專利名稱：使用腈水解酶將腈轉(zhuǎn)化為羧酸的改進(jìn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用具有腈水解酶活性的酶催化劑將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸的改進(jìn)的方法。更具體地，本發(fā)明使用具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性的酶催化劑在水溶液中將2-甲基戊二腈轉(zhuǎn)化為4-氰基戊酸的銨鹽。
背景技術(shù)：
腈水解酶在水溶液中直接將腈轉(zhuǎn)化為羧酸銨鹽，不生成酰胺的中間體。在很多種微生物中鑒定了腈水解酶，例如，Kobayashi等(四面體(Tetrahedron)465587-5590(1990)；細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriology)，1724807-4815(1990))描述了從胭脂紅分枝桿菌(Rhodococcus rhodochrous)K22分離出的脂肪族腈水解酶，它催化脂肪族腈水解成它們相應(yīng)的羧酸銨鹽。有人使用糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)1650的立體特異性腈水解酶在手性羧酸的制備中用來拆分外消旋腈，并且克隆和表達(dá)了編碼腈水解酶的基因(W000/23577)。有人從嗜熱菌蒼白芽孢桿菌(Bacillus pallidus)Dac521菌株分離出腈水解酶，它催化脂肪族、芳香族和雜環(huán)腈類的水解(Almatawah等，Extremophiles 3283-291(1999))。有人使用來自胭脂紅分枝桿菌(Rhodococcus rhodochrous)NCIMB 40757或NCIMB40833的腈水解酶將丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酸銨(U.S.5,998,180)。從睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)分離出的腈水解酶，能將很多脂肪族的α，ω-二腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氰基羧酸銨鹽或二羧酸二銨鹽(CA 2,103,616；S. Lévy-Schil等，Gene 16115-20(1995))。也有人報道通過敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W的腈水解酶活性將脂肪族的α，ω-二腈區(qū)域選擇地水解為相應(yīng)的ω-氰基羧酸銨鹽(Gavagan等，J.Org.Chem.，634792-4801(1998))。
兩種酶的組合，腈水合酶和酰胺酶，能被用來在水溶液中將脂肪族腈類轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸銨鹽。這里首先用腈水合酶將脂肪族腈轉(zhuǎn)化為酰胺，然后接著用酰胺酶將酰胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸銨鹽。已知很多細(xì)菌屬具有不同范圍的腈水合酶和酰胺酶活性，它們包括紅球菌屬(Rhodococcus)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，無芽孢桿菌屬(Bacteridium)，短桿菌屬(Brevibacterium)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，和球菌屬(Micrococcus)。Cowan等，(Extremophiles 2207-216(1998))最近綜合評述了腈降解微生物的腈水解酶和腈水合酶/酰胺酶這兩個體系。
2-甲基戊二腈是一個使用生物催化劑能被區(qū)域選擇地轉(zhuǎn)化為ω-氰基羧酸銨鹽(即，4-氰基戊酸的銨鹽)的脂肪族的α，ω-二腈的例子。先前在U.S.5,814,508和其部分專利U.S.5,858,736，U.S.5,908,954，U.S.5,922,589，U.S.5,936,114，U.S.6,077,955，和U.S.6,066,490中描述過4-氰基戊酸的生物催化制備。這些專利涉及其中在水溶液中利用具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性，或者腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的組合的催化劑將脂肪族α，ω-二腈轉(zhuǎn)化為ω-氰基羧酸的銨鹽的方法。當(dāng)脂肪族的α，ω-二腈在ω-碳原子處還被不對稱取代時，腈水解酶制備從ω-腈基水解得到的ω-氰基羧酸銨鹽，區(qū)域選擇性大于98％。U.S.5,814,508尤其公開了在水溶液中將2-甲基戊二腈轉(zhuǎn)化為4-氰基戊酸的方法，在用作酶催化劑之前將敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W熱處理(35-70℃)10-120分鐘。這種熱處理對于選擇期望的區(qū)域選擇的脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性是關(guān)鍵的，同時破壞不期望的非區(qū)域選擇的腈水合酶活性。4-氰基戊酸然后在商業(yè)制備1，5-二甲基-2-哌啶酮的一步化學(xué)方法中被用作底物。1，5-二甲基-2-哌啶酮作為工業(yè)溶劑具有很多用途，包括電子清除，感光保護(hù)膜剝離，工業(yè)去油污和金屬清洗，樹脂清除，油墨配方，工業(yè)粘合劑，和作為用于聚合物和化學(xué)品的反應(yīng)溶劑。
對于使用生物催化劑的商業(yè)規(guī)模的應(yīng)用，與使用非固定化細(xì)胞相比，使用固定化微生物細(xì)胞具有很多公知的經(jīng)濟(jì)利益。一些利益是它們重復(fù)使用的能力，它們?nèi)菀追蛛x，和它們在連續(xù)反應(yīng)中使用。聚合物基質(zhì)中的細(xì)胞內(nèi)含物使得活體或代謝失活細(xì)胞被截留，同時保持高度產(chǎn)物和底物擴(kuò)散。固定化典型基質(zhì)的例子是藻酸鈉(Bucke，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)135175-189(1987))或角叉菜膠(Chibata等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)135189-198(1987))。截留方法較簡單，并且凝膠材料是無毒的和低價的。
接著用多官能試劑共價交聯(lián)細(xì)胞的交聯(lián)劑處理細(xì)胞小球能進(jìn)一步提高固定化細(xì)胞的″操作″穩(wěn)定性，所述交聯(lián)劑是例如戊二醛和聚吖丙啶或六亞甲基二胺。在一個實施例中，就用于制備L-天冬氨酸的κ-角叉菜膠中固定化大腸桿菌細(xì)胞而言研究了穩(wěn)定性(Chibata，1.固定化微生物細(xì)胞(Immobilized Microbial Cells)；Venkatsubramanian，K.，編；第106屆ACS研討會(ACS SymposiumSeries 106)；美國化學(xué)會(American Chemical Society)；Washington，DC，1979，pp 187-201)。對于用作交聯(lián)處理的六亞甲基二胺和戊二醛的最佳濃度，固定化細(xì)胞的半壽期顯著延長超過沒有處理過的固定化細(xì)胞的半壽期的五倍。
此外，Birnbaum等(生物技術(shù)快報(Biotechnol.Lett.)3393-400(1981))公開了提高藻酸鈣固定細(xì)胞的物理穩(wěn)定性的方法。一種穩(wěn)定方法使用聚吖丙啶處理(24小時)，接著用戊二醛交聯(lián)(15分鐘)。通過在0.1M磷酸鈉緩沖液中將固定化細(xì)胞培育10天檢查球穩(wěn)定性。注意由固定化細(xì)胞有極少量細(xì)胞釋放，從而證明提高的小球完整性。同時，該方案有害影響總的催化劑活性。Birnbaum提出這種作用可能是由于戊二醛的毒性。
最后，推斷為直接固定整個微生物細(xì)胞或微生物細(xì)胞材料加入聚吖丙啶和戊二醛的優(yōu)選順序取決于固定化酶活性對戊二醛的敏感性。U.S.4,288,552公開了用硫醇反應(yīng)試劑例如戊二醛將戊二醛敏感酶(例如在酶分子的活性位點(diǎn)內(nèi)或非常接近酶分子的活性位點(diǎn)帶有SH基團(tuán)的巰基-酶和其他酶)滅活。對于這些類型的酶催化劑，本發(fā)明要求首先用聚吖丙啶處理微生物細(xì)胞，同時或之后加入戊二醛，以消除可能的酶活性損失。相反，U.S.4,355,105教導(dǎo)期望在固定化微生物(所述微生物的酶對戊二醛不靈敏)時在聚吖丙啶之前加入戊二醛。在這種情況下，與在加入戊二醛之前用聚吖丙啶預(yù)處理固定化細(xì)胞相比，得到的固定化細(xì)胞更容易從含水介質(zhì)中回收。無論在哪一種情況下，用聚吖丙啶和戊二醛處理之前，微生物細(xì)胞都不會截留在凝膠或聚合物基質(zhì)中。
因此，要解決的問題是開發(fā)一種當(dāng)被用作將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸銨鹽的催化劑時具有高比活性和延長的物質(zhì)完整性時間的固定細(xì)胞催化劑的經(jīng)濟(jì)制備方法。更具體地，使用導(dǎo)致更高產(chǎn)率和更高濃度的4-氰基戊酸，并且比先前公開的那些用起來更方便的酶催化劑的方法會推進(jìn)本領(lǐng)域發(fā)展。
發(fā)明概述申請人的發(fā)明是一種制備羧酸的方法，包括a)在藻酸鹽中固定一種腈水解酶活性特征的酶催化劑；b)向步驟a)的固定化酶催化劑中加入第一種穩(wěn)定劑，然后加入第二種穩(wěn)定劑，每種都以足以交聯(lián)固定酶催化劑的量和時間加入，第一種穩(wěn)定劑和第二種穩(wěn)定劑分別選自戊二醛和聚吖丙啶，前提是第二種穩(wěn)定劑是除了第一種穩(wěn)定劑之外的；c)在合適的含水反應(yīng)混合物中使步驟b)的產(chǎn)物接觸腈；和d)分離鹽形式或酸形式的步驟c)中制備的羧酸。
任選地，步驟c)和d)可以重復(fù)。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包括步驟c)的腈是2-甲基戊二腈；步驟c)的含水反應(yīng)混合物在反應(yīng)期間含有比例大于20∶1(更優(yōu)選大于200∶1，最優(yōu)選大于750∶1)的NH4+∶Ca2+之比；步驟d)中分離出的羧酸是4-氰基戊酸。
優(yōu)選的酶催化劑是敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W(ATCC55746)，敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72-PF-15(ATCC 55747)，敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72-PF-17(ATCC 55745)，大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)SS1001(ATCC PTA-1177)，或大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)SW91(ATCC PTA-1175)，并且酶催化劑是全細(xì)胞或可滲透微生物細(xì)胞形式。當(dāng)酶催化劑是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)時，不需要通過在其固定在藻酸鹽中之前熱處理將酶催化劑的腈水合酶活性滅活。
生物保藏材料的簡要描述申請人根據(jù)布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了下面生物材料的保藏
如這里使用的，″ATCC″指位于10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-1109，U.S.A.的美國典型培養(yǎng)物國際保藏中心(American Type Culture Collection InternationalDepository)?！錋TCC No.″是ATCC保藏培養(yǎng)物登記號。列出的保藏物在所指出的國際保藏中心保存至少三十年(30)，經(jīng)公開它的專利授權(quán)對公眾是可以得到的。保藏物的可用性不構(gòu)成在政府行為準(zhǔn)予的專利權(quán)部分廢除的情況下實施本發(fā)明的許可。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及使用具有腈水解酶活性的酶催化劑將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸銨鹽的改進(jìn)的方法。更具體地，本發(fā)明使用具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性的酶催化劑在水溶液中將2-甲基戊二腈轉(zhuǎn)化為4-氰基戊酸的銨鹽。申請人現(xiàn)在公開了有可能用戊二醛和聚吖丙啶交聯(lián)之后在藻酸鈣中固定具有腈水解酶活性的酶催化劑，使用得到的催化劑在預(yù)期導(dǎo)致交聯(lián)的固定化酶催化劑物理完整性的快速損失的條件下以至少1.50M的濃度制備4-氰基戊酸銨鹽。沒有意料到的是加入PEI之前對固定細(xì)胞進(jìn)行戊二醛處理沒有任何測量到的腈水解酶活性損失，或者當(dāng)建議不超過20∶1比例時，以至少750∶1的銨/鈣離子之比操作反應(yīng)不會影響催化劑小球的物理完整性。在很多連串循環(huán)反應(yīng)中連續(xù)使用酶催化劑不損失物理完整性。
申請人另外公開了隨著催化劑小球中細(xì)胞干重濃度的增加，戊二醛/聚吖丙啶交聯(lián)藻酸鹽固定酶催化劑的腈水解酶活性提高(與使用角叉菜膠制備的相應(yīng)的酶催化劑相反)。使用藻酸鹽固定化酶催化劑的好處在于當(dāng)與角叉菜膠固定化酶催化劑相比較時以催化劑使用為基礎(chǔ)，它提高總的產(chǎn)品產(chǎn)率。
申請人另外公開在固定化酶催化劑敏捷食酸菌72W情況下，當(dāng)細(xì)胞固定在藻酸鹽中并且得到與穩(wěn)定劑戊二醛和聚吖丙啶交聯(lián)的酶催化劑時，不需要一般要求滅活不期望的腈水合酶活性的熱處理。出人意料的是固定化方法會選擇性地并且完全地滅活不期望的腈水合酶活性，不產(chǎn)生可測量到的腈水解酶活性損失，特別是當(dāng)已知戊二醛能滅活腈水解酶的時候。
當(dāng)與先前已知的方法相比較時，這里公開的改進(jìn)的方法在比先前獲得的濃度更高的濃度下獲得更高產(chǎn)率的產(chǎn)物(以每份重量催化劑的產(chǎn)物的重量計)。權(quán)利要求的方法的產(chǎn)物用作在農(nóng)業(yè)和制藥業(yè)中價值高的聚合物，溶劑(例如，1，5-二甲基-2-哌啶酮)，和化學(xué)品的母體。
在本申請中，除非另外具體說明，使用下面的縮寫和定義″戊二醛″縮寫是GA。
″聚吖丙啶″縮寫是PEI。
″2-甲基戊二醛″縮寫是2-MGN。
″4-氰基戊酸″縮寫是4-CPA。
″酶催化劑″指特征在于腈水解酶活性的催化劑。酶催化劑是全微生物細(xì)胞或可滲透微生物細(xì)胞形式。
″含水反應(yīng)混合物″用來指一種含水混合物，含有水，至少2mM濃度的鈣鹽，和任選地，能將反應(yīng)初始pH保持在5和10之間，優(yōu)選6和8之間的緩沖液。
″含水產(chǎn)物混合物″用來指含有由相應(yīng)的方法步驟得到的產(chǎn)物的含水混合物。
現(xiàn)在公開了用于將2-甲基戊二腈(2-MGN)轉(zhuǎn)化為4-氰基戊酸(4-CPA)銨鹽的方法的顯著改進(jìn)。具體地說，本發(fā)明的顯著改進(jìn)來自具有下面步驟的方法1)將優(yōu)選來自敏捷食酸菌72W的特征在于腈水解酶活性的酶催化劑在藻酸鹽中固定化，2)以合適的量向固定化酶催化劑中依次加入戊二醛和聚吖丙啶(優(yōu)選以這個順序)所用時間足以進(jìn)行各穩(wěn)定劑的交聯(lián)，3)在合適的含水反應(yīng)混合物中使2-MGN接觸交聯(lián)的固定化酶催化劑，4)分離作為酸或銨鹽的4-CPA，和5)交聯(lián)的固定化酶催化劑再循環(huán)至少一次。為了將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸銨鹽使用特征在于腈水解酶活性的其它酶催化劑(例如，胭脂紅分枝桿菌(Rhodococcus rhodochrous)，糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)，嗜熱菌蒼白芽孢桿菌(Bacillus pallidus)，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)，紅球菌屬(Nocardia sp.)，不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)，和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)時也能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
酶催化劑的固定化作用使用兩種不同的聚合物基體，藻酸鈉和κ-角叉菜膠，實施將酶催化劑固定化的方法。全細(xì)胞或可滲透微生物細(xì)胞形式的酶催化劑能被固定在藻酸鹽或角叉菜膠中；滲透化的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，包括但不限于，冷凍-熔化，或者用有機(jī)溶劑或洗滌劑處理(Felix，Bioprocess.Technol.11259-278(1991)；Felix，Anal.Biochem.120211-234(1982))。細(xì)胞在藻酸鹽中固定化是有利的，因為該固定化作用在像5℃這樣低的溫度下進(jìn)行。相反，角叉菜膠固定化作用一般需要45-50℃的溫度，這能導(dǎo)致腈水解酶失活。
向固定化作用方案中增加戊二醛(GA)和聚吖丙啶(PEI)處理，進(jìn)一步提高小球的機(jī)械穩(wěn)定性，這樣它們能夠勝任催化劑再循環(huán)的多次連續(xù)反應(yīng)。為交聯(lián)藻酸鹽小球酶催化劑而加入的GA和PEI的量分別是催化劑小球中存在的每細(xì)胞干重25wt％，至催化劑小球中存在的每細(xì)胞干重2wt％，其中加給催化劑小球的GA與PEI之比范圍是3∶1至1∶3。加給固定化酶催化劑的兩種交聯(lián)穩(wěn)定劑的順序是下面的任何一種首先GA，然后PEI，或者首先PEI，然后GA。加入兩種交聯(lián)穩(wěn)定劑的優(yōu)選順序是首先GA，接著PEI。第二種穩(wěn)定劑的加入延遲一段時間，足以允許第一種穩(wěn)定劑的交聯(lián)。固定化酶催化劑的GA-交聯(lián)時間范圍自5分鐘至2h，優(yōu)選30分鐘至1h。固定化酶催化劑的PEI交聯(lián)時間范圍自30分鐘至24h，優(yōu)選1h至12h。
未知而且出人意料的是GA/PEI的組合會成功地穩(wěn)定固定化細(xì)胞催化劑而對腈水解酶的比活性沒有損害，因為已知戊二醛滅活敏捷食酸菌72W腈水解酶(實施例1)。在Cowan等，(Extremophiles 2207-216(1998))中公開了腈水解酶提供激活巰基殘基對腈碳原子的親核進(jìn)攻而發(fā)揮功能；U.S.4,288,552指出戊二醛滅活戊二醛-靈敏酶，例如硫醇-酶。
有人報道過鈣交聯(lián)的藻酸鹽在高濃度的其它陽離子存在下不穩(wěn)定。具體地說，不推薦超過20∶1或25∶1的銨/鈣離子之比(Klein，J.和Vorlop，K.D.，生物技術(shù)聚焦1(Biotechnology Focus1)；Finn，R.F.，Ed.；牛津大學(xué)出版社New York；1998，pp 325-336；Smidsrod等，生物技術(shù)趨勢(Trends Biotechnol.)8，71-78(1990))。Klein等闡述，對于藻酸鹽與高比例的L-古洛糖醛酸，電介質(zhì)(Na+，K+，NH4+，Mg2+的摩爾總和)與Ca2+之比應(yīng)該不大于20∶1。在本發(fā)明的應(yīng)用中，用戊二醛和聚吖丙啶交聯(lián)之后，藻酸鹽凝膠酶催化劑(其含有高比例的L-古洛糖醛酸)，當(dāng)在制備高濃度的4-氰基戊酸銨鹽的至少195次連續(xù)間歇式反應(yīng)中再循環(huán)時保持它們的物理完整性。在含有最小鈣離子濃度是2mM的這些反應(yīng)中，銨離子和鈣離子的比例一般至少是750∶1(參見實施例4)。這些反應(yīng)在銨離子和鈣離子的比例是200∶1,750∶1，和950∶1下進(jìn)行。這些結(jié)果當(dāng)然沒有被預(yù)示過。
當(dāng)進(jìn)行商業(yè)方法時，期望具有高比活性，這里定義為酶活性/催化劑重量。在本發(fā)明應(yīng)用中，腈水解酶的比活性隨著藻酸鹽小球中細(xì)胞干重濃度的增加而提高，但是在角叉菜膠小球中則不是這樣。對于角叉菜膠小球，或者活性有小幅度提高(7％)，30℃下細(xì)胞干重增加50％，或者在35℃下比活性稍有降低(參見實施例4)。
敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)在戊二醛/聚吖丙啶交聯(lián)藻酸鹽中的固定化先前從暴露給脂肪族腈或二腈類的土壤樣品中分離出敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(U.S.5,814,508及其部分專利U.S.5,858,736，U.S.5,908,954，U.S.5,922,589，U.S.5,936,114，U.S.6,077,955，和U.S.6,06 6,490)。(U.S.5,814,508在此引作參考)。當(dāng)敏捷食酸菌72W被用作用于不對稱取代的α-烷基-α，ω-二腈水解的微生物全細(xì)胞催化劑時，除了期望的ω-氰基羧酸之外生成相應(yīng)的二羧酸一酰胺和二羧酸。這種全細(xì)胞催化劑的不期望的非區(qū)域選擇性腈水合酶活性產(chǎn)生不期望的二羧酸一酰胺，酰胺酶將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二羧酸。酶催化劑例如敏捷食酸菌72-PF-15，敏捷食酸菌72-PF-17，大腸桿菌SS1001和大腸桿菌SW91，它們的特征在于敏捷食酸菌72W的腈水解酶活性但是不具有敏捷食酸菌72W的腈水合酶活性，不產(chǎn)生不期望的二羧酸一酰胺和二羧酸副產(chǎn)物。
發(fā)現(xiàn)在合適的緩沖液中在35-70℃下將敏捷食酸菌72W(ATCC55746)的懸浮液短時間加熱滅活不期望的腈水合酶活性而不影響期望的腈水解酶活性。因此，特別高區(qū)域選擇性地將2-甲基戊二腈(2-MGN)水解為4-氰基戊酸(4-CPA)銨鹽的先前的方法要求在35-70℃下將敏捷食酸菌72W的懸浮液加熱處理以滅活不期望的腈水合酶活性并且消除不期望的副產(chǎn)物2-甲基戊二酸的產(chǎn)生(Gavagan等，微生物技術(shù)應(yīng)用(Appl.Microbiol.，Biotechnol.)，52654-659(1999)；U.S.5,814,508)。這種熱處理不產(chǎn)生任何腈水解酶活性損失，并且還在制備固定化細(xì)胞催化劑中常規(guī)使用。
用于商業(yè)生產(chǎn)4-氰基戊酸的本發(fā)明提供的另一個好處是在藻酸鹽中沒有熱處理的敏捷食酸菌72W細(xì)胞的固定化去除了大約90％的不期望的腈水合酶活性。接著戊二醛(GA)或戊二醛和聚吖丙啶(GA/PEI)交聯(lián)藻酸鹽固定化的敏捷食酸菌72W細(xì)胞進(jìn)一步將由催化劑產(chǎn)生不期望的副產(chǎn)物(2-甲基戊二酸)的生產(chǎn)率減小至對熱處理過的細(xì)胞所發(fā)現(xiàn)的那樣，并且沒有可檢測的腈水合酶活性(參見實施例10)。申請人的公開是令人驚奇的和出乎意料的，因為此前U.S.5,814,508中要求的熱處理步驟不再是需要的。未知的是，在藻酸鹽中將敏捷食酸菌72W細(xì)胞固定化，接著進(jìn)行GA或GA/PEI-交聯(lián)，將選擇性地并且完全地滅活不期望的腈水合酶活性，同時不引起可檢測到的期望的腈水解酶活性的損失。這個結(jié)論是特別出人意料的，因為戊二醛滅活腈水解酶是公知的。
2-甲基戊二腈的水解選擇水解反應(yīng)的溫度使得反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性都最佳。反應(yīng)溫度范圍可以自剛高于懸浮液的凝固點(diǎn)(大約0℃)至60℃，反應(yīng)溫度的優(yōu)選范圍是5℃至35℃。通過將催化劑懸浮于蒸餾水中，或者反應(yīng)初始pH保持在5.0和10.0之間，優(yōu)選6.0和8.0之間的緩沖液水溶液中，可以制備固定化酶催化劑懸浮液。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)混合物的pH由于從二腈相應(yīng)的腈官能度形成羧酸的銨鹽而可以變化。不控制pH，或者在反應(yīng)過程中能加入合適的酸或堿以保持期望的pH，能夠進(jìn)行反應(yīng)完成二腈的轉(zhuǎn)化。以至少2mM的濃度向水解反應(yīng)加入鈣鹽，包括但不限于氯化鈣或醋酸鈣，以保持交聯(lián)固化的酶催化劑的物理完整性。
通過用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH在2.0和2.5之間，用氯化鈉飽和得到的溶液，并且用合適的有機(jī)溶劑(例如乙酸乙酯，乙醚，或二氯甲烷)萃取4-氰基戊酸，也可以從產(chǎn)物混合物(去除催化劑之后)分離出4-氰基戊酸。然后合并有機(jī)提取物，與合適的干燥劑(例如硫酸鎂)一起攪拌，過濾，并且去除溶劑(例如，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，以高產(chǎn)率和高純度(一般98-99％純)制備期望的產(chǎn)物。如果期望，通過重結(jié)晶或蒸餾能進(jìn)一步純化產(chǎn)物?；蛘撸梢栽谝粋€接著發(fā)生的反應(yīng)中直接使用4-氰基戊酸銨鹽，如1，5-二甲基-2-哌啶酮的制備情況一樣(U.S.5,814,508及其部分專利U.S.5,858,736，U.S.5,908,954，U.S.5,922,589，U.S.5,936,114，U.S.6,077,955和U.S.6,066,490)。
實施例在下面的實施例中，它們是為了進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，2-甲基戊二腈的回收率％和微生物水解反應(yīng)期間形成的水解產(chǎn)物4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的產(chǎn)率％以反應(yīng)混合物中存在的2-甲基戊二腈的初始量為基礎(chǔ)(除非另有說明)，并且利用折射指數(shù)檢測器和Supelcosil LC-18-DB柱(15cm×4.6mm直徑)通過HPLC檢測，洗脫劑由10mM乙酸，10mM醋酸鈉，和7.5％(v/v)甲醇水溶液構(gòu)成。
縮寫意義如下″sec″意思是秒，″min″意思是分鐘，″h″意思是小時，″d″意思是天，″μL″意思是微升，″mL″意思是毫升，″L″意思是升，″mm″意思是毫米，″nm″意思是納米，″mM″意思是毫摩爾，″M″意思是摩爾，″mmol″意思是毫摩爾，″μmole″意思是微摩爾，″g″意思是克，″μg″意思是微克，″ng″意思是納克，″U″意思是單位，和″dcw″意思是細(xì)胞干重。
實施例1用戊二醛滅活敏捷食酸菌72W腈水解酶實施例1詳細(xì)描述戊二醛對腈水解酶活性的毒性。
從細(xì)胞提取液分離出敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈水解酶，并且通過Q-Sepharose離子交換介質(zhì)接著在Hiload 16/60Superdex 200柱子上凝膠過濾，精制達(dá)＞90％純度。在純化過程中通過監(jiān)測芐腈轉(zhuǎn)化為苯甲酸的速率監(jiān)測腈水解酶活性，如根據(jù)100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中5mM芐腈溶液在245nm下吸收度的增加所指示的。純化過的酶的腈水解酶活性是25.7U/mg蛋白質(zhì)。當(dāng)在戊二醛(0.10M)存在下進(jìn)行酶分析時，腈水解酶的比活性降低至6.65U/mg，酶活性損失74％。
實施例2敏捷食酸菌72W在藻酸鈣中的固定化作用實施例2詳細(xì)描述未交聯(lián)的和GA/PEI-交聯(lián)的藻酸鈣中敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞的固定化作用。
快速攪拌下，向裝有磁性攪拌棒并且含有50℃的22.9g蒸餾過的去離子水的100-mL培養(yǎng)瓶中緩慢加入1.10g的FMC BioPolymerProtanalLF 10/60藻酸鹽?？焖贁嚢柘聦⒒旌衔锛訜嶂?5-80℃直到藻酸鹽完全溶解，并且在水浴中將得到的溶液冷卻至25℃。將0.15M乙酸鈉緩沖液(16mL總體積，pH7.0)中敏捷食酸菌72W的懸浮液(50％細(xì)胞濕重，11.5％細(xì)胞干重)加熱至50℃15分鐘，然后冷卻至25℃，并且在攪拌下加至25℃的藻酸鹽溶液。在攪拌下用注射器將細(xì)胞/藻酸鹽混合物滴加至213mL的25℃的0.20M醋酸鈣緩沖液(pH7.0)。攪拌2h之后，從得到的小球傾析出緩沖液，將它重新懸浮于25℃的84mL of 0.20M醋酸鈣緩沖液(pH7.0)。攪拌下，加入0.88g的25wt％戊二醛(GA)水溶液，并且在25℃下混合小球1.0h。然后向懸浮液加入3.5g的12.5wt％聚吖丙啶(PEI)(BASF Lupasol＜b PR971 L，重均分子量大約750,000)水溶液，在25℃下再混合小球1h。然后用25℃的84mL的0.20M醋酸鈣緩沖液(pH7.0)將交聯(lián)的小球洗滌兩次，在5℃下在相同的緩沖液中貯存。
通過上述方法制備沒有交聯(lián)的小球，除了不向0.20M醋酸鈣緩沖液中的小球懸浮液加入GA和PEI。
實施例3用干制備4-氰基戊酸的未交聯(lián)和GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W細(xì)胞/藻酸鹽小球催化劑之比較實施例3詳細(xì)描述在連續(xù)間歇式反應(yīng)中GA/PEI-交聯(lián)催化劑小球比沒有交聯(lián)的小球以更高收率產(chǎn)生4-氰基戊酸。
向獨(dú)立的兩個125-mL夾套反應(yīng)器(用循環(huán)溫度浴將溫度控制在30℃)加入16.5g的未交聯(lián)的或者根據(jù)實施例2所述制備的GA/PEI-交聯(lián)的敏捷食酸菌72W細(xì)胞/藻酸鹽小球。向各反應(yīng)器加入68.25 mL蒸餾過的去離子水，1.0mL的0.50M醋酸鈣緩沖液(pH7.0，反應(yīng)混合物中最終鈣離子濃度是5.0mM)和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二醛，并且在30℃下攪拌混合物。反應(yīng)混合物樣品(0.100mL)與0.400mL的水混合，然后將0.360mL稀釋的樣品與水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外標(biāo))和0.020mL的6.0N HCl混合。過濾各容器中的得到的混合物(0.22μm)，并且用HPLC對濾液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。對于未交聯(lián)的和GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W細(xì)胞/藻酸鹽小球，4-氰基戊酸的制備速率分別是193mM/h和198mM/h。2-甲基戊二腈完全轉(zhuǎn)化時，在各反應(yīng)器中，4-氰基戊酸銨鹽和2-甲基戊二酸二銨鹽的產(chǎn)率一般分別是98.5％和1.5％。
反應(yīng)結(jié)束時，從催化劑小球傾析出產(chǎn)物混合物。在如上所述條件下這些小球又在11次連續(xù)間歇式反應(yīng)中重新使用。如表1所示，對于未交聯(lián)的和GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W細(xì)胞/藻酸鹽小球來說，反應(yīng)12中4-氰基戊酸的制備速率分別是64mM/h和118mM/h。每套11次循環(huán)反應(yīng)完全時，4-氰基戊酸的最終濃度至少是1,550mM。
表1
實施例4鈣離子濃度對用于制備4-氰基戊酸的GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W細(xì)胞/藻酸鹽小球催化劑的影響實施例4詳細(xì)描述在高濃度銨離子存在下制備GA/PEI-交聯(lián)藻酸鹽小球催化劑能更穩(wěn)定。這項發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有技術(shù)相反(Klein，J.和Vorlop，K.D.，生物技術(shù)聚焦1(In Biotechnology Focus 1)；Finn，R.F.，編著；牛津大學(xué)出版社New York；1998，pp 325-336)。
分別向三個125-mL夾套反應(yīng)器(用循環(huán)溫度浴將溫度控制在30℃)加入16.5g如實施例2所述制備的GA/PEI-交聯(lián)的敏捷食酸菌72W細(xì)胞/藻酸鹽小球。向各反應(yīng)器加入68.25mL蒸餾過的去離子水，和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二腈。然后向三種反應(yīng)混合物的每一種分別加入a)1.0mL的0.50M醋酸鈣緩沖液(pH7.0)，b)0.20M醋酸鈣(pH7.0)，或c)蒸餾水，使得三種反應(yīng)混合物中最終鈣離子濃度分別是5.0mM，2.0mM，或0mM。在30℃下攪拌混合物。反應(yīng)混合物樣品(0.100mL)與0.400mL的水混合，然后0.360mL稀釋的樣品與水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外標(biāo))和0.020mL的6.0N HCl混合。過濾得到的混合物(0.22μm)，并且用HPLC對濾液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。含有5mM，2mM，或0mM鈣離子的反應(yīng)中4-氰基戊酸的制備速率分別是236mM/h，233mM/h，和232mM/h。
2-甲基戊二腈完全轉(zhuǎn)化之后，從催化劑小球傾析出產(chǎn)物混合物。測定催化劑重量并且在如上所述條件下這些小球又在10次連續(xù)間歇式反應(yīng)中重新使用。各組循環(huán)反應(yīng)中，2-甲基戊二腈完全轉(zhuǎn)化之后，4-氰基戊酸的最終濃度至少是1,550mM，由于從前面的反應(yīng)保留了反應(yīng)剩余物(催化劑加產(chǎn)物混合物)。表2給出了各組反應(yīng)中回收的催化劑的重量。
表2
重復(fù)上述一套三個反應(yīng)，除了三個反應(yīng)混合物中醋酸鈣的濃度分別是2.0mM，1.0mM，和0.5mM。在用催化劑再循環(huán)又進(jìn)行10次反應(yīng)之后，含有0.5mM醋酸鈣的反應(yīng)中的催化劑小球破碎，反應(yīng)混合物含有顯著量的顆粒物質(zhì)。含有1.0mM醋酸鈣的反應(yīng)中的催化劑小球在催化劑再循環(huán)的第十二次反應(yīng)中開始破碎，18次反應(yīng)之后催化劑破碎并且反應(yīng)混合物含有顯著量的顆粒物質(zhì)。含有2.0mM醋酸鈣的反應(yīng)中的催化劑小球不破碎，用催化劑再循環(huán)進(jìn)行60次之多的連續(xù)反應(yīng)之后，反應(yīng)混合物中沒有顯著產(chǎn)生顆粒物質(zhì)，。
實施例5大腸桿菌轉(zhuǎn)化體SS1001細(xì)胞在角叉菜膠中的固定化作用實施例5詳細(xì)描述大腸桿菌轉(zhuǎn)化體SS1001(ATCC PTA-1177)細(xì)胞在角叉菜膠中的固定化作用。
快速攪拌下向250-mL培養(yǎng)瓶(裝有磁性攪拌棒并且含有50℃的64.12g蒸餾過的去離子水)緩慢加入3.38g的FMC BioPolymerISAGELRG 300角叉菜膠?？焖贁嚢柘聦⒒旌衔锛訜嶂?5-80℃，直到角叉菜膠完全溶解，在自動調(diào)溫器水浴中將得到的溶液冷卻至55-56℃(凝膠化溫度大約52℃)。將0.35M磷酸氫鈉緩沖液(45mL總體積，pH7.3)中大腸桿菌轉(zhuǎn)化體SS1001(ATCC PTA-1177)的懸浮液(12.5％細(xì)胞干重)加熱至50℃12分鐘，然后攪拌下加至55-56℃的角叉菜膠溶液。使用高架的攪拌器在攪拌下將細(xì)胞/角叉菜膠混合物立即緩慢加至50℃的450mL豆油中。通過控制攪拌速率在油中產(chǎn)生期望大小的細(xì)胞/角叉菜膠液滴之后，將油的溫度降至35℃使液滴凝膠化，從得到的小球傾析出油，將其用0.10M碳酸氫鉀緩沖液(pH7.3)洗滌。將小球的20-克部分重新懸浮于48.8mL的0.10M碳酸氫鉀緩沖液(pH7.3)中，并且加入水中0.25g的25wt％戊二醛，并且在25℃下將小球混合1.0h。然后向混合物加入水中1.0g的12.5wt％聚吖丙啶(BASF Lupasol PR971 L，重均分子量大約750,000)，小球在25℃下再混合1小時。然后用50mL的0.30M碳酸氫銨(pH7.3)在25℃下洗滌交聯(lián)的小球，并且在5℃下在相同的緩沖液中貯存。
實施例6用于制備4-氰基戊酸的未交聯(lián)和GA/PEI-交聯(lián)大腸桿菌SS1001/角叉菜膠小球催化劑之比較實施例6詳細(xì)描述在連續(xù)間歇式反應(yīng)中GA/PEI-交聯(lián)角叉菜膠小球比沒有交聯(lián)的小球以更高生產(chǎn)率產(chǎn)生4-氰基戊酸。
向獨(dú)立的兩個125-mL夾套反應(yīng)器(用循環(huán)溫度浴將溫度控制在30℃)加入12.375g的未交聯(lián)的或者根據(jù)實施例6所述制備的GA/PEI-交聯(lián)的大腸桿菌SS1011(ATCC PTA-1177)/角叉菜膠小球。向各反應(yīng)器加入51.9mL蒸餾過的去離子水，其中含有20mM碳酸鉀緩沖液(pH7.0)和10.71mL(10.17g，1.25M)的2-甲基戊二醛，并且在30℃下攪拌各混合物。反應(yīng)混合物樣品(0.100mL)與0.400mL的水混合，然后0.360mL稀釋的樣品與水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外標(biāo))和0.020mL的6.0N HCl混合。過濾得到的混合物(0.22μm)，并且通過HPLC對濾液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。對于未交聯(lián)的和GA/PEI-交聯(lián)大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)/角叉菜膠小球，4-氰基戊酸的制備速率分別是254mM/h和310mM/h。2-甲基戊二腈完全轉(zhuǎn)化時，在各反應(yīng)器中，4-氰基戊酸銨鹽和2-甲基戊二酸二銨鹽的產(chǎn)率一般分別是98.8％和1.2％ 。
反應(yīng)結(jié)束時，從催化劑小球傾析出產(chǎn)物混合物。在如上所述條件下這些催化劑小球又在11次連續(xù)間歇式反應(yīng)中重新使用。表3說明對于未交聯(lián)的和GA/PEI-交聯(lián)大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)/角叉菜膠小球來說，反應(yīng)4中4-氰基戊酸的制備速率分別是120mM/h和290mM/h。
表3
實施例7敏捷食酸菌72W細(xì)胞在角叉菜膠中的固定化作用實施例7詳細(xì)描述敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞在角叉菜膠中的固定化作用。
快速攪拌下，向(裝有磁性攪拌棒并且含有50℃的64.12g蒸餾過的去離子水的)250-mL培養(yǎng)瓶中緩慢加入3.38g的FMC BioPolymerISAGELGR 300角叉菜膠。快速攪拌下將混合物加熱至75-80℃直到角叉菜膠完全溶解，并且在自動控制溫度水浴中將得到的溶液冷卻至55-56℃(凝膠化溫度大約52℃)。將0.35M磷酸氫鈉緩沖液(45mL總體積，pH7.3)中的敏捷食酸菌72W細(xì)胞的懸浮液(12.5％細(xì)胞干重)加熱至50℃60分鐘，然后在攪拌下加至55-56℃的角叉菜膠溶液。使用高架的攪拌器在攪拌下將細(xì)胞/角叉菜膠混合物立即緩慢加至50℃的450mL豆油中。通過控制攪拌速率在油中產(chǎn)生期望大小的細(xì)胞/角叉菜膠液滴之后，將油的溫度降至35℃使液滴凝膠化，從得到的小球傾析出油，將其用0.10M碳酸氫鉀緩沖液(pH7.3)洗滌。將小球的20-克部分重新懸浮于48.8mL的0.10M碳酸氫鉀緩沖液(pH7.3)中，并且加入水中0.25g的25wt％戊二醛，并且在25℃下將小球混合1.0h。然后向混合物加入水中1.0g的12.5wt％聚吖丙啶(BASFLupasol PR971 L，重均分子量大約750,000)，小球在25℃下再混合1小時。然后用50mL of 0.30M碳酸氫銨(pH7.3)在25℃下洗滌交聯(lián)的小球，并且在5℃下在相同的緩沖液中貯存。
也用0.30M碳酸氫銨(pH7.3)在25℃下洗滌沒有加入戊二醛的沒有交聯(lián)的小球，并且在5℃下在相同的緩沖液中貯存。
實施例8制備4-氰基戊酸的未交聯(lián)和GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W/角叉菜膠小球催化劑之比較實施例8詳細(xì)描述在連續(xù)間歇式反應(yīng)中GA/PEI-交聯(lián)角叉菜膠小球比沒有交聯(lián)的小球以更高生產(chǎn)率產(chǎn)生4-氰基戊酸。
向獨(dú)立的兩個125-mL夾套反應(yīng)器(用循環(huán)溫度浴將溫度控制在30℃)加入16.5g的未交聯(lián)的或者根據(jù)實施例7所述制備的GA/PEI-交聯(lián)的敏捷食酸菌72W/角叉菜膠小球。向各反應(yīng)器加入72.1mL蒸餾過的去離子水，其中含有50mM碳酸鉀緩沖液(pH7.0)和11.40mL(10.83g，1.0M)的2-甲基戊二醛，并且在30℃下攪拌混合物。反應(yīng)混合物樣品(0.100mL)與0.400mL的水混合，然后0.360mL稀釋的樣品與水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外標(biāo))和0.020mL的6.0N HCl混合。過濾得到的混合物(0.22μm)，并且通過HPLC對濾液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。對于未交聯(lián)的和GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W/角叉菜膠小球，4-氰基戊酸的制備速率分別是266mM/h和235mM/h。2-甲基戊二腈完全轉(zhuǎn)化時，在各反應(yīng)器中，4-氰基戊酸銨鹽和2-甲基戊二酸二銨鹽的收率分別是98.5％和1.5％。
反應(yīng)結(jié)束時，從催化劑小球傾析出產(chǎn)物混合物。如上所述又在9次連續(xù)間歇式反應(yīng)中重新使用催化劑小球。表4說明對于未交聯(lián)的和GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W/角叉菜膠小球來說，反應(yīng)9中4-氰基戊酸的制備速率分別是144mM/h和200mM/h。
表4
實施例9在GA/PEI-交聯(lián)藻酸鹽或角叉菜膠小球中固定化的敏捷食酸菌72W細(xì)胞作為制備4-氰基戊酸的催化劑之比較實施例9詳細(xì)描述腈水解酶的比活性隨著藻酸鹽小球催化劑中細(xì)胞干重濃度的增加而提高，但是在角叉菜膠小球催化劑中則不是這樣。
向獨(dú)立的兩個125-mL夾套反應(yīng)器加入a)16.5g固定化敏捷食酸菌72W催化劑小球和68.25g蒸餾過的去離子水，或者b)22g固定化敏捷食酸菌72W催化劑小球和62.75g蒸餾過的去離子水。催化劑選自GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W細(xì)胞/藻酸鹽小球(根據(jù)實施例2描述的方法制備)或GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W細(xì)胞/角叉菜膠小球(根據(jù)實施例5描述的方法制備)。用5％細(xì)胞干重(dcw)或7.5％dcw捷食酸菌72W細(xì)胞制備催化劑小球。對于7.5％dcw催化劑小球，用來交聯(lián)小球使用的GA和PEI的量增加兩倍，來制備完全交聯(lián)的催化劑。向各反應(yīng)器立即加入1.0mL的0.20M醋酸鈣緩沖液(pH7.0)和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二腈，并且在30℃或35℃下攪拌各反應(yīng)混合物，同時用循環(huán)溫度浴保持溫度。反應(yīng)混合物樣品(0.100mL)與0.400mL的水混合，然后0.360mL稀釋的樣品與水中0.040mL的0.75MN-甲基丙酰胺(HPLC外標(biāo))和0.020mL的6.0N HCl混合。過濾得到的混合物(0.22μm)，并且通過HPLC對濾液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。表5列出在相同的反應(yīng)條件下使用兩種催化劑在反應(yīng)進(jìn)行中4-氰基戊酸制備的反應(yīng)速率和催化劑比活性表5
實施例104-氰基戊酸(銨鹽)的制備實施例10詳細(xì)說明在藻酸鹽中固定化敏捷食酸菌72W去除大約90％的不期望的腈水合酶活性。另外，GA或GA/PEI的加入去除附加的不期望的腈水合酶活性。制備4-氰基戊酸的現(xiàn)有技術(shù)要求對細(xì)胞的熱處理步驟以去除不期望的腈水合酶活性(上文所述U.S.5,814,508和它的部分專利)。
重復(fù)實施例2中的程序，制備三種分開的敏捷食酸菌72W/藻酸鹽小球催化劑，除了在與藻酸鹽溶液混合之前不在50℃下將敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞懸浮液熱處理15分鐘。在固定化作用之前使用0.3M 2-甲基戊二腈在25℃下測定細(xì)胞的腈水解酶和腈水合酶/酰胺酶活性，2-甲基戊二酸(2-MGA，細(xì)胞的腈水合酶/酰胺酶活性的產(chǎn)物)的制備速率是4-氰基戊酸(4-CPA)的制備速率的34％。關(guān)于根據(jù)實施例2所述制備的加熱過的細(xì)胞懸浮液來說，2-甲基戊二酸的制備速率一般是4-氰基戊酸的制備速率的1.5％。對于三組制備的催化劑，1)一組敏捷食酸菌72W/藻酸鹽小球沒有用GA或PEI交聯(lián)，2)第二組只用GA交聯(lián)，3)第三組用GA和PEI交聯(lián)。
向三個分開的125-mL夾套反應(yīng)器(用循環(huán)溫度浴將溫度控制在35℃)加入16.5g的如上所述制備的三種催化劑之一。然后向各反應(yīng)器加入68.25mL蒸餾過的去離子水，1.0mL的0.20M 醋酸鈣緩沖液(pH7.0，反應(yīng)混合物中最終鈣離子濃度是2.0mM)和14.25mL(13.54g，1.25M)的2-甲基戊二腈，并且在35℃下攪拌混合物。反應(yīng)混合物樣品(0.100mL)與0.400mL的水混合，然后0.360mL稀釋的樣品與水中0.040mL的0.75M N-甲基丙酰胺(HPLC外標(biāo))和0.020mL的6.0N HCl混合。過濾得到的混合物(0.22μm)，并且通過HPLC對各濾液分析2-甲基戊二腈，4-氰基戊酸，和2-甲基戊二酸。使用沒有GA或PEI交聯(lián)的敏捷食酸菌72W/藻酸鹽小球的2-甲基戊二酸的制備速率是4-氰基戊酸的制備速率的3.6％，降低34％(表6)。只有GA交聯(lián)的敏捷食酸菌72W/藻酸鹽小球的2-甲基戊二酸的制備速率是4-氰基戊酸的制備速率的1.7％，使用GA和PEI交聯(lián)的敏捷食酸菌72W/藻酸鹽小球的2-甲基戊二酸的制備速率是4-氰基戊酸的制備速率的1.5％。
表6
實施例11用于4-氰基戊酸制備的GA/PEI-交聯(lián)大腸桿菌SS1001/藻酸鹽小球催化劑在反應(yīng)混合物中使用2mM醋酸鈣，使用用于4-氰基戊酸制備的GA/PEI-交聯(lián)大腸桿菌SS1001/藻酸鹽小球催化劑重復(fù)其中使用GA/PEI-交聯(lián)敏捷食酸菌72W SS1001小球催化劑的實施例3中的反應(yīng)。
195次連續(xù)催化劑再循環(huán)之后，反應(yīng)速率是初始反應(yīng)速率的67％，催化劑小球的物理完整性沒有顯著損失。
權(quán)利要求
1.一種制備羧酸的方法，包括a)在藻酸鹽中將特征在于腈水解酶活性的酶催化劑固定化；b)向步驟a)的固定化酶催化劑加入第一種穩(wěn)定劑，之后加第二種穩(wěn)定劑，各自是以足夠交聯(lián)固定化酶催化劑的量和時間，第一種穩(wěn)定劑和第二種穩(wěn)定劑分別選自戊二醛和聚吖丙啶，前提是第二種穩(wěn)定劑是除了第一種穩(wěn)定劑之外的；c)在合適的含水反應(yīng)混合物中使步驟b)的產(chǎn)物接觸腈；和d)分離鹽形式或酸形式的步驟c)中制備的羧酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)的腈是2-甲基戊二腈；步驟c)的含水反應(yīng)混合物在反應(yīng)期間具有大于20∶1的NH4+∶Ca2+之比；并且步驟d)中分離出的羧酸是4-氰基戊酸。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述酶催化劑是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)，敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)，大腸埃希氏桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)，或大腸埃希氏桿菌SW91(ATCC PTA-1175)，并且酶催化劑是全細(xì)胞或可滲透微生物細(xì)胞形式。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述酶催化劑是敏捷食酸菌72W(ATCC55746)，并且其中在藻酸鹽中固定化之前不加熱滅活酶催化劑的腈水合酶活性。
5.權(quán)利要求1和2的方法，其中所述藻酸鹽是藻酸鈣。
6.權(quán)利要求1和2的方法，其中在反應(yīng)過程中步驟c)的含水反應(yīng)混合物具有至少200∶1的NH4+∶Ca2+之比，并且鈣離子濃度至少是2mM。
7.一種制備4-氰基戊酸的方法，包括a)在藻酸鈣中將全細(xì)胞形式或可滲透微生物細(xì)胞形式的選自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)，敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)，大腸埃希氏桿菌SS1001(ATCCPTA-1177)，或大腸埃希氏桿菌SW91(ATCC PTA-1175)的酶催化劑固定化；b)向步驟a)的固定化酶催化劑加入第一種穩(wěn)定劑，之后加第二種穩(wěn)定劑，各自是以足夠交聯(lián)固定化酶催化劑的量和時間，第一種穩(wěn)定劑和第二種穩(wěn)定劑分別選自戊二醛和聚吖丙啶，前提是第二種穩(wěn)定劑是除了第一種穩(wěn)定劑之外的；c)在合適的含水反應(yīng)混合物中使步驟b)的產(chǎn)物接觸2-甲基戊二腈，反應(yīng)期間， 混合物中NH4+∶Ca2+之比大于20∶1；和d)分離鹽形式或酸形式的步驟c)中制備的4-氰基戊酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述酶催化劑是敏捷食酸菌72W(ATCC55746)，并且其中在藻酸鹽中固定化之前不加熱滅活酶催化劑的腈水合酶活性。
9.權(quán)利要求1或8的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)步驟(c)和(d)。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用腈水解酶催化劑從相應(yīng)的腈制備羧酸的改進(jìn)的方法。更具體地，本發(fā)明使用具有腈水解酶活性的，在藻酸鹽中固定化的，并且用戊二醛和聚吖丙啶交聯(lián)的酶催化劑在水溶液中將2－甲基戊二腈轉(zhuǎn)化為4－氰基戊酸。
文檔編號C12N1/04GK1547609SQ02803989
公開日2004年11月17日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月22日
發(fā)明者R·迪科西莫, R·D·法倫, J·E·加瓦甘, R 迪科西莫, 加瓦甘, 法倫 申請人:納幕爾杜邦公司