專利名稱：利用大腸桿菌OmpF胞外生產(chǎn)靶蛋白的方法
背景技術(shù)：
由于胞外生產(chǎn)具有如上所述的若干優(yōu)點(diǎn)，因此，對(duì)胞外生產(chǎn)系統(tǒng)的各種各樣的研究一直在積極進(jìn)行以便在大腸桿菌中生產(chǎn)所需的外源蛋白。迄今為止所開發(fā)的胞外生產(chǎn)系統(tǒng)劃分成如下三類第一類胞外生產(chǎn)的方法是將分泌信號(hào)肽序列和所需的外源蛋白進(jìn)行重組。例如，Toksoy等采用分泌信號(hào)序列和麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合蛋白在細(xì)胞表面上生產(chǎn)TaqI蛋白，Lo等在大腸桿菌的細(xì)胞表面上生產(chǎn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶，以及Nagahari等通過(guò)重組OmpF分泌信號(hào)肽和來(lái)自O(shè)mpF N-端的8個(gè)氨基酸在大腸桿菌的細(xì)胞表面上生產(chǎn)β-內(nèi)啡肽。此外，Yamamoto等試圖通過(guò)利用OmpF分泌信號(hào)序列在胞外生產(chǎn)harvey鼠肉瘤病毒的p21蛋白。然而，其結(jié)果是p21未在細(xì)胞表面上產(chǎn)生而是積累在包含體中(參見ToksoyE.等，Biotechnology Techniques，13803-808，1999；Lo A.C.等，Appl.Environ.Microbiol.，542287-2292，1988；Nagahari等，EMBO J.，43589-3592，1985；和Yamamoto等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35615-621，1991)。第二類胞外生產(chǎn)的方法是將大腸桿菌的分泌蛋白和所需蛋白進(jìn)行重組。例如，Baneyx等將OmpA-TEM-β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白與大腸桿菌的TolAIII膜蛋白一起在細(xì)胞表面上生產(chǎn)，Robbens等利用kil基因來(lái)生產(chǎn)白介素-2，van der Wal等利用脂蛋白BRP(細(xì)菌素釋放蛋白)在細(xì)胞表面上生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，以及Aristidou等利用BRP通過(guò)向培養(yǎng)基中加入甘氨酸來(lái)增加胞外生產(chǎn)的產(chǎn)量(參見Baneyx F.和Eugene W.M.，Protein Expr.Purif.，1413-22，1998；RobbensJ.等，Protein Expr.Purif.，6481-486，1995；van der Wal F.J.等，Appl.Environ.Microbiol.，64392-398，1998；和Aristidou A.A.等，Biotechnol.Lett.，15331-336，1993)。第三類胞外生產(chǎn)的方法是借助于無(wú)外膜大腸桿菌，即大腸桿菌的L-型菌株，這是一種僅有細(xì)胞內(nèi)膜而沒(méi)有細(xì)胞外膜和周質(zhì)的突變株。在L-型菌株培養(yǎng)物中，胞外生產(chǎn)外源蛋白比前述方法更為簡(jiǎn)單，因?yàn)楸磉_(dá)蛋白僅通過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸就可分泌到培養(yǎng)基中。例如，Kujau等利用一種L-型突變株RV308菌株在細(xì)胞表面生產(chǎn)微型抗體(miniAb)(參見Kajau M.J.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，4951-58，1998)。
如上所述，已開發(fā)出多種方法可在大腸桿菌的細(xì)胞表面上生產(chǎn)所需的外源蛋白。但是，大多數(shù)這些現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)證明尚不令人滿意，原因在于一些外源蛋白被細(xì)菌蛋白酶部分降解，從而使得純化工藝復(fù)雜化，并使高密度細(xì)胞培養(yǎng)成為不可能。此外，利用大腸桿菌的L-型菌株進(jìn)行胞外生產(chǎn)有缺點(diǎn)，即由于對(duì)環(huán)境壓力的抵抗力較弱以及生命周期較短，該菌株不適用于高密度培養(yǎng)。
在這種情況下，非常有必要來(lái)探索和開發(fā)一種替代方法，用于在大腸桿菌的細(xì)胞表面上胞外生產(chǎn)所需的外源蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明人已努力開發(fā)出一種新型方法，用于在大腸桿菌的細(xì)胞表面胞外生產(chǎn)所需的外源蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)融合蛋白可被有效分泌到轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體的重組大腸桿菌的培養(yǎng)基中，該表達(dá)載體包含編碼大腸桿菌的外膜蛋白F(OmpF)和所需蛋白的基因，并且外源蛋白可以簡(jiǎn)單的方式通過(guò)從融合蛋白中除去OmpF而被純化。
所以，本發(fā)明的主要目的是提供一種含有編碼大腸桿菌的OmpF和所需外源蛋白的基因的表達(dá)載體。
本發(fā)明的其他目的是提供一種轉(zhuǎn)化有該表達(dá)載體的微生物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種通過(guò)培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的微生物來(lái)胞外生產(chǎn)所需蛋白的方法。
圖2表示表達(dá)載體pOmpF6的基因圖譜。
圖3表示重組表達(dá)載體pSKOmpFKm的基因圖譜。
圖4表示重組表達(dá)載體pEDOmpF3的基因圖譜。
圖5表示重組表達(dá)載體pTrcOmpF4的基因圖譜。
圖6表示重組表達(dá)載體pOmpF6βE的構(gòu)建示意圖以及基因圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明的表達(dá)載體含有氨芐青霉素抗性基因、OmpF啟動(dòng)子以及OmpF基因。
采用表達(dá)載體胞外生產(chǎn)所需蛋白的方法包括下列步驟將編碼被蛋白水解酶識(shí)別和切割的寡聚肽的基因和編碼所需蛋白的基因?qū)氲奖磉_(dá)載體pOmpF6中以構(gòu)建胞外生產(chǎn)所需蛋白的重組表達(dá)載體；用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏OmpF基因的宿主微生物以獲得轉(zhuǎn)化的微生物；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物以便從培養(yǎng)物中生產(chǎn)OmpF-融合蛋白；以及用蛋白水解酶處理融合蛋白以獲得所需的蛋白?？捎玫牡鞍姿饷赴ㄒ蜃覺(jué)a、腸激酶(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)、genenase(His-Tyr或Tyr-His)、IgA蛋白酶(Pro/Ser-Arg/Thr-Pro-Pro-Thr/Ser/Ala-Pro)、內(nèi)含肽(intein)、凝血酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及枯草桿菌蛋白酶或纖溶酶，其中優(yōu)選因子X(jué)a?？捎玫乃璧鞍装膳cOmpF融合的肽、酶和抗體，其中優(yōu)選β-內(nèi)啡肽。埃希氏菌屬(Escheria sp.)或沙門氏菌屬(Samonella sp.)是優(yōu)選的宿主微生物，但不限于此兩種菌屬。
本發(fā)明進(jìn)一步描述在如下。
本發(fā)明人培養(yǎng)了六種大腸桿菌菌株(BL21(DE3)、HB101、JM101、MC4100、XL1-Blue和W3110)，通過(guò)SDS-PAGE分析了從各個(gè)培養(yǎng)物中分離的外膜蛋白，發(fā)現(xiàn)OmpF蛋白在BL21(DE3)菌株中是過(guò)表達(dá)的。本發(fā)明人構(gòu)建了表達(dá)載體pOmpF6，其由大腸桿菌的OmpF基因、OmpF啟動(dòng)子和氨芐青霉素抗性基因組成。以BL21(DE3)的基因組DNA為模板，使用特異引物，通過(guò)PCR方法克隆了OmpF基因和OmpF啟動(dòng)子。大腸桿菌BL101菌株用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子命名為E.coliBL101/pOmpF6(大腸桿菌BL101/pOmpF6)，并于2001年6月1日保藏于國(guó)際保藏單位韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC，52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)，保藏號(hào)KCTC1026BP。
然后，本發(fā)明人構(gòu)建了重組表達(dá)載體pOmpF6βE作為一個(gè)例子來(lái)說(shuō)明利用表達(dá)載體pOmpF6胞外生產(chǎn)融合蛋白的方法。重組表達(dá)載體含有編碼β-內(nèi)啡肽的cDNA、編碼OmpF蛋白的基因、OmpF啟動(dòng)子、編碼被因子X(jué)a識(shí)別和切割的寡聚肽的基因以及氨芐青霉素抗性基因，所述寡聚肽插入在OmpF蛋白和β-內(nèi)啡肽之間。本發(fā)明人用該重組表達(dá)載體pOmpF6 β E轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株(NovagenCo.，U.S.A.)，培養(yǎng)該重組大腸桿菌菌株以在細(xì)胞表面上生產(chǎn)OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白，并從培養(yǎng)基中回收融合蛋白。回收的融合蛋白首先通過(guò)陰離子交換層析純化，然后利用因子X(jué)a從融合蛋白中去除OmpF蛋白以回收β-內(nèi)啡肽蛋白。
由于融合蛋白被大腸桿菌的蛋白水解酶降解，因此在常規(guī)細(xì)胞表面展示系統(tǒng)中進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)際上是不可能的。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明，所需蛋白可以通過(guò)比常規(guī)方法更簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行胞外生產(chǎn)方法如下利用OmpF啟動(dòng)子進(jìn)行組成型表達(dá)，OmpF融合蛋白的分泌性生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)開始，并且隨著細(xì)胞濃度增加，蛋白分泌性生產(chǎn)的量也持續(xù)增加。所以，通過(guò)高密度細(xì)胞培養(yǎng)可大量生產(chǎn)所需蛋白。
下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步闡述，這些實(shí)施例不應(yīng)被看做是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1篩選過(guò)表達(dá)OmpF的大腸桿菌菌株挑選了六株通常用于生產(chǎn)重組蛋白的大腸桿菌菌株，從中純化出外膜蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE相互之間進(jìn)行比較。如所選的六株大腸桿菌菌株為大腸桿菌BL21(DE3)[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)攜帶T7 RNA聚合酶基因的原噬菌體](Novagen Co.，U.S.A.)、HB101[F-hsd20(rk-，mk-)recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2rpsL20(str)xyll-5 mtl-1 supE44λ-](New England Biolabs，U.S.A.)、JM101[supE thi-1Δ(lac-proAB)[F′traD36 proAB lacIqZ ΔM15]](Stratagene Co.，U.S.A)、MC4100[F-araD139Δ(argF-lac)U169rpsL150(strr)relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR](Stratagene Co.，U.S.A.)、XL1-Blue[SupE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1lacF(proAB+lacIq lac ZM15 Tn10(tetr))](Stratagene Co.，U.S.A.)和W3110[衍生自K-12，λ-，F(xiàn)-，原氧型的](KCTC 2223)。各個(gè)大腸桿菌菌株在50ml的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 5g/L)中，37℃培養(yǎng)。
從各個(gè)培養(yǎng)物中收集細(xì)菌細(xì)胞，并通過(guò)下列步驟將外膜蛋白分級(jí)分離首先在4℃下以3500×g將3ml培養(yǎng)物離心5分鐘以收集細(xì)菌細(xì)胞。收集的細(xì)菌細(xì)胞用1ml的Na2HPO4(pH 7.2)緩沖液洗滌，4℃下以3500×g再次離心5分鐘，然后懸浮于0.5ml的Na2HPO4(pH 7.2)緩沖液中。細(xì)菌細(xì)胞懸浮液用超聲波處理，接著在室溫下以10,000×g離心2分鐘以去除細(xì)胞碎片。上清液在室溫下以10,000×g離心30分鐘，將沉淀懸浮于0.5ml含有0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸鈉的10MNa2HPO4(pH 7.2)緩沖液中，從而獲得含有外膜蛋白的組分。
將該組分在37℃下溫育30分鐘，并在4℃下以10,000×g離心30分鐘。將沉淀用10mM Na2HPO4(pH 7.2)緩沖液洗滌并懸浮于50μl的PBS(0.247M NaCl、0.041M Na2HPO4、0.047M KH2PO4、0.005M KCl、pH 7.4)中，從而獲得用于蛋白分析的外膜蛋白級(jí)分樣品(參見Puenete，J.L.等，Gene，1561-9，1995)。各個(gè)級(jí)分樣品用SDS-PAGE分析，結(jié)果表明大腸桿菌BL21(DE3)菌株生產(chǎn)大量的OmpF蛋白。實(shí)施例2制備缺乏OmpF基因的大腸桿菌利用噬菌體的red操縱子(exo-beta-gam)將大腸桿菌BL21(DE3)的OmpF基因刪除，方法如下首先，以噬菌體DNA為模板以及引物1和引物2的引物對(duì)進(jìn)行PCR，引物15′-CGCGCCATGGATATTAATACTGAAACTGAGATCAAGC-3′(SEQ IDNO.1)和引物25′-CGGGATCCTCATCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3′(SEQ ID NO.2)。在1.2％瓊脂糖凝膠上通過(guò)電泳將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分離出來(lái)，獲得2.2kb的DNA片段。該DNA片段用NcoI和BamHI限制性酶消化。含有trc啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia BiotechCo.，U.S.A.)也用NcoI和BamHI限制性酶消化，并連接到用同樣限制性酶消化的PCR產(chǎn)物上從而構(gòu)建重組表達(dá)載體pTrcEBG。然后，用表達(dá)載體pTrcEBG轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，并將轉(zhuǎn)化子在含有50μg/L氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選(參見

圖1)。圖1表示重組表達(dá)載體pTrcEBG的基因圖譜。用重組表達(dá)載體pTrcEBG轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，并將轉(zhuǎn)化子在含有50μg/L氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選。將轉(zhuǎn)化子在500ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到O.D.600達(dá)到0.3，然后向培養(yǎng)基中加入IPTG(終濃度1mM)以誘導(dǎo)表達(dá)exo-beta-gam基因。培養(yǎng)1小時(shí)后，離心收集細(xì)菌細(xì)胞，并用250ml的去離子蒸餾水洗滌。離心后將收集的細(xì)胞懸浮于10ml的10％(w/v)甘油中并儲(chǔ)存于-80℃下。
另一方面，以大腸桿菌BL21(DE3)菌株的基因組DNA為模板以及引物3和引物4的引物對(duì)進(jìn)行PCR以獲得2，160bp的DNA片段，引物35′-CGGAATTCTGGATTATACCGACGCAG-3′(SEQ ID NO.3)和引物45′-GCGGATCCTTAGAACTGGTAAACGATAC-3′(SEQ IDNO.4)。該DNA片段用EcoRI和BamHI限制性酶消化并插入到pBluescript SK(-)(Stratagene Cloning Systems，U.S.A.)中以構(gòu)建表達(dá)載體pOmpF6。接著，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，并將轉(zhuǎn)化子在含有50μg/L氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選(參見圖2)。圖2表示表達(dá)載體pOmpF6的基因圖譜。此外，以表達(dá)載體pACY117(New England Biolabs，U.S.A.)為模板以及引物5和引物6的引物對(duì)進(jìn)行PCR以獲得940bp的DNA片段，引物55′-CGCTGCAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3′(SEQ ID NO.5)和引物65′-GCCTGCAGGCCACGTTGTGTCCTCAAA-3′(SEQ IDNO.6)。將該DNA片段用PstI限制性酶消化，并連接到PstI-消化的質(zhì)粒pOmpF6中以構(gòu)建重組表達(dá)載體pSKOmpFKm。然后，用重組表達(dá)載體pSKOmpFKm轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，從而獲得含有卡那霉素抗性基因的重組表達(dá)載體pSKOpFKm(參見圖3)。圖3表示重組表達(dá)載體pSKOmpFKm的基因圖譜。正如圖3所示，重組表達(dá)載體pSKOmpFKm含有OmpF基因和啟動(dòng)子，它們衍生自大腸桿菌BL21(DE3)菌株，并將卡那霉素抗性基因插在OmpF啟動(dòng)子和OmpF基因的5′-末端之間，通過(guò)此插入，OmpF基因不表達(dá)。以重組表達(dá)載體pSKOmpFKm作為模板以及引物3和引物4進(jìn)行PCR以獲得含有OmpF基因、其啟動(dòng)子及插入它們當(dāng)中的卡那霉素抗性基因的DNA片段。將此DNA片段導(dǎo)入到轉(zhuǎn)化有pTrcEBG的大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，并在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。為了從轉(zhuǎn)化子中除去表達(dá)載體pTrcEBG，將轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)2天共5次，然后在含有卡那霉素的LB平板上涂布和溫育以篩選在此平板上不生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。將篩選到的大腸桿菌菌株的基因組DNA純化以確認(rèn)卡那霉素抗性基因是否插入在OmpF啟動(dòng)子和OmpF基因之間，方法如下以純化的基因組DNA為模板以及引物3和引物8的引物對(duì)進(jìn)行PCR，引物85′-GATCGGAATTGATTTGAGTTTCC-3′(SEQ ID NO.8)，并將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。然后，以純化的基因組DNA為模板以及引物7和引物9的引物對(duì)進(jìn)行PCR，引物75′-CCACAGCAACGGTGTCGTCTG-3′(SEQ ID NO.7)和引物95′-ATCTTTATCTTTGTAGCACTTTCAC-3′(SEQ ID NO.9)，并將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。兩個(gè)DNA片段的測(cè)序結(jié)果表明卡那霉素抗性基因位于OmpF啟動(dòng)子和OmpF基因之間。該轉(zhuǎn)化菌株命名為“E.coliBL101”。實(shí)施例3開發(fā)OmpF基因的表達(dá)系統(tǒng)為了在實(shí)施例2中所制備的E.coli BL101重組菌株中表達(dá)OmpF蛋白，分別構(gòu)建了三種重組表達(dá)載體。
第一種是采用強(qiáng)誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建OmpF基因的表達(dá)載體。利用大腸桿菌BL21(DE3)的基因組DNA作模板以及引物4和引物10進(jìn)行PCR，引物105′-GCGAATTCATATGATGAAGCGCAATATTCTG-3′(SEQ ID NO.1 0)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用NdeI和BamHI消化，并克隆到表達(dá)載體pET21c(Novagen，U.S.A.)中以構(gòu)建重組表達(dá)載體pEDOmpF3。用pEDOmpF3轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，由此獲得了重組表達(dá)載體pEDOmpF3(參見圖4)。圖4表示重組表達(dá)載體pEDOmpF3的基因圖譜。
第二種是采用誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子Trc啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建OmpF基因的表達(dá)載體。利用大腸桿菌BL21(DE3)菌株的基因組DNA作模板以及引物4和引物11進(jìn)行PCR，引物115′-GCGAATTCCATGGTGAAGCGCAATATTCTGGCAG-3′(SEQ IDNO.10)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用NdeI和BamHI消化，并克隆到表達(dá)載體pTrc99A中以構(gòu)建重組表達(dá)載體pTrcOmpF4。用pTrcOmpF4轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，由此獲得了重組表達(dá)載體pTrcOmpF4(參見圖5)。圖5表示重組表達(dá)載體pTrcOmpF4的基因圖譜。
第三種是將實(shí)施例2中構(gòu)建的含有OmpF啟動(dòng)子的表達(dá)載體pOmpF6用作OmpF基因的表達(dá)載體。
將上述三種重組表達(dá)載體(pEDOmpF3、pTrcOmpF4和pOmpF6)轉(zhuǎn)化實(shí)施例2中制備的E.coli BL101菌株。將轉(zhuǎn)化的重組菌株在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選。為了挑選最有效的在細(xì)胞表面上生產(chǎn)OmpF蛋白的分泌系統(tǒng)，將各個(gè)轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌在37C下培養(yǎng)在50ml的R/2培養(yǎng)基{(NH4)2HPO42g/L、KH2PO46.75g/L、檸檬酸0.85g/L、MgSO4.7H2O 0.7g/L、5M HCl/L、FeSO4.7H2O10g/L、ZnSO4.7H2O 2.25g/L、CuSO4.5H2O 1g/L、MnSO4.5H2O 0.5g/L、Na2B4O7.10H2O 0.23g/L、CaCl2.2H2O 2g/L、(NH4)6MO7O240.1g/L、葡萄糖10g/L}中。
當(dāng)含有pEDOmpF3和pTrcOmpF4的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物O.D.600達(dá)到0.7時(shí)，加入IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷)至終濃度1M以誘導(dǎo)OmpF基因的表達(dá)。E.coli BL21(DE3)和E.coli BL101也在同樣條件下培養(yǎng)作為對(duì)照組。采用實(shí)施例1中所述的方法，從各個(gè)菌株的培養(yǎng)物中制備外膜蛋白組分，并通過(guò)SDS-PAGE分析以比較OmpF蛋白的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)化有pOmpF6載體的E.coli BL101在外膜中產(chǎn)生和積累OmpF蛋白，其表達(dá)水平與親本菌株E.coli BL21(DE3)的表達(dá)水平相近。上述結(jié)果清楚地表明，OmpF啟動(dòng)子對(duì)于表達(dá)OmpF-融合蛋白是最優(yōu)選的。
本發(fā)明人將轉(zhuǎn)化有重組表達(dá)載體pOmpF6的E.coli BL101命名為“大腸桿菌BL101/pOmpF6”，并于2001年6月1日保藏在國(guó)際保藏單位韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC，#52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)，保藏號(hào)KCTC 1026BP。實(shí)施例4構(gòu)建OmpF-β-內(nèi)啡肽表達(dá)載體β-內(nèi)啡肽蛋白由31個(gè)氨基酸組成，編碼β-內(nèi)啡肽的基因由93個(gè)核苷酸組成(參見Takahashi H.等，F(xiàn)EBS Lett.，13597-102，1981)。
為了制備編碼β-內(nèi)啡肽的基因，分別合成了引物125′-ACCGCCATACCTTCCCTCGATGAACTGGTAAACGATA-3′(SEQ IDNO.12)，引物135′-GGAAGGTATGGCGGTTTCATGACCAGCGAAAAAAGCCAGAC-3′(SEQ ID NO.13)，引物145′-CGCGTTTTTAAACAGGGTCACCAGCGGGGTCTGGCTTTTTTCGC-3′(SEQ ID NO.14)，引物155′-CCCTGTTTAAAAACGCGATCATCAAAAACGCGTATAAAAAAG-3′(SEQ ID NO.15)和引物165′-GCGGATCCCTATTATTCGCCTTTTTTATACGCGTTTTTG-3′(SEQ IDNO.16)，并將它們用于PCR。以大腸桿菌BL21(DE3)的基因組DNA作為模板以及引物10和引物12作為引物也進(jìn)行PCR。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增獲得的兩個(gè)DNA片段與引物10和引物16混合，并再次進(jìn)行PCR從而獲得所需的PCR片段，該P(yáng)CR片段含有編碼被因子X(jué)a識(shí)別和切割的四個(gè)氨基酸的基因和與OmpF基因融合的β-內(nèi)啡肽基因。將該P(yáng)CR片段用BglII和XbaI消化并連接到表達(dá)載體pOmpF6中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pOmpF6βE。用pOmpF6βE轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue菌株，由此獲得重組表達(dá)載體pOmpF6βE(圖6)。圖6表示重組表達(dá)載體pOmpF6βE的構(gòu)建示意圖和基因圖譜。重組表達(dá)載體pOmpF6βE中與OmpF基因融合的β-內(nèi)啡肽基因的核苷酸序列為5′-TATGGCGGTTTCATGACCAGCGAAAAAAGCCAGACCCCGCTGGTGACCCTGTTTAAAAACGCGATCATCAAAAACGCGTATAAAAAAGGCGAATAA-3′(SEQ ID NO.18)，其表達(dá)的多肽為Tyr Gly Gly Phe MetAla Ser Glu Lys Ser Gln Ala Pro Leu Val Ala Leu Phe Lys Asn Ala Ile IleLys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu終止(SEQ ID NO.17)。
用重組表達(dá)載體pOmpF6βE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL101菌株，并將轉(zhuǎn)化子在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選。實(shí)施例5胞外生產(chǎn)OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白將實(shí)施例4中制備的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子接種到1.8L的R/2培養(yǎng)基中，并在37℃下進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。底物由700g/L葡萄糖和20g/LMgSO4.7H2O組成，當(dāng)培養(yǎng)基的pH升高到6.88以上時(shí)，以10ml/分鐘的速度將此底物流加到培養(yǎng)基中以維持葡萄糖濃度為0.7g/L，通過(guò)空氣和氧自動(dòng)供給以維持溶氧為40％(v/v)。培養(yǎng)17.5小時(shí)后，600nm處測(cè)定培養(yǎng)物的光密度為150.5，細(xì)胞干重為54.1g/L。為了測(cè)定融合蛋白的量，定期收集培養(yǎng)基，離心，并通過(guò)電泳分析上清液，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中有40kDa的OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白積累，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白的積累量也增加。OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白的終濃度為4.64g/L，這相當(dāng)于培養(yǎng)基中總蛋白的45％。實(shí)施例6純化胞外生產(chǎn)的β-內(nèi)啡肽將實(shí)施例5培養(yǎng)基中積累的OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白進(jìn)行純化首先，將50ml培養(yǎng)基離心以除去細(xì)菌細(xì)胞。然后，通過(guò)陰離子交換層析從上清液中純化OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白，所用陰離子交換樹脂為Q2-柱(BIO-RAD Co.，U.S.A.)，流動(dòng)相為50mM Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液，流速為1ml/分鐘。OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白用從0到1M NaCl的線性梯度洗脫。NaCl濃度為0.45M處洗脫的OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白的總量為89.1mg。通過(guò)透析將NaCl從OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白中除去。為了從OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白中除去OmpF蛋白，將因子X(jué)a和OmpF-β-內(nèi)啡肽融合蛋白以1∶200(w/w)的比例混合，并在23℃下溫育12小時(shí)。然后，通過(guò)反相HPLC純化β-內(nèi)啡肽融合蛋白，所用HPLC柱為Microsorb-MV C18柱(4.6×250mm，Varian，U.S.A.)，流動(dòng)相為0.1％(v/v)TFA(三氟乙酸)溶液，流速為1ml/分鐘。蛋白洗脫液在280nm處用紫外檢測(cè)器監(jiān)測(cè)(參見表1)。
表1β-內(nèi)啡肽的純化
如上表1中所示，通過(guò)HPLC技術(shù)純化了2.8mg β-內(nèi)啡肽。進(jìn)一步，純化的β-內(nèi)啡肽的N-端測(cè)序結(jié)果表明其氨基酸序列為Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys，這對(duì)應(yīng)于β-內(nèi)啡肽的N-端的氨基酸。
如上文所清楚地說(shuō)明和演示，本發(fā)明提供了含有編碼OmpF和所需蛋白的基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化有該表達(dá)載體的大腸桿菌以及利用該微生物胞外生產(chǎn)所需蛋白的方法。本發(fā)明的重組表達(dá)載體含有氨芐青霉素抗性基因、OmpF啟動(dòng)子以及OmpF基因。根據(jù)本發(fā)明，靶蛋白可以下列方式通過(guò)比常規(guī)方法更簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行胞外生產(chǎn)，其意義在于由于采用OmpF啟動(dòng)子進(jìn)行組成型表達(dá)，因此OmpF融合蛋白的分泌性生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)開始，并且隨著細(xì)胞濃度增加，蛋白分泌性生產(chǎn)的量也持續(xù)增加。所以，通過(guò)細(xì)胞高密度培養(yǎng)可大量生產(chǎn)所需蛋白。
正如特定實(shí)施方案所展示和描述的那樣，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員來(lái)說(shuō)顯然可以對(duì)本發(fā)明做出某些改變和修飾，而并不超出在此所闡述的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或范圍。
有關(guān)保藏的微生物或其它生物材料的說(shuō)明(PCT細(xì)則13之二)
表PCT/RO/134(1998年7月)
序列表<110>韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院(Korea Advanced Institute Science and Technology)<120>利用大腸桿菌OmpF胞外生產(chǎn)靶蛋白的方法(A Method for Extracellular Producing Target Proteins Employing OmpF in E.coli)<130>SCT030927-47<160>18<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1cgcgccatgg atattaatac tgaaactgag atcaagc37<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cgggatcctc atcgccattg ctccccaaat ac 32<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3cggaattctg gattataccg acgcag 26<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4gcggatcctt agaactggta aacgatac28<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5cgctgcagtt agaaaaactc atcgagcatc 30<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gcctgcaggc cacgttgtgt cctcaaa 27<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ccacagcaac ggtgtcgtct g21<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8gatcggaatt gatttgagtt tcc 23<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9atctttatct ttgtagcact ttcac25<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10gcgaattcat atgatgaagc gcaatattct g 31<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11gcgaattcca tggtgaagcg caatattctg gcag 34<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12accgccatac cttccctcga tgaactggta aacgata 37<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ggaaggtatg gcggtttcat gaccagcgaa aaaagccaga c 41<210>14<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14cgcgttttta aacagggtca ccagcggggt ctggcttttt tcgc44<210>15<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15ccctgtttaa aaacgcgatc atcaaaaacg cgtataaaaa ag 42<210>16<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16gcggatccct attattcgcc ttttttatac gcgtttttg 39<210>17<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>融合蛋白<400>17Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr1 5 10 15Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu20 25 30<210>18<211>96<212>DNA<213>人工序列<220><223>融合蛋白cDNA<400>18tatggcggtt tcatgaccag cgaaaaaagc cagaccccgc tggtgaccct gtttaaaaac60gcgatcatca aaaacgcgta taaaaaaggc gaataa 9權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體pOmpF6，其包括氨芐青霉素抗性基因、OmpF啟動(dòng)子以及OmpF基因，其基因圖譜如圖2表示。
2.大腸桿菌(Escherichia coli)BL101/pOmpF6(KCTC 1026BP)，其轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體pOmpF6。
3.一種利用表達(dá)載體pOmpF6胞外生產(chǎn)所需蛋白的方法，其包括下列步驟(i)將編碼被蛋白水解酶識(shí)別和切割的寡聚肽的基因和編碼所需蛋白的基因?qū)氲奖磉_(dá)載體pOmpF6中以構(gòu)建胞外生產(chǎn)所需蛋白的重組表達(dá)載體；(ii)用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏OmpF基因的宿主微生物以獲得轉(zhuǎn)化的微生物；(iii)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物以便從培養(yǎng)物中生產(chǎn)OmpF-融合的蛋白；以及(iv)用蛋白水解酶處理融合蛋白并獲得所需蛋白。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中蛋白水解酶是因子X(jué)a、腸激酶、genenase、IgA蛋白酶、內(nèi)含肽、凝血酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或血纖酶。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所需蛋白為可與OmpF融合的肽、酶或抗體。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中所需蛋白為β-內(nèi)啡肽。
7.權(quán)利要求3所述的方法，其中重組表達(dá)載體為pOmpF6βE。
8.權(quán)利要求3所述的方法，其中宿主微生物為埃希氏菌屬(Escherichia sp.)或沙門氏菌屬(Samonella sp.)。
全文摘要
本發(fā)明提供包含編碼大腸桿菌OmpF蛋白基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化有該表達(dá)載體的大腸桿菌以及采用該微生物胞外生產(chǎn)靶蛋白的方法。本發(fā)明的重組表達(dá)載體含有氨芐青霉素抗性基因、OmpF啟動(dòng)子以及OmpF基因。根據(jù)本發(fā)明，靶蛋白可以通過(guò)比常規(guī)方法更簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行胞外生產(chǎn)，其意義在于由于采用OmpF啟動(dòng)子進(jìn)行組成型表達(dá)，因此OmpF融合蛋白的分泌性生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)開始，并且隨著細(xì)胞濃度增加，蛋白分泌性生產(chǎn)的量也持續(xù)增加。所以，通過(guò)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)可大量生產(chǎn)靶蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1466628SQ02802738
公開日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2002年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月14日
發(fā)明者李相燁, 丁基峻 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院