專利名稱：脫氧mugineic酸合酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在mugineic酸的生物合成過程中將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶，該mugineic酸參與植物體內(nèi)的鐵-獲得性機制；一種編碼該酶的基因；和一種由于其中轉(zhuǎn)入了上述基因而對鐵-缺乏具有高耐受性的植物。本發(fā)明還涉及用于構(gòu)建一種對鐵-缺乏具有高耐受性的植物的酶試劑盒和基因試劑盒，所述試劑盒包含用于生物合成mugineic酸的酶或編碼該酶的基因，所述mugineic酸參與植物體內(nèi)的鐵-獲得性機制。
背景技術(shù)：
鐵是地表中含量第四豐富的元素而且是植物的必需元素。在有氧存在的普通需氧狀況下，鐵以不溶性三價鐵的形式存在，而植物不能吸收不溶性形式的鐵。特別是，在富含石灰石的地方，土壤成為堿性土壤，多種植物不能吸收非溶解形式的鐵并且由于鐵的缺乏而枯萎。
通過溶解非溶解形式的三價鐵而使植物獲得了吸收鐵的機制從而能夠?qū)χ参锏谋匦柙?鐵加以吸收和利用。已知被稱作“途徑I”和“途徑II”的兩種方法是被用來溶解非溶解形式的三價鐵并對其進(jìn)行吸收的機制。
在被稱作“途徑I”的機制中，通過由根部釋放質(zhì)子而降低假根球體(rizosphere)中的pH來溶解非溶解形式的Fe3+，并通過根表面上的鐵還原酶來將Fe3+還原成Fe2+，接著二價鐵的轉(zhuǎn)運蛋白將二價鐵轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)。這種鐵-獲得機制被雙子葉植物和單子葉植物所采用而不被禾本科植物所采用。另一方面，禾本科植物通過高度靈活的機制吸收鐵，在該機制中被統(tǒng)稱為植物鐵載體的天然鐵螯合劑mugineic酸由根部分泌出來，土壤中的非溶解形式的三價鐵以“鐵-mugineic酸”螯合物的形式被溶解從而以螯合物的形式被根部吸收。禾本科植物的這種獲得鐵的機制被稱作“途徑II”。
mugineic酸(MA)是由下式表示的化合物 其具有含氮原子的4員環(huán)，并且該mugineic酸及其五種衍生物已經(jīng)被確認(rèn)為是天然的鐵螯合劑而被統(tǒng)稱為與三價鐵形成螯合物的植物鐵載體。該五種衍生物分別是脫氧mugineic酸(DMA)，該脫氧mugineic酸(DMA)是mugineic酸的前體并且不含羥基；燕麥酸(avenicacid)(AVA)，該燕麥酸(AVA)是一種開環(huán)形式的脫氧mugineic酸(DMA)；3-羥基mugineic酸(HMA)和3-表-羥基mugineic酸((表)-HMA)，其中羥基與mugineic酸的氮雜環(huán)丁烷環(huán)連接；以及disticomic酸，該disticomic酸是一種開環(huán)形式的3-羥基mugineic酸。


圖1中列出了mugineic酸及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式以及它們的生物合成途徑。首先，通過S-腺苷甲硫氨酸合酶由甲硫氨酸生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。然后，通過煙酰胺合酶結(jié)合三個分子的S-腺苷甲硫氨酸從而產(chǎn)生一個分子的煙酰胺(NA)。煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶將所生成的煙酰胺轉(zhuǎn)化成3’-酮體，然后，某一還原酶將3’-酮體轉(zhuǎn)化成2’-脫氧mugineic酸(DMA)。2’-脫氧mugineic酸(DMA)被進(jìn)一步水解成包括mugineic酸(MA)在內(nèi)的其它mugineic酸衍生物(Mori和Nishizawa，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.)，281081-1092，1987；Shojima等，生物金屬(Biol.Metals)，2142-145。1989；Shojima等，植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)，931497-1503，1990)。
Mugineic酸的合成與分泌能夠被鐵-缺乏狀態(tài)強烈地誘導(dǎo)。存在6種已知的mugineic酸。mugineic酸的類型和分泌量隨著禾本科植物種類不同而不同，而且可以肯定這種差異造成在禾本科植物種類之間存在著對鐵-缺乏的耐受力的差異。
水稻、玉米和小麥分泌DMA，該DMA是mugineic酸的生物合成途徑中的第一種mugineic酸。大麥分泌DMA、MA以及其它羥基化的(表)-HMA。黑麥分泌DMA、MA和HMA。燕麥分泌DMA和燕麥酸(VAV)。迄今為止已經(jīng)驗證了具有“途徑II”的鐵-獲得機制的所有禾本科植物都分泌DMA，因此認(rèn)為這些植物具備生物合成DMA的途徑。
在mugineic酸的生物合成途徑中，煙酰胺合酶(NAS)催化由SAM生成NA的反應(yīng)的活性以及煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)催化由NA生成酮體的反應(yīng)的活性通過鐵-缺乏處理而被強烈誘導(dǎo)(Kanazaw等，ed J.Abadia，37-41，1995)。這兩種酶被從鐵-缺乏大麥的根部純化出來而且它們的基因也得到克隆(Takahashi等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，121947-956，1999；Higuchi等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，119471-479，1999)。
IDS3是一種參與將DMA轉(zhuǎn)化為MA的蛋白質(zhì)。通過鐵缺乏處理Ids3基因能夠進(jìn)行最高的表達(dá)(Takahashi等，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant CellPhysiol.)，34401-410，1993)。在禾本科植物當(dāng)中，在大麥和黑麥中檢測到了IDS3蛋白及其在生物合成途徑中的下游中間體，所述大麥和黑麥分泌包括MA在內(nèi)的mugineic酸。在實驗過程中，分別采用了其中將大麥的每一條染色體插入到小麥的基因組的小麥-大麥染色體插入突變株，僅在插入了大麥的第四條染色體的植物中分泌MA，僅在插入了大麥的第四條染色體的突變株中表達(dá)IDS3，因此產(chǎn)生這樣一種假設(shè)，即IDS3可能是mugineic酸合酶。而且最近，通過對具有轉(zhuǎn)入的Ids3基因的被轉(zhuǎn)化水稻分泌的mugineic酸進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了DMA外，還分泌MA。通過綜合考慮，得出了IDS3是mugineic酸合酶的結(jié)論。
而且，還分離出了SAM合酶的基因，該SAM合酶能夠由甲硫氨酸產(chǎn)生SAM(Takizawa等，植物核酸雜志(J.Plant Nu)19(8-9)1189-1200，1996)，而且已經(jīng)闡明了在由甲硫氨酸生物合成mugineic酸(MA)的途徑中所涉及到的幾乎所有的酶。然而，對于由酮體合成DMA的酶來說，盡管已經(jīng)知道這種酶可能是NADH-或NADPH-依賴性還原酶，但是既沒有純化和分離出該酶的蛋白也沒有純化和分離出該蛋白的基因。
本發(fā)明的目的在于分離和鑒定催化酮體產(chǎn)生DMA的還原酶及其基因，以便闡明在mugineic酸的生物合成過程中所涉及到的酶的完整圖譜，從而提供將鐵-獲得機制引進(jìn)植物體內(nèi)的方法。
順便提一句，植物體內(nèi)分泌mugineic酸的表觀特征包括近晝夜節(jié)律。日出后大麥開始分泌mugineic酸，經(jīng)過3至5個小時的高峰后分泌減弱，日落后停止分泌(Takagi等，植物核酸雜志(J.Plant Nu)，469-477，1984)。由于鐵-缺乏，觀察到大麥根部的精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，觀察到根部末端細(xì)胞中的特定顆粒數(shù)目和尺寸有所增加。由于脂質(zhì)體存在于表面上以及膜比高爾基體的薄，所以所述顆粒似乎來源于具有粗糙表面的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rER)。這種顆粒被發(fā)現(xiàn)存在于皮質(zhì)細(xì)胞、表皮細(xì)胞和根冠細(xì)胞中。日出前所述顆粒呈現(xiàn)一種膨脹狀態(tài)，這時分泌mugineic酸，隨著mugineic酸的分泌，顆?？s小。因此，推測所述顆粒是mugineic酸的合成及貯存場所(Takizawa等，植物核酸雜志(J.Plant Nu)15695-713，1987)。
因此，通過利用免疫染色法和源自水母的綠色熒光蛋白(GFP)的瞬時測定方法來觀察mugineic酸生物合成途徑中的相關(guān)蛋白(NAS，NAAT)的定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有蛋白都定位于特定的顆粒中，這些特定顆粒在鐵缺乏的大麥根部中增加(數(shù)據(jù)沒有公布)。而且，通過對催化酮體產(chǎn)生DMA的還原酶進(jìn)行鑒定以及對它的定位進(jìn)行檢測能夠更加清楚地證明所述顆粒是mugineic酸的合成場所。
而且近來，已經(jīng)對被轉(zhuǎn)化的水稻進(jìn)行了分析，該水稻具有被轉(zhuǎn)入的naat-A。在分析過程中，發(fā)現(xiàn)某些水稻在鐵-缺乏的土壤中能夠生長而沒有患上缺綠癥并且mugineic酸的分泌仍有所增加。這被認(rèn)為是由于通過引入了naat-A而增加了酮體合成的量以及由于內(nèi)源性還原酶而產(chǎn)生了DMA。然而，在這種情況下，DMA和mugineic酸的產(chǎn)量受到內(nèi)源性還原酶的量的限制。因此確信當(dāng)naat-A和還原酶的基因被同時轉(zhuǎn)入水稻時，所構(gòu)建的水稻對鐵-缺乏的耐受性比只具有被轉(zhuǎn)移naat-A的轉(zhuǎn)化水稻對鐵-缺乏的耐受性高。
因此，為了構(gòu)建對鐵-缺乏具有更高耐受性的植物，需要測定出生物合成mugineic酸所需要的一組酶的完整圖譜，在鐵獲得機制中所述mugineic酸是被統(tǒng)稱為植物鐵載體的鐵螯合劑。
本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的在于證實生物合成mugineic酸所需要的一組酶的完整圖譜，在鐵獲得機制中所述mugineic酸是被統(tǒng)稱為植物鐵載體的鐵螯合劑，另一個目的在于分離和鑒定用于上述目的的催化酮體產(chǎn)生DMA的還原酶及其基因。
本發(fā)明的目的還在于證實在植物體內(nèi)生物合成mugineic酸所需要的一組酶的完整圖譜以及構(gòu)建對鐵-缺乏具有更高耐受性的植物。
附圖的簡述圖1表示禾本科植物體內(nèi)的mugineic酸及其衍生物的生物合成途徑。
圖2是顯示通過利用簡并引物的PCR而獲得的三個擴增片段的電泳圖譜的照片。
圖3是顯示對鐵-缺乏組和鐵-充足組中的大麥芽部分和大麥根部分(2個星期)進(jìn)行諾慎(Northern)印跡分析的結(jié)果的電泳圖譜照片。1，2和3是分別利用200，500和700bp PCR片段所得到的結(jié)果的電泳圖譜照片。
圖4表示通過HPLC對本發(fā)明還原酶的活性進(jìn)行測定的結(jié)果，其中將還原酶的活性值測定為通過HPLC測定的DMA的量。1，2，3，4，5，6和7分別表示只有DMA，還原酶基因1、還原酶基因2，還原酶基因5，還原酶基因7，NAAT+NaBH4和載體對照(PYH23)的情況。
圖5是為了檢測本發(fā)明還原酶基因?qū)﹁F缺乏的響應(yīng)隨時間發(fā)生變化而進(jìn)行諾慎印跡分析所得結(jié)果的照片。在進(jìn)行鐵-缺乏處理后的第0、2、4、7、14天以及在鐵-缺乏處 14天后重新補鐵后的第5天對大麥根部進(jìn)行實驗。1和2分別表示還原酶1和2(5)的情況。
圖6表示本發(fā)明還原酶基因1的cDNA堿基序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。
圖7表示本發(fā)明還原酶基因2的cDNA堿基序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。
圖8表示本發(fā)明還原酶基因5的cDNA堿基序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。
圖9表示本發(fā)明的還原酶基因1、還原酶基因2(5)和水稻的谷胱甘肽還原酶的氨基酸序列之間進(jìn)行的比較。
圖10是本發(fā)明的還原酶基因和谷胱甘肽還原酶基因針對金屬應(yīng)力所作出的響應(yīng)的照片。在圖10中，DMAS和GR分別表示本發(fā)明的還原酶基因和谷胱甘肽還原酶基因。R和S分別表示根部和芽(葉、莖等)部分。
圖11表示當(dāng)檢測本發(fā)明的還原酶基因和谷胱甘肽還原酶基因針對金屬應(yīng)力所作出的響應(yīng)時所使用的探針區(qū)域的氨基酸序列。在圖11中，DMAS1和DMAS2表示本發(fā)明的還原酶基因，而GR表示谷胱甘肽還原酶基因。而且在圖11中，用細(xì)框圈起來的頂部代表觀察到GR對金屬作出響應(yīng)時所使用的探針區(qū)域，從頂部至底部用寬框圈起來的部分代表觀察到DMAS對金屬作出響應(yīng)時所使用的探針區(qū)域。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及一種將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶以及編碼該酶的基因。
本發(fā)明還涉及其中轉(zhuǎn)入了編碼還原酶的基因的轉(zhuǎn)化體和植物，所述還原酶是將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶。
而且，本發(fā)明涉及用于生物合成作為鐵螯合劑的mugineic酸的酶試劑盒以及用于構(gòu)建對鐵-缺乏具有高耐受性的植物的基因試劑盒，所述酶試劑盒包含將煙酰胺的酮體還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶和至少另外一種用于生物合成作為鐵螯合劑的mugineic酸的酶，所述基因試劑盒包含編碼這些酶的基因。
mugineic酸的生物合成途徑中所涉及到的多種酶已經(jīng)被成功地純化出來或者其基因已經(jīng)被成功地分離出來。然而，還沒有成功地純化和分離出催化由酮體至DMA的反應(yīng)的酶以及編碼該酶的基因。因此，本發(fā)明人試圖分離出編碼這樣一種酶的基因，該酶在mugineic酸的生物合成途徑中催化由酮體至DMA的反應(yīng)。盡管10年前，Shoiima通過攝取實驗已經(jīng)報道了這種基因是一種NAD(P)H-依賴性酶(Shojima等，植物生理學(xué)(Plant Physiol)，931497-1503，1990)，但該研究卻沒有實現(xiàn)純化和分離所述蛋白及其基因的目的。
當(dāng)從DMA的分泌量進(jìn)行推導(dǎo)時，發(fā)現(xiàn)水稻分泌內(nèi)源性還原酶的量比大麥低，因此嘗試了由大麥來進(jìn)行分離。
首先，尋找目的還原酶所歸屬的酶家族，結(jié)果表明醛-酮還原酶基因超家族(Seery等，J.Mol.Evol.，46139-146，1998)最合適，該超家族廣泛包括了NADH-和NADPH-依賴性還原酶。然后，在該家族中相對保守的氨基酸序列的基礎(chǔ)上選擇以下兩個區(qū)域。
5’-YTIGAYTAYBTIGAC-3’(5’-端)5’-RTGRCAYTCIAYYTG-3’(3’-端)在編碼所述兩個區(qū)域序列的堿基序列的基礎(chǔ)上設(shè)計簡并引物。
以源自處于鐵-缺乏狀態(tài)的大麥(Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka 1號)根部的cDNA文庫為模板、利用上述這些引物進(jìn)行PCR。
結(jié)果，得到三個PCR片段(200，500和700bp)(圖2)。圖2是顯示所獲得的三個PCR片段的電泳圖譜照片。在圖2中，右側(cè)的帶從底部起分別表示200、500和700bp的片段。
為了檢測所得到的PCR片段是否為目的基因，通過諾慎印跡法分析在鐵-缺乏(-Fe)和鐵-充足(+Fe)的大麥根部和芽端中進(jìn)行的基因表達(dá)。結(jié)果見圖3中的照片。圖3中的左上方的照片1表示使用200bp PCR片段的情況，圖3中的右上下方照片2表示使用500bp PCR片段的情況，以及位于中下部的照片3表示使用700bp PCR片段的情況。在每個照片中，左側(cè)兩個泳道表示得自根部的結(jié)果而右側(cè)的兩個泳道表示得自芽端的結(jié)果。對于每個根部和芽端，-Fe表示鐵-缺乏組(兩個星期)而+Fe表示鐵-充足組。
當(dāng)將500和700bp PCR片段作為探針時，在鐵-缺乏組和鐵-充足組中沒有觀察到基因的表達(dá)。另一方面，當(dāng)將200bp PCR片段作為探針時，檢測到了在所有條件下都表達(dá)的電泳帶以及僅在鐵-缺乏組的根部中表達(dá)的電泳帶(參見圖3-1)。僅在鐵-缺乏的大麥根部中表達(dá)了在mugineic酸的生物合成途徑中催化由酮體產(chǎn)生DMA的途徑之前和之后反應(yīng)的所有酶的基因。從這一結(jié)果來看，目的基因似乎非常有可能僅在鐵-缺乏狀態(tài)下的大麥根部進(jìn)行表達(dá)。因此，可以確定200bp PCR片段可能含有目的基因的堿基片段，并且分離出含有該堿基序列的cDNA克隆。
通過以PCR片段中的一個片段作為探針進(jìn)行菌落雜交來進(jìn)行cDNA克隆的分離，所述PCR片段中的一個片段是通過諾慎印跡分析在鐵-缺乏狀態(tài)下檢測到的。將鐵-缺乏大麥根cDNA文庫涂布到八個含有氨芐青霉素的LB平板上從而使得克隆密度達(dá)到25000至50000個克隆/平板。進(jìn)行第二次和第三次篩選從而使得第一次篩選中的陽性克隆成為單一克隆。結(jié)果，獲得了四個陽性克隆(分別被稱作1，2，5和7)。對這樣獲得的cDNA文庫進(jìn)行測序。這些基因的堿基序列都顯示出與水稻的谷胱甘肽還原酶(Kaminaka等，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant CellPhysiol)，391269-1280，1998)的高度同源性。
接著，利用通過以這些cDNA轉(zhuǎn)化酵母而獲得的蛋白質(zhì)來檢測由這些cDNA克隆編碼的酶的活性。由于作為底物的酮體是一種不穩(wěn)定的化合物，因此將作為前體的煙酰胺用作起始物。該檢測過程按照NAAT活性測定方法通過Takahashi法來進(jìn)行(Takahashi等，植物生理學(xué)(Plant Physiol)，121947-956，1999)。也就是說在有NAAT存在的條件下，煙酰胺反應(yīng)生成酮體，然后將由酵母轉(zhuǎn)化體表達(dá)的蛋白質(zhì)代替NaBH4用于化學(xué)還原反應(yīng)中。將由不含插入物的空載體(pYH23)表達(dá)的蛋白質(zhì)用作對照。通過利用HPLC檢測DMA的量來測定活性值。
HPLC的結(jié)果如圖4所示。圖4-1是僅有DMA的情況并且顯示了標(biāo)準(zhǔn)DMA的保留時間。圖4-2是還原酶基因1被表達(dá)的情況。圖4-3是還原酶基因2被表達(dá)的情況。圖4-4是還原酶基因5被表達(dá)的情況。圖4-5是還原酶基因7被表達(dá)的情況。圖4-6是由NaBH4催化的化學(xué)還原的情況。圖4-7是對照載體(pYH23)被表達(dá)的情況。
其中將DMA的量比僅使用載體本身情況下(圖4-7)的量多的那些結(jié)果確定為陽性。結(jié)果，在由除還原酶基因7(圖4-5)之外的cDNA編碼的所有蛋白中檢測到了DMA。其中，發(fā)現(xiàn)由還原酶基因2(圖4-3)和5(圖4-4)的cDNA編碼的蛋白的活性最高。
然后，在其中檢測到了DMA活性的1，2和5的情況下，觀察了針對鐵-缺乏的響應(yīng)。
在得到的具有DMA活性的cDNA克隆中，通過諾慎印跡法分析了在對鐵-缺乏的響應(yīng)隨時間變化的過程中還原酶基因1，2和5的表達(dá)?？偣彩褂昧肆鶄€RNA樣品，也就是說，即將處于鐵-缺乏狀態(tài)的大麥根部(0天)，處于鐵-缺乏狀態(tài)后第2、第4、第7和第14天的大麥根部，以及鐵-缺乏第14天后補充了5天鐵的大麥根部。在進(jìn)行RNA電泳和成像的同時利用PCR片段進(jìn)行諾慎印跡分析。
結(jié)果如圖5的照片所示。圖5-1是利用還原酶基因1的情況，圖5-2是利用還原酶基因2的情況。圖5中的0d，、2d，、4d、7d、14d和5d分別表示鐵-缺乏處理后第0、第2、第4、第7、第14天和鐵-缺乏處理14天后再施加鐵后的第5天的大麥根部。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有基因的表達(dá)受鐵-缺乏狀態(tài)的誘導(dǎo)而且發(fā)現(xiàn)通過補鐵降低了表達(dá)(圖5-5d)。
然后，對具有DMA活性的還原酶基因1、2和5的cDNA克隆進(jìn)行測序。結(jié)果，還原酶基因2和5的可讀框(ORF)部分具有相同的堿基序列。還原酶基因1的ORF在5’端比其它兩個基因的ORF多出315個堿基對。還原酶基因1和2的氨基酸序列分別如序列表中的1號和2號序列所示。并且，還原酶基因1、2和5的堿基序列分別如序列表中的3號、4號和5號序列所示。而且，還原酶基因1、2和5的堿基序列和推測氨基酸序列分別如圖6、7和8所示。
然后，檢測在所測堿基序列的基礎(chǔ)上推導(dǎo)出的氨基酸序列的信息。每個氨基酸序列與水稻中的谷胱甘肽還原酶具有89.5％的同源性(參見圖9)。在圖9中，上行表示還原酶基因1的氨基酸序列，中間行表示還原酶基因2或5的氨基酸序列，以及下行表示水稻的谷胱甘肽還原酶的氨基酸序列。
然后，通過PSORT預(yù)測所得到的蛋白質(zhì)的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)由還原酶基因1編碼的蛋白質(zhì)可能定位在質(zhì)膜上，而由還原酶基因2(5)編碼的蛋白質(zhì)可能定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)上。另一方面，與由本發(fā)明的還原酶基因編碼的氨基酸序列具有89.3％的最高同源性的水稻谷胱甘肽還原酶最可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。
本發(fā)明的還原酶及其基因與NAD(P)H依賴性還原酶家族的成員不具同源性而與谷胱甘肽還原酶具有最高的同源性，基于這一點設(shè)計出了簡并引物。通過其氨基酸序列預(yù)測出基因2(或5)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。這一點以及mugineic酸的生物合成途徑中所涉及NAS和NAAT來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粗糙表面上的顆粒中的事實表明被分離的基因2或5很可能就是目的基因，其中所述顆粒是處于鐵-缺乏狀態(tài)的大麥根部所特有的。而且，在針對鐵-缺乏的響應(yīng)隨時間發(fā)生變化的過程中，這些基因的表達(dá)受鐵-缺乏處理的誘導(dǎo)并且通過補充鐵而被降低，從而表明這些基因?qū)﹁F具有響應(yīng)能力。
總之，本發(fā)明的基因是編碼還原酶的基因，該還原酶在mugineic酸的生物合成途徑中催化由酮體生成DMA的反應(yīng)，而且可以得出這樣的結(jié)論，即未來可能會研制出一種對鐵-缺乏具有高耐受性的新型水稻品種。
因此，本發(fā)明的還原酶是將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶，并且本發(fā)明已經(jīng)以被稱作“途徑II”的植物鐵-獲得性機制的方式闡明了生物合成mugineic酸的整套酶，所述mugineic酸是天然的鐵-螯合劑，這種鐵-螯合劑被統(tǒng)稱為植物鐵載體。
由此，植物能夠獲得被稱作“途徑II”的植物鐵-獲得性機制并且由于將這些酶或編碼這些酶的基因引進(jìn)了植物體內(nèi)而使得這種植物對鐵-缺乏的耐受性得到了提高。
由于NAAT是用于生物合成mugineic酸的酶組中的一種酶，所以通過引進(jìn)naat基因組已經(jīng)制備出轉(zhuǎn)化水稻。NAAT是在mugineic酸的生物合成途徑中催化由NA生成酮體的反應(yīng)的酶，而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過引進(jìn)該基因植物能夠在鐵-缺乏的土壤中生長而不會患上缺綠癥。因此認(rèn)為在僅以NAAT基因轉(zhuǎn)化的水稻體內(nèi)，由鐵-缺乏誘導(dǎo)的naat基因的表達(dá)產(chǎn)生了過量的酮體以及過量的酮體被內(nèi)源性還原酶轉(zhuǎn)化成DMA，結(jié)果使得水稻能夠在鐵-缺乏的土壤中生長而不會患上缺綠癥。
然而，由DMA的分泌量估測出的水稻體內(nèi)的內(nèi)源性還原酶的量比大麥體內(nèi)的少，因此由naat基因誘導(dǎo)表達(dá)而過量產(chǎn)生的酮體很有可能不能被有效地轉(zhuǎn)化成DMA?；谶@一觀點，預(yù)計被本發(fā)明的基因和naat基因組共同轉(zhuǎn)化的水稻可通過還原酶將由NAAT過量產(chǎn)生的酮體有效地轉(zhuǎn)化成DMA而且對鐵-缺乏的耐受性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)比僅被naat基因組轉(zhuǎn)化的水稻高，其中所述本發(fā)明的基因編碼催化由酮體生成DMA的反應(yīng)的酶。根據(jù)這一觀點，可以得出這樣的結(jié)論即分離出催化由酮體生成DMA的反應(yīng)的還原酶是非常重要的。
本發(fā)明提供了在mugineic酸的生物合成過程中將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶，所述mugineic酸在植物體內(nèi)參與鐵獲得性機制。本發(fā)明的還原酶優(yōu)選地是一種具有序列表中的1號或2號序列所示的氨基酸序列。只要所述酶蛋白在mugineic酸的生物合成過程中具有將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的活性，那么在該氨基酸序列中，就可以用其它氨基酸取代一個或多個氨基酸，可以缺失一個或多個氨基酸，并且還可以插入一個或多個氨基酸。而且，本發(fā)明的還原酶可以具有同時發(fā)生了取代、缺失和插入的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了編碼上述本發(fā)明還原酶的基因。本發(fā)明基因的優(yōu)選堿基序列由序列表中的3號、4號或5號序列所示的堿基序列組成，但并不只限于所示的堿基序列。這些堿基序列可被修飾成易表達(dá)的序列，條件是被修飾后仍能夠編碼上述的氨基酸序列。本發(fā)明的基因還包括由與這些堿基序列互補的序列組成的基因，以及能夠在嚴(yán)格條件下與所述堿基序列進(jìn)行雜交的堿基序列。
另外，由本發(fā)明的部分基因組成的堿基序列也被包括在本發(fā)明中。這些部分序列也可被用作PCR的引物，并且本發(fā)明包括用于此方法的部分序列。
本發(fā)明的基因還含有一個其上游序列所需的啟動子。這種啟動子并不限于下面的序列表，適于植物的啟動子可根據(jù)本發(fā)明基因所要轉(zhuǎn)入的植物來進(jìn)行選擇。
本發(fā)明提供了被本發(fā)明的上述基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。多種細(xì)胞，例如諸如大腸桿菌這樣的細(xì)菌細(xì)胞、動物細(xì)胞如倉鼠細(xì)胞、植物細(xì)胞和酵母細(xì)胞可被用作本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的還原酶可以由這些轉(zhuǎn)化體來表達(dá)和產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了引進(jìn)了上述本發(fā)明基因的植物。由于mugineic酸的生物合成中所涉及的一組酶的完整圖譜已經(jīng)通過闡明本發(fā)明的還原酶而得到說明，因此編碼這組酶的一套基因有可能被轉(zhuǎn)入不具有“途徑II”的植物中從而使得該植物被重新賦予通過“途徑II”的鐵獲得性機制，其中所述“途徑II”以mugineic酸作為鐵獲得性機制的鐵螯合劑。因此，引進(jìn)了本發(fā)明基因的植物不限于具有通過“途徑II”的鐵獲得性機制的禾本科植物，但是引進(jìn)禾本科植物是優(yōu)選的。
盡管可以預(yù)測出即使單引進(jìn)本發(fā)明的基因也能夠提高對鐵-缺乏的耐受性，但是對鐵-缺乏的耐受性得到進(jìn)一步提高的植物可以通過同時優(yōu)選引進(jìn)編碼其它酶的基因，優(yōu)選地是naat來得到。
如上所述，如圖1所示的mugineic酸的生物合成途徑中的所有酶已經(jīng)通過闡明本發(fā)明的還原酶而得到明確，而且這些酶的完整圖譜也得到證實。因此，本發(fā)明提供了用于“途徑II”中生物合成mugineic酸的一組酶。即，本發(fā)明提供了用于生物合成鐵螯合劑-mugineic酸的酶試劑盒，該試劑盒由將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的“S-腺苷甲硫氨酸合酶”、將S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成煙酰胺(NA)的“煙酰胺合酶”、將煙酰胺轉(zhuǎn)化成酮體的“煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)”和本發(fā)明的“還原酶”以及將酮體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成mugineic酸的“IDS3”等組成。本發(fā)明的酶試劑盒以本發(fā)明的還原酶為一種必需酶而且還含有至少一種其它酶，并且優(yōu)選地是含有能夠完成由甲硫氨酸進(jìn)行生物合成的所有酶的試劑盒。利用本發(fā)明的酶試劑盒，可以由甲硫氨酸輕易地生產(chǎn)出mugineic酸或其生物合成途徑的產(chǎn)物。
為了構(gòu)建對鐵-缺乏具有高耐受性的植物，本發(fā)明提供了包含編碼上述一組酶中的每種酶的基因的基因試劑盒。對鐵-缺乏具有高耐受性的植物可以通過將這些基因引進(jìn)植物體內(nèi)來構(gòu)建。具有由甲硫氨酸形成mugineic酸的高生物合成能力的植物可以通過引進(jìn)編碼所述上述酶中的每種酶的基因來構(gòu)建。
被引進(jìn)植物體內(nèi)的酶基因優(yōu)選地是一種含有其中將被引進(jìn)基因的植物的啟動子區(qū)域的基因。并且，其中引進(jìn)了每種基因的植物不限于，但優(yōu)選地是禾本科植物。
實施例下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
實施例1大麥的栽培將大麥種子(Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka 1號)放置在經(jīng)蒸餾水潤濕的紙巾上，通過采用鋁箔進(jìn)行避光，于室溫下保持3天以便誘發(fā)生芽。將幼苗移到懸浮在水培溶液中的網(wǎng)上并利用氣泵進(jìn)行通氣培養(yǎng)。當(dāng)長出第二片葉子后，將植物移到20L的容器中來繼續(xù)進(jìn)行水培培養(yǎng)。
水培溶液的組成是[7×10-4M K2SO4，1×10-4M KCl，1×10-4MKH2PO4，2×10-3M Ca(NO3)2，5×10-4M MgSO4，1×10-5M H2BO3，5×10-7M MnSO4，5×10-7M ZnSO4，2×10-7M CuSO4，1×10-8M(NH4)6MoO24，1.5×10-4M Fe-EDTA]。
每天用1N HCl將水培溶液的pH值調(diào)到約5.5。采用蒸餾水配制水培溶液并且每周換一次。當(dāng)長出第四片葉子后，用蒸餾水沖洗根部來去除粘附上的鐵，然后將植物移到不含鐵的水培溶液中從而開始進(jìn)行鐵-缺乏處理，并且一直栽培到指定的時間周期。
實施例2簡并引物的設(shè)計以及利用這些引物的PCR首先，通過尋找目的還原酶所屬的酶家族來開始實驗。結(jié)果表明醛-酮還原酶基因超家族最合適，該超家族廣泛包括了NADH-和NADPH-依賴性還原酶。然后，在該家族中相對保守的氨基酸序列的基礎(chǔ)上選擇出兩個區(qū)域。在取代所述兩個區(qū)域序列的堿基序列的基礎(chǔ)上設(shè)計簡并引物。合成該簡并引物。
LDYV/LD....5’-YTIGAYTAYBTIGAC-3’(5’-端)
QV/IECH....5’-RTGRCAYTCIAYYTG-3’(3’-端)以來源于處于鐵-缺乏狀態(tài)的大麥根部的cDNA文庫為模板利用這些引物進(jìn)行PCR。
結(jié)果，得到三個片段，即200，500和700bp PCR片段。結(jié)果如圖2所示。
實施例3對在處于鐵-缺乏狀態(tài)的大麥根部中被誘導(dǎo)的PCR片段進(jìn)行的選擇目的顯然是在處于鐵-缺乏狀態(tài)的大麥根部中誘導(dǎo)由PCR擴增的片段，因此將諾慎印跡分析用作選擇這些片段的手段。從源自經(jīng)過2周鐵缺乏處理的大麥根部和芽部的那些樣品中提取RNA。用于提取RNA的方法如下所述。
將利用液氮粉碎的植物溶解在提取緩沖液(150mM LiCl，5mMEDTA，pH8，5％SDS，800mM Tris-HCl，pH9)中。接著進(jìn)行兩次苯酚-氯仿提取。向上清液中加入0.3M醋酸鈉和一份體積的異丙醇并進(jìn)行離心。將沉淀溶解在3M的氯化鋰中和冰浴10分鐘，然后離心。用80％的乙醇沖洗沉淀，然后將沉淀溶解在蒸餾水中。在-80℃下進(jìn)行保存。將得到的RNA在1.2％的瓊脂糖凝膠上跑電泳后印跡到膜上(Hybond-N+，Amersham-Pharmacia)。
利用PCR片段通過隨機引物DNA標(biāo)記試劑盒2.0版(Takara)制備雜交探針。利用Church雜交溶液(0.5M Church磷酸鹽緩沖液，1mMEDTA，7％(w/v)SDS)在65℃下雜交18小時。在65℃下用Church雜交洗滌溶液(40mM Church磷酸鹽緩沖液，1％(w/v)SDS)將膜沖洗兩次，一共10分鐘。沖洗后，用莎倫(Saran)包裝膜將上述膜包起來并過夜曝光給置于暗盒中的IP顯像膠片(富士膠片)。利用BAS2000圖象分析儀進(jìn)行圖象處理(富士膠片)。
結(jié)果如圖3所示。圖3-1，3-2和3-3分別是利用200、500和700bp的PCR片段的實例。
實施例4篩選以通過諾慎印跡分析檢測到的那些在鐵-缺乏根部中被誘導(dǎo)的cDNA作為探針，通過菌落雜交來分離cDNA克隆。將鐵-缺乏大麥根部cDNA文庫涂布到8個含有氨芐青霉素LB平板上從而使得克隆密度達(dá)到25000至50000個克隆/平板。進(jìn)行第二輪和第三輪篩選從而使得第一輪篩選中的陽性克隆變成單個克隆。對最終得到的cDNA克隆進(jìn)行測序。
實施例5通過活性測定進(jìn)行選擇檢測通過篩選得到的cDNA克隆的酶活性。將通過所述cDNA克隆轉(zhuǎn)化酵母獲得的蛋白質(zhì)作為使用的蛋白。由于mugineic酸生物合成途徑中的酮體是一種不穩(wěn)定的化合物，所以將其前體煙酰胺用作起始物。按照NAAT活性測定方法通過Takahashi法進(jìn)行(Takahashi等，植物生理學(xué)(Plant Physiol)，121947-956，1999)檢測。通過NAAT催化，煙酰胺反應(yīng)生成酮體，然后由所得到的cDNA克隆表達(dá)的蛋白質(zhì)代替NaBH4的化學(xué)還原反應(yīng)。所用蛋白是通過將酵母粉碎后利用超游離C3-LTK(Japan Millipore Co.)截留分子量為30kDa或更大分子量的蛋白來獲得的。所述酶反應(yīng)是在截留杯上進(jìn)行的。用于還原酶反應(yīng)的緩沖液是0.1M Tris，0.1mM EDTA，10mM NAD(P)H，pH8.5。將由不含插入物的載體(pYH23)表達(dá)的蛋白作為對照。通過利用HPLC檢測DMA的量來確定活性值。
結(jié)果如圖4所示。圖4-1僅僅是DMA的情況并顯示了標(biāo)準(zhǔn)DMA的保留時間。圖4-2是還原酶基因1被表達(dá)的情況。圖4-3是還原酶基因2被表達(dá)的情況。圖4-4是還原酶基因5被表達(dá)的情況。圖4-5是還原酶基因7被表達(dá)的情況。圖4-6是通過NaBH4進(jìn)行的化學(xué)還原反應(yīng)的情況。圖4-7是對照載體(PYH23)被表達(dá)的情況。
將所觀察到的其中DMA含量高于僅僅有載體存在的情況下的DMA含量的那些克隆確定為陽性克隆。結(jié)果，在由除還原酶基因7(圖4-5)以外的其它cDNA編碼的所有蛋白中檢測到了DMA。其中，發(fā)現(xiàn)由還原酶基因2(圖4-3)和5(圖4-4)的cDNA編碼的蛋白的活性最高。
實施例6諾慎印跡分析在所得到的cDNA克隆中，通過諾慎印跡分析那些具有DMA活性的克隆針對Fe-缺乏所產(chǎn)生的應(yīng)答隨時間發(fā)生的變化?？偣彩褂昧?個RNA樣品，這6個樣品就是發(fā)生Fe-缺乏前的大麥根部(0天)，發(fā)生Fe-缺乏后第2、第4、第7和第14天時的大麥根部，和發(fā)生Fe-缺乏14天后又補充了5天鐵的大麥根部。按照對PCR片段進(jìn)行諾慎印跡分析的方式進(jìn)行RNA的電泳和圖象分析。
結(jié)果如圖5所示。圖5-1是采用還原酶基因1的情況，圖5-2是采用還原酶基因2的情況。圖5中的符號0d，2d，4d，7d，14d和5d分別表示鐵-缺乏處理后的第0、第2、第4、第7、第14天時的大麥根部和Fe-缺乏處理14天后又重新施加5天鐵后的大麥根部。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所有基因的表達(dá)隨著鐵-缺乏的發(fā)生而被誘導(dǎo)，并且表達(dá)由于施加鐵而被減弱(圖5-5d)。
實施例7本發(fā)明的還原酶基因和谷胱甘肽還原酶基因的表達(dá)對金屬應(yīng)力的應(yīng)答當(dāng)對水稻中的還原酶基因(DMAS1和DMAS2)的堿基序列與水稻中的谷胱甘肽還原酶基因(GR)的堿基序列進(jìn)行比較時，發(fā)現(xiàn)前者屬于后者的一部分。因此，GR本身有可能被Fe-缺乏所誘導(dǎo)而其編碼的產(chǎn)物谷胱甘肽還原酶本身具有DMAS活性。為了研究這種可能性，在鐵和鋅的金屬應(yīng)力下、以屬于GR的5’上游序列的堿基序列為探針，通過諾慎印跡法來檢測基因的表達(dá)。
(1)植物材料將大麥種子(Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka 1號)放置在被蒸餾水侵濕的紙巾上，通過采用鋁箔遮光在室溫下保持3天來誘發(fā)生芽。將幼苗移植到浮在水培溶液上的網(wǎng)狀物上并在利用泵通氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)長出第二片葉子后，將該植物移植到20L的容器中并繼續(xù)進(jìn)行水培。所述水培溶液的組成為[7×10-4M K2SO4，1×10-4M KCl，1×10-4M KH2PO4，2×10-3M Ca(NO3)，2.5×10-4M MgSO4，1×10-5MH2BO3，5×10-7M MnSO4，5×10-7M ZnSO4，2×10-7M CuSO4，1×10-8M(NH4)6Mo7O24，1.5×10-4M Fe-EDTA]。每天用1N的HCl將水培溶液的pH值調(diào)到5.5左右。水培溶液采用蒸餾水進(jìn)行制備并且每周只換一次。當(dāng)長出第四片葉子后，用蒸餾水沖洗根部以便除去所粘附的金屬，然后將植物移植到不含每種金屬(Fe，Zn)的水培溶液中從而開始進(jìn)行金屬-缺乏(Fe，Zn)處理，并在一定的時間周期內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)。(2)諾慎印跡分析將金屬(Fe，Zn)缺乏的大麥根和芽作為樣品來進(jìn)行RNA的提取。
提取RNA的方法如下所述。
用研缽將液氮冷凍的植物磨碎后溶解在提取緩沖液(150mM LiCl，5mM EDTA，pH8，5％SDS，80mM Tris-HCl，pH9)中。接下來，進(jìn)行兩次苯酚-氯仿提取。向上清液中加入0.3M的醋酸鈉和部分體積的異丙醇并進(jìn)行離心。將沉淀物溶解在3M的氯化鋰中并進(jìn)行10分鐘的冰浴，然后進(jìn)行離心。用80％的乙醇沖洗沉淀物并用蒸餾水溶解。在-80℃下進(jìn)行保存。
使得到的RNA在1.2％的瓊脂糖凝膠上跑電泳，然后印跡到膜(Hybond-N+，Amersham-Pharmacia)上。
通過利用隨機引物DNA標(biāo)記試劑盒2.0版(Takra)標(biāo)記PCR片段來制備雜交探針。利用Church雜交溶液(0.5M的Church磷酸緩沖液，1mM EDTA，7％(w/v)SDS)在65℃下雜交18小時。用Church雜交沖洗溶液(40mM的Church磷酸緩沖液，1％(w/v)SDS)在65℃下沖洗10分鐘，共進(jìn)行兩次。沖洗后，用Saran Wrap將膜包起來并對暗盒中的IP成象膠片(Fuji Film)進(jìn)行過夜曝光。利用BAS3000圖象分析儀(FujiFilm)進(jìn)行圖象處理。(3)結(jié)果與討論以DMAS1序列(對應(yīng)于DMAS1、DMAS2和GR的共同序列，在圖11中用大方框?qū)⒃摴餐蛄腥α似饋?作為探針進(jìn)行諾慎印跡分析的結(jié)果如圖10所示。在處于Fe-缺乏狀態(tài)的根部進(jìn)行很強的表達(dá)(另外，在處于Zn-缺乏的根部和芽部(葉子、莖等)進(jìn)行較強的表達(dá))。然而，在對照組中以及在以GR-固有序列(被封閉在圖11中的細(xì)長框中的序列)為探針時的任何應(yīng)力的作用下沒有觀察到表達(dá)的進(jìn)行。這兩個結(jié)果表明GR基因的表達(dá)與Fe-缺乏無關(guān)，而且還表明在通常條件下該基因幾乎不被表達(dá)。相反，所述結(jié)果表明DMAS1和DMAS2基因在處于Fe-缺乏狀態(tài)的大麥根部中的表達(dá)很強。因此，可以得出結(jié)論DMAS是其基因表達(dá)在Fe-缺乏條件下被誘導(dǎo)的酶而且該酶催化酮體合成脫氧mugineic酸。盡管DMAS的基因組基因仍未被克隆出來，但認(rèn)為該基因組基因的5’上游序列中可能含有針對Fe-缺乏仍然未知的應(yīng)答系統(tǒng)成分。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了在mugineic酸的生物合成過程中將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶，該mugineic酸參與植物體的鐵-獲得性機制；編碼該酶的基因和一種由于其中轉(zhuǎn)入了上述基因而使得對鐵-缺乏的耐受性得到增強的植物。植物體對鐵-缺乏的高耐受性能夠使得植物即使在供鐵困難的土壤如堿性土壤中也能進(jìn)行栽培、擴大能夠進(jìn)行栽培的耕作面積，而且能夠解決未來面臨的食物和環(huán)境問題。并且，通過本發(fā)明還原酶的描述能夠闡明植物體內(nèi)的mugineic酸的生物合成途徑的全貌。因此，利用這些生物合成途徑中所涉及的一組酶及編碼這些酶的基因構(gòu)建對鐵缺乏具有高耐受性的植物成為可能。
因此，本發(fā)明提供了生物合成mugineic酸所需的一系列的酶和編碼這些酶的一系列基因，而且還能夠賦予植物以被稱作途徑II的鐵獲得性機制。
序列表<110>科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(Japan Science and Technology Corporation)<120>脫氧mugineic酸合酶有其基因(Deoxymugineic acid synthetase and gene thereof)<130>JA909897<150>JP2001-086162<151>2001-03-23<160>5<210>1<211>359<212>PRT<213>Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka no.1<400>1Met Ile Glu Gly Ala Gly Ser Ile Val Asp Ala His Thr Val Glu Val1 5 1015Thr Gln Pro Asp Gly Ser Lys Gln Arg His Thr Thr Lys His Ile Leu20 25 30Ile Ala Thr Gly Ser Arg Ala Thr Leu Val Asn Ile Pro Gly Lys Glu35 40 45Leu Ala Ile Thr Ser Asp Glu Ala Leu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Lys50 55 60Arg Ala Val Ile Leu Gly Gly Gly Tyr Ile Ala Val Glu Phe Ala Ser6570 7580Ile Trp Lys Gly Leu Gly Ala Gln Val Asp Leu Phe Tyr Arg Lys Glu8590 95Leu Pro Leu Arg Gly Phe Asp Asp Glu Met Arg Thr Val Val Ala Ser100 105 110Asn Leu Glu Gly Arg Gly Ile Arg Leu His Pro Gly Thr Asn Leu Thr115120 125Glu Leu Ser Lys Thr Ala Asp Gly Ile Lys Val Val Thr Asp Lys Gly130 135140Asp Glu Phe Ile Ala Asp Val Val Leu Phe Ala Thr Gly Arg Ala Pro145 150 155 160Asn Ser Asn Arg Leu Asn Leu Glu Ala Val Gly Val Glu Val Asp Gln165 170 175Ile Gly Ala Ile Lys Val Asp Glu Tyr Ser Arg Thr Ser Val Pro Asn180185 190Ile Trp Ala Val Gly Asp Val Thr Asn Arg Ile Asn Leu Thr Pro Val195 200 205Ala Leu Met Glu Ala Thr Cys Phe Ala Lys Thr Val Phe Gly Gly Gln210 215 220Thr Val Lys Pro Asp Tyr Lys Asp Val Pro Cys Ala Val Phe Cys Ile225 230 235 240Pro Pro Leu Ser Val Val Gly Leu Ser Glu Gln Glu Ala Leu Ala Glu245 250 255Ala Lys Asn Asp Leu Leu Val Tyr Thr Ser Ser Phe Asn Pro Met Lys260 265 270Asn Ser Ile Ser Lys Arg Gln Glu Lys Ser Ile Met Lys Leu Val Val275 280 285Asp Ala Glu Thr Asp Lys Val Leu Gly Ala Ala Met Cys Gly Pro Asp290295300Ala Ala Glu Ile Met Gln Gly Ile Ala Val Ala Leu Lys Ala Gly Ala305 310315 320Thr Lys Ala Thr Phe Asp Ser Thr Val Gly Ile His Pro Ser Ala Ala325 330335Glu Glu Phe Val Thr Met Arg Thr Leu Thr Arg Arg Val Ser Pro Ala340 345 350Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu355<210>2<211>254<212>PRT<213>Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka no.1<400>2Met Arg Thr Val Val Ala Ser Asn Leu Glu Gly Arg Gly Ile Arg Leu1 510 15His Pro Gly Thr Asn Leu Thr Glu Leu Ser Lys Thr Ala Asp Gly Ile20 2530Lys Val Val Thr Asp Lys Gly Asp Glu Phe Ile Ala Asp Val Val Leu35 40 45Phe Ala Thr Gly Arg Ala Pro Asn Ser Asn Arg Leu Asn Leu Glu Ala505560Val Gly Val Glu Val Asp Gln Ile Gly Ala Ile Lys Val Asp Glu Tyr65 70 75 80Ser Arg Thr Ser Val Pro Asn Ile Trp Ala Val Gly Asp Val Thr Asn
859095Arg Ile Asn Leu Thr Pro Val Ala Leu Met Glu Ala Thr Cys Phe Ala100 105 110Lys Thr Val Phe Gly Gly Gln Thr Val Lys Pro Asp Tyr Lys Asp Val115 120 125Pro Cys Ala Val Phe Cys Ile Pro Pro Leu Ser Val Val Gly Leu Ser130 135 140Glu Gln Glu Ala Leu Ala Glu Ala Lys Asn Asp Leu Leu Val Tyr Thr145 150 155 160Ser Ser Phe Asn Pro Met Lys Asn Ser Ile Ser Lys Arg Gln Glu Lys165 170 175Ser Ile Met Lys Leu Val Val Asp Ala Glu Thr Asp Lys Val Leu Gly180 185190Ala Ala Met Cys Gly Pro Asp Ala Ala Glu Ile Met Gln Gly Ile Ala195 200 205Val Ala Leu Lys Ala Gly Ala Thr Lys Ala Thr Phe Asp Ser Thr Val210 215 220Gly Ile His Pro Ser Ala Ala Glu Glu Phe Val Thr Met Arg Thr Leu225230 235 240Thr Arg Arg Val Ser Pro Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu245250<210>3<211>1357<212>DNA<213>Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka no.1<400>3cggacgcgtg ggaacggagt gtacaagagg atccttggta attctggtgt gacg atg 57Met1atc gaa gga gca gga agt ata gtt gat gct cac acc gtt gaa gtt acc 105Ile Glu Gly Ala Gly Ser Ile Val Asp Ala His Thr Val Glu Val Thr5 10 15cag cca gat ggt tca aag caa agg cac acg acg aag cac ata ttg att 153Gln Pro Asp Gly Ser Lys Gln Arg His Thr Thr Lys His Ile Leu Ile202530gca act ggc agc cga gca act ctg gtc aac att cct gga aag gag ctg 201Ala Thr Gly Ser Arg Ala Thr Leu Val Asn Ile Pro Gly Lys Glu Leu354045gct att act tca gat gaa gct tta agt ttg gag gag cta ccg aaa cgt 249Ala Ile Thr Ser Asp Glu Ala Leu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Lys Arg50 556065gct gtg att ctt ggt ggc gga tat att gct gtt gaa ttt gct tct atc 297Ala Val Ile Leu Gly Gly Gly Tyr Ile Ala Val Glu Phe Ala Ser Ile707580tgg aag ggg ttg ggt gct caa gta gat cta ttt tat agg aaa gaa ctt 345Trp Lys Gly Leu Gly Ala Gln Val Asp Leu Phe Tyr Arg Lys Glu Leu85 9095cct cta agg ggt ttt gat gat gag atg aga aca gtt gtt gca agt aac 393Pro Leu Arg Gly Phe Asp Asp Glu Met Arg Thr Val Val Ala Ser Asn100 105 110ctt gaa gga agg gga atc cga ttg cat cca ggg aca aat ttg act gag 441Leu Glu Gly Arg Gly Ile Arg Leu His Pro Gly Thr Asn Leu Thr Glu115 120 125ttg agt aaa aca gcc gat ggc att aaa gtt gtg aca gat aag ggg gat 489Leu Ser Lys Thr Ala Asp Gly Ile Lys Val Val Thr Asp Lys Gly Asp130 135 140 145gag ttc att gca gat gtt gtt ctt ttt gct aca ggt cgt gcg ccg aac 537Glu Phe Ile Ala Asp Val Val Leu Phe Ala Thr Gly Arg Ala Pro Asn150 155 160tcc aat agg ctg aac ttg gaa gct gta ggt gtt gag gtt gat caa ata 585Ser Asn Arg Leu Asn Leu Glu Ala Val Gly Val Glu Val Asp Gln Ile165 170 175gga gcc atc aag gtt gat gaa tac tcc cgt aca tca gtt cca aat ata 633Gly Ala Ile Lys Val Asp Glu Tyr Ser Arg Thr Ser Val Pro Asn Ile180185 190tgg gct gtt ggc gat gtg acg aat cgg att aac cta aca cct gtt gct 681Trp Ala Val Gly Asp Val Thr Asn Arg Ile Asn Leu Thr Pro Val Ala195 200205ctg atg gag gct act tgc ttt gct aaa act gtg ttt ggt ggc cag aca 729Leu Met Glu Ala Thr Cys Phe Ala Lys Thr Val Phe Gly Gly Gln Thr210 215 220 225gtt aag cct gat tat aaa gat gta cct tgt gct gtt ttc tgt att ccg 777Val Lys Pro Asp Tyr Lys Asp Val Pro Cys Ala Val Phe Cys Ile Pro230 235 240ccg cta tct gtc gtg ggt ctt agc gaa caa gag gct ttg gcg gaa gcc 825Pro Leu Ser Val Val Gly Leu Ser Glu Gln Glu Ala Leu Ala Glu Ala245250 255aag aat gat ctt ctt gtt tac aca tca agt ttc aat cca atg aag aac 873Lys Asn Asp Leu Leu Val Tyr Thr Ser Ser Phe Asn Pro Met Lys Asn260 265 270agc ata tcc aaa cgt caa gag aag tct atc atg aaa ctg gtg gtt gat 921Ser Ile Ser Lys Arg Gln Glu Lys Ser Ile Met Lys Leu Val Val Asp275280 285gct gag acc gat aag gta ctc ggt gca gcc atg tgt gga cca gat gca 969Ala Glu Thr Asp Lys Val Leu Gly Ala Ala Met Cys Gly Pro Asp Ala290 295 300 305gct gaa att atg cag ggc att gct gtt gcg ctc aag gct gga gct acc 1017Ala Glu Ile Met Gln Gly Ile Ala Val Ala Leu Lys Ala Gly Ala Thr310315 320aag gcg acc ttc gac agc act gtt ggg att cac ccc tct gcc gcg gag 1065Lys Ala Thr Phe Asp Ser Thr Val Gly Ile His Pro Ser Ala Ala Glu
325 330 335gag ttt gtg acg atg cgg acc ttg acc agg cgc gtg agc ccg gca tcg 1113Glu Phe Val Thr Met Arg Thr Leu Thr Arg Arg Val Ser Pro Ala Ser340 345 350aag cca aag acg aac ttg taagcaagat ccctgcaatg ttttggacga 1161Lys Pro Lys Thr Asn Leu355aaattatact ggtgcggcga cgggaactgt agacgtggac tcttgtttca gttcagctag1221ccctgcgctt ggcatttgac ctgaaagggt gatacggtgt acgtatttga ttgtgatagt1281aataagtttc tgtggaacag tttgtacaga aatcgtgggt attgttgtga tttccaagcc1341aaaaaaaaaa aaaaaa1357<210>4<211>1202<212>DNA<213>Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka no.1<400>4ggaaaggagc tggctattac ttcagatgaa gctttaagtt tggaggagct accgaaacgt 60gctgtgattc ttggtggcgg atatattgct gttgaatttg cttctatctg gaaggggttg120ggtgctcaag tagatctatt ttataggaaa gaacttcctc taaggggttt tgatgatgag180atg aga aca gtt gtt gca agt aac ctt gaa gga agg gga atc cga ttg 228Met Arg Thr Val Val Ala Ser Asn Leu Glu Gly Arg Gly Ile Arg Leu1 510 15cat cca ggg aca aat ttg act gag ttg agt aaa aca gcc gat ggc att 276His Pro Gly Thr Asn Leu Thr Glu Leu Ser Lys Thr Ala Asp Gly Ile20 25 30aaa gtt gtg aca gat aag ggg gat gag ttc att gca gat gtt gtt ctt 324Lys Val Val Thr Asp Lys Gly Asp Glu Phe Ile Ala Asp Val Val Leu35 40 45ttt gct aca ggt cgt gcg ccg aac tcc aat agg ctg aac ttg gaa gct 372Phe Ala Thr Gly Arg Ala Pro Asn Ser Asn Arg Leu Asn Leu Glu Ala505560gta ggt gtt gag gtt gat caa ata gga gcc atc aag gtt gat gaa tac 420Val Gly Val Glu Val Asp Gln Ile Gly Ala Ile Lys Val Asp Glu Tyr65 7075 80tcc cgt aca tca gtt cca aat ata tgg gct gtt ggc gat gtg acg aat 468Ser Arg Thr Ser Val Pro Asn Ile Trp Ala Val Gly Asp Val Thr Asn85 9095cgg att aac cta aca cct gtt gct ctg atg gag gct act tgc ttt gct 516Arg Ile Asn Leu Thr Pro Val Ala Leu Met Glu Ala Thr Cys Phe Ala
100 105 110aaa act gtg ttt ggt ggc cag aca gtt aag cct gat tat aaa gat gta 564Lys Thr Val Phe Gly Gly Gln Thr Val Lys Pro Asp Tyr Lys Asp Val115 120 125cct tgt gct gtt ttc tgt att ccg ccg cta tct gtc gtg ggt ctt agc 612Pro Cys Ala Val Phe Cys Ile Pro Pro Leu Ser Val Val Gly Leu Ser130 135 140gaa caa gag gct ttg gcg gaa gcc aag aat gat ctt ctt gtt tac aca 660Glu Gln Glu Ala Leu Ala Glu Ala Lys Asn Asp Leu Leu Val Tyr Thr145 150 155 160tca agt ttc aat cca atg aag aac agc ata tcc aaa cgt caa gag aag 708Ser Ser Phe Asn Pro Met Lys Asn Ser Ile Ser Lys Arg Gln Glu Lys165170 175tct atc atg aaa ctg gtg gtt gat gct gag acc gat aag gta ctc ggt 756Ser Ile Met Lys Leu Val Val Asp Ala Glu Thr Asp Lys Val Leu Gly180 185 190gca gcc atg tgt gga cca gat gca gct gaa att atg cag ggc att gct 804Ala Ala Met Cys Gly Pro Asp Ala Ala Glu Ile Met Gln Gly Ile Ala195 200 205gtt gcg ctc aag gct gga gct acc aag gcg acc ttc gac agc act gtt 852Val Ala Leu Lys Ala Gly Ala Thr Lys Ala Thr Phe Asp Ser Thr Val210 215 220ggg att cac ccc tct gcc gcg gag gag ttt gtg acg atg cgg acc ttg 900Gly Ile His Pro Ser Ala Ala Glu Glu Phe Val Thr Met Arg Thr Leu225230 235 240acc agg cgc gtg agc ccg gca tcg aag cca aag acg aac ttg 942Thr Arg Arg Val Ser Pro Ala Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu245250taagcaagat ccctgcaatg ttttggacga aaattatact ggtgcggcga cgggaactgt1002agacgtggac tcttgtttca gttcgctagc cctgcgcttg gcatttgacc tgaaagggtg1062ataggtgtac gtatttgatt gtgatagtaa taagtttctg tggaacagtt tgtacagaaa1120tcgtgggtat tgttgtgatt tccaagccaa ataagccctt gatgttgaaa aaaaaaaaaa1182aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1202<210>5<211>1289<212>DNA<213>Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka no.1<400>5cccagccaga tggttcaaag caaaggcaca cgacgaagca catattgatt gcaactggca60gccgagcaac tctggtcaac attcctggaa aggagctggc tattacttca gatgaagctt120taagtttgga ggagctaccg aaacgtgctg tgattcttgg tggcggatat attgctgttg180aatttgcttc tatctggaag gggttgggtg ctcaagtaga tctattttat aggaaagaac240ttcctctaag gggttttgat gatgag atg aga aca gtt gtt gca agt aac ctt 293Met Arg Thr Val Val Ala Ser Asn Leu1 5gaa gga agg gga atc cga ttg cat cca ggg aca aat ttg act gag ttg 341Glu Gly Arg Gly Ile Arg Leu His Pro Gly Thr Asn Leu Thr Glu Leu10152025agt aaa aca gcc gat ggc att aaa gtt gtg aca gat aag ggg gat gag 389Ser Lys Thr Ala Asp Gly Ile Lys Val Val Thr Asp Lys Gly Asp Glu303540ttc att gca gat gtt gtt ctt ttt gct aca ggt cgt gcg ccg aac tcc 437Phe Ile Ala Asp Val Val Leu Phe Ala Thr Gly Arg Ala Pro Asn Ser455055aat agg ctg aac ttg gaa gct gta ggt gtt gag gtt gat caa ata gga 485Asn Arg Leu Asn Leu Glu Ala Val Gly Val Glu Val Asp Gln Ile Gly60 6570gcc atc aag gtt gat gaa tac tcc cgt aca tca gtt cca aat ata tgg 533Ala Ile Lys Val Asp Glu Tyr Ser Arg Thr Ser Val Pro Asn Ile Trp758085gct gtt ggc gat gtg acg aat cgg att aac cta aca cct gtt gct ctg 581Ala Val Gly Asp Val Thr Asn Arg Ile Asn Leu Thr Pro Val Ala Leu9095 100 105atg gag gct act tgc ttt gct aaa act gtg ttt ggt ggc cag aca gtt 629Met Glu Ala Thr Cys Phe Ala Lys Thr Val Phe Gly Gly Gln Thr Val110 115 120aag cct gat tat aaa gat gta cct tgt gct gtt ttc tgt att ccg ccg 677Lys Pro Asp Tyr Lys Asp Val Pro Cys Ala Val Phe Cys Ile Pro Pro125 130 135cta tct gtc gtg ggt ctt agc gaa caa gag gct ttg gcg gaa gcc aag 725Leu Ser Val Val Gly Leu Ser Glu Gln Glu Ala Leu Ala Glu Ala Lys140 145 150aat gat ctt ctt gtt tac aca tca agt ttc aat cca atg aag aac agc 773Asn Asp Leu Leu Val Tyr Thr Ser Ser Phe Asn Pro Met Lys Asn Ser155 160 165ata tcc aaa cgt caa gag aag tct atc atg aaa ctg gtg gtt gat gct 821Ile Ser Lys Arg Gln Glu Lys Ser Ile Met Lys Leu Val Val Asp Ala170175 180 185gag acc gat aag gta ctc ggt gca gcc atg tgt gga cca gat gca gct 869Glu Thr Asp Lys Val Leu Gly Ala Ala Met Cys Gly Pro Asp Ala Ala190 195 200gaa att atg cag ggc att gct gtt gcg ctc aag gct gga gct acc aag 917Glu Ile Met Gln Gly Ile Ala Val Ala Leu Lys Ala Gly Ala Thr Lys205210 215gcg acc ttc gac agc act gtt ggg att cac ccc tct gcc gcg gag gag 965Ala Thr Phe Asp Ser Thr Val Gly Ile His Pro Ser Ala Ala Glu Glu220 225230ttt gtg acg atg cgg acc ttg acc agg cgc gtg agc ccg gca tcg aag 1013Phe Val Thr Met Arg Thr Leu Thr Arg Arg Val Ser Pro Ala Ser Lys235 240 245cca aag acg aac ttg taagcaagat ccctgcaatg ttttggacga aaattatact 1068Pro Lys Thr Asn Leu250ggtgcggcga cgggaactgt agacgtggac tcttgtttca gttcgctagc cctgcgcttg1128gcatttgacc tgaaagggtg atacggtgta cagtatttga ttgtgatagt aataagtttc1188tgtggaacag tttgtacaga aatcgtgggt attgttgtga tttccaagcc aaataagccc1248ttgatgttga aatgttttcc catttaaaaa aaaaaaaaaa a1289
權(quán)利要求
1.一種將酮-煙酰胺還原成2’-脫氧mugineic酸的還原酶。
2.如權(quán)利要求1所述的還原酶，其中所述還原酶得自于大麥。
3.如權(quán)利要求1或2所述的還原酶，其含有序列表中1號或2號序列所示的氨基酸序列或者在所示氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸的缺失、插入或取代的氨基酸序列。
4.一種編碼如權(quán)利要求1至3中任一項所述還原酶的基因。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其中所述基因含有序列表中3號、4號或5號序列所示的堿基序列或者能夠在嚴(yán)格條件下與所述堿基序列雜交的堿基序列。
6.一種被權(quán)利要求4或5所述基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
7.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞是一種植物細(xì)胞。
8.一種其中轉(zhuǎn)入了權(quán)利要求4或5所述基因的植物。
9.如權(quán)利要求8所述的植物，其中所述植物是禾本科植物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的植物，其中所述植物是對鐵缺乏具有高耐受性的植物。
11.一種用于生物合成鐵螯合劑mugineic酸的酶試劑盒，其包含權(quán)利要求1至3中任一項所述的還原酶以及至少一種用于生物合成鐵螯合劑mugineic酸的其它酶。
12.一種用于構(gòu)建對鐵缺乏具有高耐受性的植物的基因試劑盒，其包含權(quán)利要求4或5所述的基因以及一種編碼至少一種用于生物合成鐵螯合劑mugineic酸的其它酶的基因。
13.如權(quán)利要求12所述的基因試劑盒，其中所述基因是一種含有其中轉(zhuǎn)入了所述基因的植物的啟動子區(qū)域的基因。
14.如權(quán)利要求13所述的基因試劑盒，其中所述其中轉(zhuǎn)入了所述基因的植物是禾本科植物。
全文摘要
一種在mugineic酸的生物合成過程中將酮－煙酰胺還原成2’－脫氧mugineic酸的還原酶，該mugineic酸參與植物體內(nèi)的鐵－獲得性機制；一種編碼該酶的基因；一種由于其中轉(zhuǎn)入了上述基因而使得對鐵－缺乏的耐受性得到增強的植物；一種用于構(gòu)建一種對鐵－缺乏具有高耐受性的植物的酶試劑盒和基因試劑盒，所述試劑盒包含用于生物合成mugineic酸的酶或編碼這些酶的基因，所述mugineic酸參與植物體內(nèi)的鐵－獲得性機制。
文檔編號C12N9/00GK1484704SQ02803426
公開日2004年3月24日 申請日期2002年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者西澤直子, 森敏, 根岸孝至, 至 申請人:科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團