的對照反應(yīng)和含有DP50非轉(zhuǎn)基因棉花DNA的反應(yīng)不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。對棉花事件MON15985 DNA進(jìn)行PCR分析產(chǎn)生了763bp的預(yù)期大小的產(chǎn)物，它表示所述插入片段的旁側(cè)序列和3’末端的一部分。以上結(jié)果表明，從棉花事件MON15985中的編碼Cry2Ab的插入片段的兩端產(chǎn)生了推測大小的PCR產(chǎn)物。
代表插入片段5’末端的旁側(cè)棉花基因組DNA序列和插入片段5’末端的DNA的共有序列如SEQ ID NO11所示。所述5’共有序列資料包括所述插入片段旁側(cè)的1877bp的DNA，隨后是390bp的含有強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子的序列。362-750堿基對表現(xiàn)出與葉綠體DNA具有同源性。代表插入片段3’末端的旁側(cè)棉花基因組DNA序列和插入片段3’末端的DNA的共有序列如SEQ ID NO12所示。3’共有序列數(shù)據(jù)包括349bp的插入序列，該序列含有NOS3’聚腺苷酸化序列的3’末端和多接頭序列，隨后是插入片段旁側(cè)的1012bp的棉花基因組DNA。本文所提供的5’和3’共有序列是多次測序反應(yīng)的組合，并且比用于制備該序列的PCR產(chǎn)物的長度短。以上數(shù)據(jù)描繪了棉花事件MON15985中的插入片段的5’和3’末端，并且示出了僅靠插入片段兩個(gè)末端旁側(cè)的DNA。
以上數(shù)據(jù)表明，棉花事件MON15985含有單一的DNA插入片段，該插入片段包括(1)受強(qiáng)化35S CaMV啟動(dòng)子(在5’末端缺乏大約260bp)和NOS3’聚腺苷酸化序列調(diào)控的編碼UidA的序列(GUS)；和(2)受強(qiáng)化35S CaMV啟動(dòng)子(在5’末端缺乏大約260bp)和NOS3’聚腺苷酸化序列調(diào)控的編碼Cry2Ab的編碼序列(圖1)。在本實(shí)施例中進(jìn)行的PCR和序列分析證實(shí)了棉花事件MON15985中編碼Cry2Ab的插入片段的5’和3’末端序列，并且證實(shí)了插入片段5’和3’末端旁側(cè)的基因組DNA序列。
例5本實(shí)施例說明了棉花事件MON15985旁側(cè)序列的物理學(xué)特征，并且鑒定了棉花事件MON15985中插入的DNA的5’和3’末端旁側(cè)的其他DNA序列的性質(zhì)和物理學(xué)定位。通過Southern印跡分析基因組DNA，以便確定插入事件的數(shù)量，插入的DNA的拷貝數(shù)量，插入的啟動(dòng)子的完整性，編碼區(qū)，以及聚腺苷酸化序列，和質(zhì)粒主鏈序列的存在和缺乏。所有分析都是用棉花品系DP50B(對照)和新生產(chǎn)的MON15985事件進(jìn)行的，以便鑒定新插入的DNA。另外，通過PCR證實(shí)了5’和3’“插入片段-至-植物”結(jié)合的旁側(cè)序列(以前是通過基因組步移測定的)。
質(zhì)粒PV-GHBK11-來源質(zhì)粒，在以上分析中被用作主要參考物質(zhì)。將與來自DP50對照物質(zhì)的質(zhì)粒用作大小標(biāo)記以及用作Southern印跡分析中的陽性雜交對照。另外，將購自Boehringer Mannheim[分子量標(biāo)記II(23.1kb-0.6kb)和IX(1.4kb-0.072kb)，產(chǎn)品目錄號分別為#236250和#1449460]和Gibco BRL[大分子量DNA標(biāo)記(48.5kb-8.3kb)和100bp的序列梯(2.1kb-0.1kb)，產(chǎn)品目錄號分別為#15618-010和#15628-019]的分子大小標(biāo)記用于大小估計(jì)。
用多種限制酶消化來自抗昆蟲型棉花事件MON15985的基因組DNA，并且進(jìn)行Southern印跡雜交分析，以便鑒定整合到DP50B基因組中的編碼Cry2Ab和GUS的DNA。
將從葉片組織中提取的DNA用于本實(shí)施例的所有分析中，只有用NOS3’聚腺苷酸化序列探針檢測的用于檢測uidA基因框完整性的非轉(zhuǎn)基因樣品例外，該樣品是按照Rogers和Bendich的方法分離的(1985)。將大約1克研磨的葉片組織轉(zhuǎn)移到13毫升的離心管中，離心管中裝有6毫升提取緩沖液[2.5毫升DNA提取緩沖液(350mM山梨醇，100mMTris，pH7.5，5mM EDTA，0.38％(w/v)硫酸氫鈉)，2.5毫升細(xì)胞核裂解緩沖液(200mM Tris，pH7.5，50mM EDTA，2M氯化鈉，2％(w/v)CTAB)，和1毫升十二烷基肌氨酸鈉(5％(w/v)溶液)]。在65℃下將所述樣品培養(yǎng)大約30分鐘，進(jìn)行間歇性混合。將室溫下的4.5毫升氯仿∶異戊醇(24∶1)添加到所述樣品中。將所述懸浮液混合2-3分鐘，并通過在4℃下以大約1000xg的速度離心15分鐘分離兩種相。用移液管取出含水層(上部)，并且放入13毫升的離心管中。添加5毫升100％的異丙醇，并通過倒轉(zhuǎn)混合所述試管，使DNA沉淀。通過在4℃下以大約1000xg的速度離心5分鐘使DNA沉淀。用大約1毫升70％乙醇洗滌沉淀，通過在4℃下以大約1000xg的速度離心5分鐘。在室溫下干燥所述DNA，并且溶解在TE緩沖液中，在4℃的冰箱中過夜。
DNA定量是使用Hoefer DyNA QunatTM200熒光計(jì)San Francisco，CA，用Boehringer Mannheim分子大小標(biāo)記IX作為DNA校正標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行的。
將來自測試和對照品系的大約10微克基因組DNA用于限制酶消化。按照生產(chǎn)商的方法用100個(gè)單位的限制酶，在500微升的總體積中，在37℃下進(jìn)行消化過夜。用5或10pg PV-GHBK11強(qiáng)化某些對照消化。所有限制酶都是從Boehringer Mannheim購買的。在消化之后，通過添加1/10體積(大約50微升)的3M乙酸鈉和2倍體積的(相對原始消化體積而言為大約1毫升)100％的乙醇使樣品沉淀，然后在-20℃下培養(yǎng)至少1小時(shí)。通過離心使消化的DNA沉淀，用70％的乙醇洗滌，真空干燥10-20分鐘，在室溫下重新溶解在水或TE中。
在1×TBE緩沖液中，在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離消化過的DNA。進(jìn)行‘長時(shí)間電泳’和‘短時(shí)間電泳’以便分別進(jìn)行Southern印跡分析。長時(shí)間電泳有利于更好地分辨高分子量DNA，而短時(shí)間電泳能確保所有較小分子量的DNA都留在凝膠上。長時(shí)間電泳/短時(shí)間電泳包括在80-85V的電壓下電泳4-6小時(shí)，或者在35-38V的電壓下電泳一夜(9-15小時(shí))。在電泳之后，用0.5微克/毫升的溴化乙錠對凝膠進(jìn)行20-30分鐘的染色，并且照相。
從過夜的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒PV-GHBK11 DNA。用PV-GHBK11作模板通過PCR制備與Cry2Ab編碼區(qū)、uidA編碼區(qū)、強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子、NOS3’聚腺苷酸化序列和完整的主鏈片段同源的探針模板。
通過隨機(jī)啟動(dòng)方法(RadPrime DNA Labeling System，LifeTechnologies)，用32P-dCTP標(biāo)記大約25納克的每一種探針模板，NOS3’聚腺苷酸化序列除外。NOS3’聚腺苷酸化序列是在20微升的最終體積中通過PCR用NOS3’模板(15納克)、NOS3’專一性引物(各0.5μM)、1.5mM氯化鎂、3μM dATP、dGTP和dTTP、100μCi的32P-dCTP和2.5單位的Taq DNA聚合酶標(biāo)記的。循環(huán)條件如下1輪94℃3分鐘；5輪94℃45秒，55℃30秒，和72℃1分鐘；1輪72℃10分鐘。用Sephadex G-50柱(Boehringer Mannheim)純化放射性標(biāo)記過的探針。
用業(yè)已完善的方法進(jìn)行Southern印跡分析(Southern，1975)，一般參見Maniatis Fritsch Sambrook(冷泉港)。在電泳之后，在脫嘌呤溶液(0.125N鹽酸)中培養(yǎng)凝膠大約10分鐘，然后在變性溶液(0.5M氫氧化鈉，1.5M氯化鈉)中培養(yǎng)大約30分鐘，然后在中和溶液(0.5MTris-HCl，pH7，1.5M氯化鈉)中培養(yǎng)大約30分鐘。用TurboblotterTM(Schleicher&Schull)將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-NTM尼龍膜(Amersham)上。讓DNA轉(zhuǎn)移4小時(shí)至一夜(在20×SSC)中，并且通過可以調(diào)整到自動(dòng)交聯(lián)的UV SratalinkerTM1800(Stratagene)與所述膜共價(jià)交聯(lián)。在含有0.5M磷酸鈉，7％SDS(w/v)和0.1毫克/毫升大腸桿菌tRNA的水溶液中讓所述印跡進(jìn)行平均2小時(shí)的預(yù)雜交。與放射性標(biāo)記過的探針的雜交是在新的預(yù)雜交溶液中在大約65℃下進(jìn)行大約14-21小時(shí)。用0.1％(w/v)SDS和0.1×SSC的水溶液在65℃下洗滌膜至少4次，間隔15分鐘。用Koda Biomax MSTM膠片與Koda Biomax增感屏制備產(chǎn)生所述印跡的多次曝光。通過在煮沸的0.1％(w/v)SDS中培養(yǎng)剝離印跡，并且讓它冷卻到室溫。
評估插入片段的數(shù)量(棉花基因組中新導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因DNA的整合位點(diǎn)的數(shù)量)。用限制酶ScaI消化測試和對照DNA，這種酶不會(huì)裂解用于轉(zhuǎn)化的DNA片段的內(nèi)部。這種酶能釋放出含有插入的DNA和相鄰的植物基因組DNA的片段。同樣用XbaI消化質(zhì)粒強(qiáng)化的DP50‘短時(shí)間電泳’的樣品，以便將質(zhì)粒線性化。用參考質(zhì)粒PV-GHBK11檢測印跡。
通過用限制酶SphI——一種只能在用于產(chǎn)生所述事件的線性DNA片段上裂解一次的酶——消化測試基因組DNA。用參考質(zhì)粒PV-GHBK11檢測印跡。
通過用限制酶NcoI——能裂解Cry2Ab編碼區(qū)的5’和3’末端——消化，確定Crt2Ab編碼區(qū)的完整性。用完整長度的Cry2Ab編碼區(qū)檢測印跡。
通過用限制酶BamHI——它能裂解基因Cry2Ab框的5’和3’末端——消化，評估Cry2Ab編碼框(強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子、Cry2Ab編碼區(qū)和NOS3’聚腺苷酸化序列)的完整性。依次用所述框的每一種因子檢測印跡。
通過用限制酶EcoRI和BglII——它們分別能裂解uidA編碼區(qū)的5’和3’末端——消化，確定uidA編碼區(qū)的完整性。用完整長度的uidA編碼區(qū)檢測印跡。
通過用限制酶BamHI和DphI——它們能裂解uidA框的5’和3’末端——消化，評估uidA框(強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子、Cry2Ab編碼區(qū)和NOS3’聚腺苷酸化序列)的完整性。依次用所述框的每一種因子檢測印跡。
沒有將被確定為PV-GHBK11的KpnI限制片段的質(zhì)粒的主鏈區(qū)用于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。它包括受細(xì)菌啟動(dòng)子控制的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，ori-pUC和nptII基因。為了證實(shí)主鏈的缺乏，用限制酶KpnI消化基因組DNA，并且用完整長度的主鏈區(qū)檢測。按上述方法，用Clonetech’s Universal GenomeWalkerTM試劑盒測定5’和3’插入片段-至-植物基因組DNA結(jié)合的序列。將引物設(shè)計(jì)成能通過PCR證實(shí)所述結(jié)合。用被設(shè)計(jì)成5’基因組旁側(cè)序列的引物證實(shí)5’結(jié)合，該引物與uidA基因的強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子中的第二種引物配對。用被設(shè)計(jì)成3’基因組旁側(cè)序列的引物和位于Cry2Ab基因的第二種引物驗(yàn)證3’結(jié)合。在25微升的反應(yīng)體積中，使用作為模板的100納克葉片基因組DNA(1-2微升)、10皮摩爾每一種引物(各1微升)和PCR Supermix(Gibco BRL產(chǎn)品目錄號10572-514)進(jìn)行PCR。所述反應(yīng)的擴(kuò)增是在以下循環(huán)條件下進(jìn)行的1輪94℃3分鐘；3輪94℃30秒，55℃1分鐘，72℃2分鐘；2輪72℃4分鐘。在1×TAE中在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并且通過用溴化乙錠染色進(jìn)行觀察。
用ScaI消化測試和對照DNA樣品，同樣用ScaI消化用PV-GHBK強(qiáng)化的DP50對照DNA。由于ScaI不能裂解所述質(zhì)粒的內(nèi)部，添加第二種酶XbaI，以便使該質(zhì)粒線性化。將所述質(zhì)粒線性化，以便其通過凝膠遷移，起著精確的大小估測物的作用。用放射性標(biāo)記的PV-GHBK11(圖1)檢測印跡，它是用于轉(zhuǎn)化的線性DNA片段的來源質(zhì)粒。對DP50進(jìn)行長時(shí)間電泳沒有產(chǎn)生任何可檢測的背景帶。對與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11進(jìn)行短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了大約8.7kb的預(yù)期大小的帶，它是完整質(zhì)粒的大小，沒有其他的帶。對DP50B進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了大約為22kb和15kb(非常弱)的兩條帶。由于這兩條帶存在于事件MON15985和DP50B(MON531)對照中，它們被認(rèn)為是與MON531事件相關(guān)的背景帶。MON15985長時(shí)間和短時(shí)間電泳各自產(chǎn)生了一條在DP50或DP50B泳道中不存在的大約為9.3kb的帶。這一結(jié)果表明棉花事件MON15985包括位于9.3ScaI限制片段上的一個(gè)整合的DNA片段。
用SphI消化與質(zhì)粒PV-GHBK11DNA混合的從MON15985、DP50B、DP50(非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?和DP50中提取的基因組DNA。用PV-GHBK11檢測印跡，它是用于轉(zhuǎn)化的線性DNA片段的來源質(zhì)粒。對DP50進(jìn)行長時(shí)間電泳，沒有產(chǎn)生可檢測的背景帶，在短時(shí)間電泳中，與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11產(chǎn)生了3.9kb和4.8kb的預(yù)期大小的帶；泳道5中的另一條弱的8.7kb的帶有可能是由于未消化的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的。對DP50B進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳產(chǎn)生了6.4kb、8.3kb和8.6kb的三條帶。由于這三條帶出現(xiàn)在MON15985和DP50對照中，它們被認(rèn)為是與MON531事件相關(guān)的背景帶。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，分別產(chǎn)生了不存在于DP50或DP50B泳道中的大約為2.3kb和3.5kb的兩條帶。由于酶SphI只能在轉(zhuǎn)化框內(nèi)裂解一次，這一結(jié)果表明MON15985含有一個(gè)拷貝的整合DNA，它能產(chǎn)生這兩個(gè)限制片段。
用NcoI消化來自測試、對照、以及與質(zhì)粒PV-GHBK11DNA混合的對照的DNA，以便釋放出Cry2Ab編碼區(qū)，并且評估其完整性。用完整長度的Cry2Ab編碼區(qū)檢測印跡。正如所預(yù)料的，對DP50非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行長時(shí)間電泳和對DP50B對照進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，沒有出現(xiàn)可檢測的雜交帶。在短時(shí)間電泳中，與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11產(chǎn)生了預(yù)期大小的大約1.9kb的帶，它相關(guān)完整的Cry2Ab編碼區(qū)。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，還產(chǎn)生了一個(gè)1.9kb的帶，它相當(dāng)于完整Cry2Ab編碼區(qū)的預(yù)期大小。這一結(jié)果證實(shí)了事件MON15985包括完整的Cry2Ab編碼區(qū)，沒有其他可檢測的片段。
用BamHI消化來自測試、對照、以及與質(zhì)粒PV-GHBK11DNA混合的對照的DNA，它能釋放出編碼Cry2Ab的完整的框(即，Cry2Ab編碼區(qū)、強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子、和NOS3’聚腺苷酸化序列)。
用完整長度Cry2Ab編碼區(qū)檢測印跡。對DP50非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行長時(shí)間電泳和對DP50B對照進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，沒有出現(xiàn)可檢測的雜交帶。在短時(shí)間電泳中，與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11產(chǎn)生了預(yù)期的3.2kb的帶，它相當(dāng)于編碼Cry2Ab的完整的框，對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，都產(chǎn)生了大約4.0kb的帶。這一結(jié)果表明轉(zhuǎn)化框的3’末端在整合到棉花基因組期間丟失了BamHI限制位點(diǎn)。通過PCR分析證實(shí)了以前通過基因組步移測定的插入-至-植物結(jié)合的3’序列。業(yè)已證實(shí)缺失轉(zhuǎn)化框3’末端的66個(gè)堿基對，包括BamHI位點(diǎn)。缺失的核苷酸不包括與編碼Cry2Ab的框相關(guān)的任何NOS3’聚腺苷酸化序列，而僅包括接頭DNA。以上結(jié)果證實(shí)，編碼Cry2Ab的框是完整的。沒有檢測到源于編碼Cry2Ab的部分框。
剝離上面所使用的印跡，并且用完整長度的強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子進(jìn)行再次檢測。對DP50進(jìn)行長時(shí)間電泳，沒有產(chǎn)生任何可檢測的背景帶。在短時(shí)間電泳中，與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11產(chǎn)生了預(yù)期大小的5.5和3.2kb的帶，沒有其他的可檢測帶。對DP50B進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了大約為4.4、5.3、7.5、9.4和22kb的五條帶。由于這些帶出現(xiàn)在事件MON15985和DP50B對照中，它們被認(rèn)為是與MON531事件相關(guān)的背景帶。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，都產(chǎn)生了一條大約為4.0kb的帶，這條帶不存在于DP50或DP50B泳道中。這一大小相當(dāng)于推測的編碼Cry2Ab的框的片段，得到了用Cry2Ab編碼區(qū)獲得的結(jié)果。推測在MON15985泳道上存在由于與和編碼UidA的框(GUS)相關(guān)的強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子雜交所產(chǎn)生的第二條帶，但是在測試泳道中沒有出現(xiàn)。下面披露的NOS3’聚腺苷酸化序列探針的結(jié)果證實(shí)了存在與UidA編碼框相關(guān)的強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子序列，但是沒有出現(xiàn)與4.4kb背景帶共同遷移的4.4kb的帶。沒有檢測到外部啟動(dòng)子。
再次剝離上面所使用的印跡，并且用完整長度NOS3’聚腺苷酸化序列再次檢測。對DP50進(jìn)行長時(shí)間電泳沒有產(chǎn)生任何可檢測的背景帶。對與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11進(jìn)行短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了5.5和3.2kb的預(yù)期大小的帶，沒有其他可檢測的帶。對DP50B進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了一條大約為1.2kb的帶。由于這條帶存在于事件MON15985和DP50B對照中，它被認(rèn)為是與MON531事件相關(guān)的背景帶。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，分別產(chǎn)生了大約為4.0和4.4kb的兩條帶，它們不存在于DP50或DP50B泳道中。4.0kb的帶相當(dāng)于預(yù)測的編碼Cry2Ab的框的片段，這一結(jié)果是根據(jù)上文所述推測的。在用強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子檢測的印跡上沒有出現(xiàn)4.4kb的帶，因?yàn)樗c出現(xiàn)在印跡上的4.4kb的背景帶共同遷移。該片段與uidA框相關(guān)。
以上結(jié)果證實(shí)，Cry2Ab編碼框是完整的，并且在BamHI位點(diǎn)和轉(zhuǎn)化框的3’末端之間缺失了66bp。其中不包括位于編碼Cry2Ab的框的3’末端的任何的NOS3’聚腺苷酸化序列。沒有檢測到源于編碼Cry2Ab的框的部分框。
用EcoRI和BglII消化從MON15985、DP50B、DP50(非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?和與質(zhì)粒PV-GHBK11 DNA混合的DP50中分離的基因組DNA，以便釋放出完整的uidA編碼區(qū)。用完整長度的uidA編碼區(qū)檢測印跡。對DP50非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行長時(shí)間電泳和對DP50B對照進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，沒有發(fā)現(xiàn)可檢測的雜交帶。對與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11進(jìn)行短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了預(yù)期的大約1.9kb的帶，它相當(dāng)于完整的uidA編碼區(qū)。對事件MON15985 DNA進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，還產(chǎn)生了1.9kb的帶，它相當(dāng)于完整的uidA編碼區(qū)的預(yù)期大小。這一事件證實(shí)MON15985包括完整的uidA編碼區(qū)，沒有其他可檢測的片段。
用BamHI和SphI消化來自測試和對照物質(zhì)的DNA以便釋放出完整的uidA框(即uidA編碼區(qū)、強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子、和NOS3’聚腺苷酸化序列)。用PstI消化質(zhì)粒PV-GHBK11之后摻入DP50短時(shí)間電泳的樣品中(NOS3’聚腺苷酸化序列的檢測印跡除外，其中，所述質(zhì)粒是用BamHI和SphI消化的)。這樣做是為了證實(shí)完整長度的uidA框的大小。
用完整長度的uidA編碼區(qū)檢測印跡。正如所預(yù)料的，對DP50非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行長時(shí)間電泳和對DP50B對照進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，沒有發(fā)現(xiàn)可檢測的雜交帶。對與DP50混合的PV-GHBK11進(jìn)行短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了預(yù)期的2.8kb的帶，它相當(dāng)于完整的uidA框。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，都產(chǎn)生了大約2.5kb的帶。這一結(jié)果表明uidA框的一部分是不存在的。通過PCR分析證實(shí)了以前通過基因組步移測定的5’插入片段-至-植物結(jié)合。以前業(yè)已證實(shí)，缺失了轉(zhuǎn)化框的5’部分的284bp。以上結(jié)果證實(shí)，uidA框缺少了5’啟動(dòng)子序列的大約260bp和源于所述質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的多接頭DNA的24bp。Odell等(1985)證實(shí)這種缺失不應(yīng)當(dāng)影響精確的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。用uidA編碼區(qū)探針沒有檢測到其他部分uidA框。剝離上面所使用的印跡，并且用完整長度的強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子再次檢測。對DP50進(jìn)行長時(shí)間電泳，沒有產(chǎn)生任何背景帶。對與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11進(jìn)行短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了預(yù)期大小的1.5和2.8kb的帶，沒有檢測到其他帶。對DP50B進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了大約為4.3、4.6、5.0、6.6和8.5kb的五條帶。由于這些帶存在于MON15985和DP50B對照中，它們被認(rèn)為是與MON531事件相關(guān)的背景帶。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，分別產(chǎn)生了兩條大約2.5和1.0kb的帶，這兩條帶不存在于DP50或DP50B泳道中。2.5kb的帶相當(dāng)于推測的uidA框的片段。1.0kb的帶由與編碼Cry2Ab的框相關(guān)的強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子所產(chǎn)生。沒有檢測到外部啟動(dòng)子。
用完整長度的NOS3’聚腺苷酸化序列檢測印跡，對DP50進(jìn)行長時(shí)間電泳沒有產(chǎn)生任何可檢測的電泳帶。對與DP50混合的質(zhì)粒PV-GHBK11進(jìn)行短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了預(yù)期大小的3.2和2.8kb的帶，沒有檢測到其他帶。對DP50B進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了一條大約為1.2kb的帶。由于這條帶存在于事件MON15985和DP50B對照中，它們被認(rèn)為是與MON531事件相關(guān)的背景帶。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，分別產(chǎn)生了兩條不存在于DP50或DP50B泳道中的大約為2.5和2.3kb的。2.5kb的帶相當(dāng)于推測的uidA框的片段。2.3kb的帶來自與編碼Cry2Ab的框相關(guān)的NOS3’聚腺苷酸化序列。
以上結(jié)果證實(shí)uidA框缺少了強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子5’末端的大約260bp，但是其他部分是完整的。用KpnI消化從事件MON15985、DP50B、DP50(非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?和與質(zhì)粒PV-GHBK11 DNA混合的DP50中分離的基因組DNA。用完整的主鏈序列檢測印跡。對DP50進(jìn)行長時(shí)間電泳，沒有發(fā)現(xiàn)可檢測的雜交帶。與DP50 DNA混合的質(zhì)粒PV-GHBK11產(chǎn)生了一條2.6kb的完整主鏈的預(yù)期大小的帶。對DP50B進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳，產(chǎn)生了一條大約為22kb的帶。由于這條帶存在于事件MON15985和DP50B對照中，它被認(rèn)為是與MON531事件相關(guān)的背景。對MON15985進(jìn)行長時(shí)間和短時(shí)間電泳包括22kb的背景帶，沒有其他的雜交。這一結(jié)果證實(shí)事件MON15985不包括任何可檢測的質(zhì)粒主鏈序列。
對基因組DNA進(jìn)行PCR，以便證實(shí)位于MON15985插入片段5’和3’末端的插入片段-至-植物結(jié)合序列。正如所預(yù)料的，在使用5’或3’引物組時(shí)，非轉(zhuǎn)基因樣品沒有產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。正如所預(yù)料的，被用作對照的DP50B樣品在使用另一種引物對時(shí)都沒有產(chǎn)生產(chǎn)物。在使用任一種引物組時(shí)，使用相同的結(jié)構(gòu)制備的并且選擇用于表達(dá)Cry2Ab、MON15813的不同事件都沒有產(chǎn)生產(chǎn)物。在使用5’末端引物對和3’末端引物對時(shí)，產(chǎn)生了正確大小的MON15985基因組DNA。這種PCR分析證實(shí)了MON15985的5’和3’邊界序列。
通過粒子加速技術(shù)使用含有編碼Cry2Ab和UidA的框的KpnI DNA片段生產(chǎn)出了抗昆蟲的棉花事件MON15985。MON15985事件包括位于9.3kb的ScaI片段上的單一的DNA插入片段。該插入片段包括一個(gè)完整拷貝的插入的框，該框缺少了啟動(dòng)UidA編碼序列表達(dá)的強(qiáng)化CaMV35S啟動(dòng)子的5’末端的大約260bp。通過PCR證實(shí)該插入片段和植物基因組的5’和3’結(jié)合序列，以及該插入片段的5’和3’末端的完整性。事件MON15985不包括任何可檢測的來自轉(zhuǎn)化事件的質(zhì)粒主鏈序列?；谟糜诒狙芯恐械拿?，插入包括Cry2Ab編碼序列的DNA插入片段不會(huì)改變Cry1Ac插入片段的限制形式。
因此，SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ IDNO17和SEQ ID NO18以及包括這些序列的序列可用于診斷能產(chǎn)生棉花事件MON15985的插入。參見圖1，以上序列被分別編號為2、4、6、9和11。
本說明書中所提到的所有文獻(xiàn)和專利申請，可以作為本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平的指標(biāo)。所有文獻(xiàn)和專利申請?jiān)诒疚闹幸韵嗤某潭仁兆鞅疚膮⒖?，就如同每一份文獻(xiàn)或?qū)＠暾埍粚ｉT和分別指明收作本文參考一樣。
盡管業(yè)已通過為了理解清楚的目的而提供了說明和實(shí)施例的方式對上述發(fā)明進(jìn)行了某種程度的詳細(xì)說明，顯而易見的是，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)可以進(jìn)行某些改變或改進(jìn)。
序列表序列表<110> 孟山都技術(shù)有限公司(Monsanto Technology LLC)S.A.胡伯(Huber，Scott A.)S.多赫爾蒂(Sean，Doherty C.)J.K.羅伯茨(Roberts，James K.)Z.W.沙普利(Shappley，Zacchary W.)<120> 棉花事件MON15985以及檢測它的組合物和方法<130> 38-21(52211)WOMOBT232P<140> US 60/297406<141> 2001-06-11<160> 36<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(20)<223> 包含插入DNA和染色體之間的接頭的序列<400> 1gcgtttctgg ttataatata20<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(20)<223> 包含插入DNA和染色體之間的接頭的序列<400> 2cttctctgct aagtgggtca20<210> 3<211> 1104<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(1104)<223> 全合成序列<400> 3agtacacaaa acaaaagcat catatgctga tttatttatt catagatgga gctcaagtca 60tagttaaata gcccgatact ttcctcgctc actatgagct attacagcat acattttagt120actacatact tattcagtaa aaagccctca aaattgaaga caaaggacgg gatccccggg180taccgagctc gaattcaggc ctctagatct cattattcct ccatcaagag aagctccacg240ctgtccacga tgaaggttcc ctcggtttca ccgatctcga tccacacttt 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misc_特征<222> (1)..(24)<223> 全合成<400> 29ctaaaacccg atcccctgct acac 24<210> 30<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(27)<223> 全合成<400> 30gactgaatgc ccacaggccg tcgagtt27<210> 31<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(26)<223> 全合成<400> 31cctgaactct ggcacccagt tcgacc 26<210> 32<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(31)<223> 全合成<400> 32ggtttctaca ggacggacca tggagatctg c 31<210> 33<211> 31<212> DNA<213> Artifical<220><221> misc_特征<222> (1)..(31)<223> 全合成<400> 33ccaactaaca tctcgccgct gtactgatag g 31<210> 34<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(19)<223> 全合成<400> 34tggttgcttc tgaggctac 19<210> 35<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(24)<223> 全合成<400> 35cttgtcattg gtgcagacag gttc 24<210> 36<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列<220><221> misc_特征<222> (1)..(24)<223> 全合成<400> 36gcttcaccat ctctccaatc cacg 2權(quán)利要求
1.一種業(yè)已交由美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為PTA-2516的抗昆蟲棉花植物或其部分，所述棉花植物的種子。
2.一種抗昆蟲的棉花植物或其部分，其中，具有選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ ID NO18的至少一種核苷酸序列的DNA構(gòu)成了該植物的基因組的一部分。
3.如權(quán)利要求1的抗昆蟲棉花植物的后代植物，其中，具有選自SEQID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQID NO18的至少一種核苷酸序列的DNA構(gòu)成了該植物的基因組的一部分。
4.如權(quán)利要求1、2或3的植物的種子。
5.一種生產(chǎn)抗昆蟲棉花植物的方法，包括用權(quán)利要求1、2或3中的任意一項(xiàng)的植物育種，并且通過分析選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ ID NO18的至少一種核苷酸序列篩選后代。
6.一種分離的DNA序列，包括SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17或SEQ ID NO18。
7.一種分離的DNA序列，包括SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31和SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35或SEQ ID NO36。
8.一對分離的DNA序列，各自包括至少10個(gè)核苷酸，并且在它們同時(shí)用于DNA擴(kuò)增方法中時(shí)能產(chǎn)生可以診斷MON15985的擴(kuò)增子。
9.如權(quán)利要求8的分離的DNA序列對，其中每一個(gè)序列選自SEQ IDNO11。
10.如權(quán)利要求8的分離的DNA序列對，其中每一個(gè)序列選自SEQ IDNO12。
11.一種檢測棉花組織中MON15985插入存在的方法(a)選擇各自包括源于SEQ ID NO11或SEQ ID NO12的至少10個(gè)核苷酸的引物對，其中，所述引物對的每一個(gè)成員位于用于診斷所述MON15985插入的序列的相反的一側(cè)；(b)讓所述棉花組織的樣品與所述引物對接觸；(c)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，并且分析擴(kuò)增子。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中，所述引物對選自SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31和SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35或SEQ ID NO36。
13.一種檢測棉花組織中MON15985插入的方法(a)讓所述棉花組織的樣品與一種聚腺苷酸化探針接觸，這種探針在嚴(yán)格雜交條件下與選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ ID NO18的一種或多種DNA序列雜交；(b)讓所述樣品和探針處于嚴(yán)格雜交條件下；和(c)分析所述探針的雜交。
14.一種DNA檢測試劑盒，包括能在嚴(yán)格雜交條件下與選自SEQ IDNO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ IDNO18的一種或多種DNA序列雜交的多核苷酸探針。
15.一種DNA檢測試劑盒，包括各自含有源于SEQ ID NO11和SEQID NO12的至少10個(gè)核苷酸的引物對，其中，每一種引物位于用于診斷MON15985插入的序列的相反一側(cè)。
16.如權(quán)利要求15的DNA檢測試劑盒，其中，所述引物對選自SEQID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ IDNO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35和SEQ ID NO36。
全文摘要
本發(fā)明提供了包括能產(chǎn)生對鱗翅目昆蟲危害有抗性的MON15985事件的棉花植物、棉花組織和棉花種子。還提供了根據(jù)插入棉花基因組中導(dǎo)致MON15985事件的重組結(jié)構(gòu)的DNA序列和/或插入位點(diǎn)旁側(cè)的基因組序列檢測MON15985事件存在的測定方法。
文檔編號C12N15/29GK1463175SQ02802047
公開日2003年12月24日 申請日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月11日
發(fā)明者S·A·胡伯, J·K·羅伯茨, Z·W·沙普利, S·多赫爾蒂 申請人:孟山都技術(shù)有限公司