專利名稱：改進(jìn)的熒光蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型“綠色熒光蛋白”及其應(yīng)用。特別地，本發(fā)明涉及特殊的GFP及其變體，這種變體是明亮且無毒的。
背景技術(shù)：
綠色熒光蛋白(GFP)最初由Chalfie分離自Aequorea Victoria，美國專利5,491,084。Ward和Chalfie在PCT公布WO 95/21191中報道對其氨基酸序列作了修飾以增加其亮度。如美國專利5,625,048和5,777,079所揭示，Tsien提供了這種蛋白質(zhì)經(jīng)過改進(jìn)的形式，它具有不同的光譜特征并可提供各種不同顏色的熒光。此外，對編碼這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列做了修飾以使其序列與人類細(xì)胞相容。此外，公布于1999年9月30日PCT公布WO 99/49019提供了一些與綠色熒光蛋白有關(guān)的序列信息，這些綠色熒光蛋白由分離自Renilla和Ptilocarpus的基因表達(dá)。Gurskaya，N.G.等，BMC Biochem(2002)25描述了一種突變體，這種突變體改變了來自珊瑚的熒光蛋白的發(fā)射光譜。
上述文件證實了蛋白質(zhì)氨基酸序列中的變化，這種蛋白質(zhì)在波長短于可提供一定顏色選擇和強(qiáng)度范圍的熒光波長的照射激發(fā)下產(chǎn)生熒光，在此將這些文件全文并入以供參考。熒光蛋白在科學(xué)研究和新項目制造(如玩具)中都有廣泛應(yīng)用。由于對熒光的唯一要求是用適當(dāng)波長照射，并且由于熒光是肉眼可見的，這些蛋白質(zhì)被證明是方便的標(biāo)記并有令人鼓舞的意想不到的應(yīng)用。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)熒光蛋白其它的變體有改進(jìn)的亮度并具有低毒性。這些蛋白質(zhì)還可被修飾以得到各種顏色的熒光并改變其強(qiáng)度。
發(fā)明概述發(fā)明涉及組合物和使用熒光蛋白的方法，所述熒光蛋白與

圖1B所示的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)同源。與已知的熒光蛋白相比，示例性的GFP包括保守性取代基和一些可使其在N-末端部分酸性減弱但在C-末端部分酸性增強(qiáng)的取代基。本發(fā)明涉及與一組變體有關(guān)的組合物和方法，所述變體在接近序列一半的N-末端酸性減弱同時在接近序列一半的C-末端酸性增強(qiáng)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)是無毒的，含有它們的細(xì)胞可存活至少4周-3，4或6個月。
因此，一方面，本發(fā)明涉及變體蛋白質(zhì)本身并涉及使用這些變體的方法。另一方面，本發(fā)明涉及編碼所述變體的重組物質(zhì)和用這些物質(zhì)制造所述變體的方法，以及關(guān)于這些重組物質(zhì)本身的其它應(yīng)用。
附圖簡述圖1A顯示了推出的在這里稱為A/C的本發(fā)明變體的氨基酸序列。圖1B顯示了假定分離自R.reniformis的核酸的核苷酸序列，所述核酸編碼圖1A的氨基酸序列。
圖2A、2B和2C顯示了基于圖1B的核苷酸序列的核苷酸序列，它經(jīng)過修飾以分別與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium bongum)優(yōu)選使用的密碼子一致。
圖3顯示了標(biāo)示為A/C的本發(fā)明變體的氨基酸序列與綠色熒光蛋白的氨基酸序列的比較，所述綠色熒光蛋白克隆自R.mulleri。
圖4A和4B顯示了用來在各種腫瘤細(xì)胞系中制造所述變體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的示意圖。所述載體被用來包裝細(xì)胞，所得病毒粒子被用來感染腫瘤細(xì)胞系。
圖5A-5C顯示了包裝細(xì)胞系PT67、黑色素瘤細(xì)胞系B16F0和前列腺癌細(xì)胞系PC3中表達(dá)的熒光蛋白的圖象。
圖6A-6D顯示了生長自肺癌細(xì)胞系H460、前列腺癌細(xì)胞系PC3、胰腺癌細(xì)胞系CAPAN-1和結(jié)腸癌細(xì)胞系PKO的腫瘤的圖象。
圖7A和7B顯示了編碼來自珊瑚的熒光蛋白第289-964位的核苷酸序列。
具體實施方案提供了改進(jìn)的“綠色熒光蛋白”(GFP)和編碼它們的重組物質(zhì)。這樣可使用明亮、無毒的標(biāo)記以監(jiān)測基因表達(dá)、標(biāo)記各種細(xì)胞以及監(jiān)測如PCT公布WO 98/49336所述的轉(zhuǎn)移的過程，在此將其并入有關(guān)參考。所述本發(fā)明改進(jìn)的熒光蛋白提供了更敏感的評估這些現(xiàn)象的方法，且對細(xì)胞和整個生物無毒。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)在許多領(lǐng)域都有用，這些領(lǐng)域已知使用上述GFP已知形式的方法。一般GFP的制造和重組材料的使用以及所述GFP本身是此領(lǐng)域熟知的，有許多描述這種熒光蛋白先前已知形式的文獻(xiàn)。
圖1A所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，這里稱為A/C，發(fā)射綠色熒光并有上述亮度和無毒特性。然而，如此領(lǐng)域已知，這些“綠色”熒光蛋白可被修飾，這樣它們可發(fā)出各種顏色的可見光譜的熒光。因此，通過適當(dāng)修飾圖1A所列蛋白質(zhì)的氨基酸序列，也可得到紅色、黃色、藍(lán)色或其它顏色的熒光。此外，通過使所述氨基酸序列做出小的改變所述熒光的亮度可調(diào)節(jié)。這些修飾的本性描述在有益的描述在，例如，美國專利5,777,079中，在此將其并入以供參考。如上所述，對在A/C序列第66位發(fā)現(xiàn)的絲氨酸殘基的修飾可被丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或蘇氨酸替代以得到具有紅色移位光譜(shifted spectra)的蛋白質(zhì)，與未經(jīng)修飾的A/C相比，這種光譜通常比較明亮。其它可影響亮度或熒光波長的修飾包括在第67位發(fā)生的那些。所述發(fā)色團(tuán)似乎幾種在A/C蛋白質(zhì)第66-68位，它相應(yīng)于’079專利所述Aequorea野生型GFP蛋白質(zhì)第65-67位。因此，第66-68位的突變對于蛋白質(zhì)性質(zhì)的改進(jìn)特別重要。
因此，本發(fā)明包括在第66-68位中任一位尤其是在第66位上具有取代基的突變體其它對分子中1-4個氨基酸的修飾也是允許的；很小數(shù)量這種類型的突變不足以將A/C的氨基酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)槿魏我阎摹熬G色熒光蛋白”的氨基酸序列，且對所述分子的性質(zhì)有極小的影響。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括與圖1A所示的氨基酸序列至少有90％同源，優(yōu)選有95％同源，最優(yōu)選有99％同源的熒光蛋白。特別優(yōu)選的是具有圖1A所示氨基酸序列的熒光蛋白及其變體，所示變體在第66-68位，最好在第66位至少有一個氨基酸取代。同樣優(yōu)選的是上述那些來自珊瑚的蛋白質(zhì)的經(jīng)過修飾的類似物，如Gurskaya所示，已在上面引用。
編碼本發(fā)明熒光蛋白變體的核苷酸序列可被各種細(xì)胞表達(dá)。適合由重組系統(tǒng)制造蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)在通常是真核細(xì)胞、原核細(xì)胞，如酵母和真菌、高等植物、動物細(xì)胞(包括脊椎動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞，尤其是人類細(xì)胞)，和各種細(xì)胞系。合適的表達(dá)系統(tǒng)和載體取決于宿主的本性和所需應(yīng)用。除了提供合適的表達(dá)系統(tǒng)，所示核苷酸序列可被修飾以將其轉(zhuǎn)變?yōu)樗杷拗鲀?yōu)選使用的密碼子。因此，圖1B所示的核苷酸序列可含有一個或多個圖2A、2B和2C所示的修飾以在指出的宿主中表達(dá)，這些宿主分別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium bongum)。因此，為在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)的序列可包含1-230個沉默堿基改變；為在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)的序列可包含1-94個沉默堿基改變；為在長雙歧桿菌(Bifidobacterium bongum)中表達(dá)的序列可包含1-21個堿基改變。所有中間數(shù)目的堿基改變也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的熒光蛋白和編碼它們的重組物質(zhì)可用于廣泛應(yīng)用，如上面提到的PCT公布WO 99/49019中詳細(xì)列出的那些，在此將其并入以供參考。所述公布描述了許多應(yīng)用，包括分析、研究、診斷和商業(yè)應(yīng)用。
因此，制造本發(fā)明熒光蛋白的目的可以是獲得所示蛋白質(zhì)本身以用于各種組合物和加工物品。這些熒光蛋白可用于各種項目，如玩具、玩偶、牌類游戲、油漆、織物、氣球、化妝品和食物或任何其它設(shè)計可發(fā)光的物品或組合物。可制造所述蛋白質(zhì)自身以摻入這些物品和組合物。本發(fā)明的熒光蛋白也可和其它可發(fā)出熒光或發(fā)光的物質(zhì)如螢光素酶結(jié)合。’019公布描述了一些組合物，其中其它發(fā)光生物物質(zhì)與熒光蛋白一起結(jié)合在同一組合物中，這樣除了被外部照射有效激發(fā)，照射波長由發(fā)光組合物質(zhì)在原位產(chǎn)生。
綠色熒光蛋白更重要的應(yīng)用在于其作為研究工具的價值。在一個實施方案中，本發(fā)明的熒光蛋白可融合或結(jié)合到導(dǎo)向植物或動物靶組織的抗體中。例如，可用它來標(biāo)記動物中的腫瘤然后通過使熒光標(biāo)記與腫瘤結(jié)合來追蹤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明熒光蛋白可作為能以組織或細(xì)胞為目標(biāo)的部分的共軛物被制備。典型的尋靶部分是組織或細(xì)胞上所呈現(xiàn)物質(zhì)的特異性結(jié)合伴侶。典型的尋靶部分是抗體和受體的配體。
或者，含有綠色熒光蛋白的融合蛋白產(chǎn)品可用來監(jiān)測結(jié)合蛋白的表達(dá)。此外，如例如Yang，M.等，Cancer Res.(1998)584217-4221和Yang，M.等，Cancer Res.(1999)59731-736所述，以及如Hoffman，R.M.，Cancer & Metastasis Reviews(1999)17271-277所會綜述，熒光蛋白可在腫瘤中產(chǎn)生并被用來監(jiān)測轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的熒光蛋白還可被用來在免疫測定等實驗中標(biāo)記試劑。在一個實施例中，采用了夾層結(jié)構(gòu)(sandwich)測定，其中分析物的一個特異性結(jié)合伴侶是固定分析物的捕獲部分，第二特異性結(jié)合伴侶被用來標(biāo)記固定的分析物。本發(fā)明的熒光蛋白可直接被用作標(biāo)記結(jié)合伴侶或第二結(jié)合伴侶上的標(biāo)記，如用作第二抗體攜帶的標(biāo)記以與直接結(jié)合分析物的第一抗體結(jié)合。
通過使編碼蛋白質(zhì)的核酸序列與編碼本發(fā)明熒光蛋白的核苷酸序列融合也可監(jiān)測蛋白質(zhì)的表達(dá)。然后可通過監(jiān)測所制造的融合蛋白產(chǎn)生的熒光來監(jiān)測感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)。或者，可通過使編碼本發(fā)明熒光蛋白的核苷酸序列與啟動子或其它控制序列可操作連接來監(jiān)測啟動子或其它控制序列影響表達(dá)的能力。再者，通過制造熒光蛋白產(chǎn)生了熒光，由此說明表達(dá)控制是可操作的。
上述應(yīng)用僅僅是例舉說明。通常，發(fā)明的熒光蛋白可用于任何使用熒光標(biāo)記的應(yīng)用，包括測定修飾，如熒光偏振和熒光序列測定。本發(fā)明的熒光蛋白的其它優(yōu)點在于它可原位產(chǎn)生，因此它們的存在或不存在或量可被用作表達(dá)的指標(biāo)并在細(xì)胞內(nèi)提供內(nèi)部熒光源。因此，可用本發(fā)明的熒光蛋白追蹤腫瘤轉(zhuǎn)移的過程、細(xì)菌或病毒感染或是植物或動物內(nèi)任何類型細(xì)胞的移動。
以下實施例僅是為了闡述而不是限制本發(fā)明。
實施例1改進(jìn)的熒光蛋白的表達(dá)從Stratagene(圣地亞哥，加利福尼亞州)獲得了名為R.reniformis GFP的編碼具有如圖1A中A/C所示的氨基酸序列的熒光蛋白的核酸分子。編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列被鑒定并顯示在圖1B中。
通過沉默堿基取代所述核苷酸序列被按照圖2A-2C所述任選地修飾以最優(yōu)化其在各種宿主生物中的表達(dá)。
與所述熒光蛋白的氨基酸序列顯示在圖3A中，與其相比的是申請人認(rèn)為與其最相關(guān)的此領(lǐng)域的熒光蛋白。所述A/C蛋白質(zhì)與分離自R.mulleri的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有將近86％的同一性。標(biāo)出了這些蛋白質(zhì)的發(fā)色團(tuán)部分，A/C的第66-68位和R.mulleri的第65-67位。
圖1B的核苷酸序列被插入3’LTR啟動子控制的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(圖4A)。在該載體中，來自圖4B所示的pFB(Stratagene)，顯示了多個克隆位點。所得載體，稱為pFB-Rmv GFP，被用來修飾PT-67包裝細(xì)胞。所述包裝細(xì)胞被培養(yǎng)，由于GFP蛋白的產(chǎn)生從而產(chǎn)生了明亮的綠色信號。參見圖5A。高強(qiáng)度可保持10天以上，這說明GFP是無毒的。
實施例2制備表達(dá)A/C熒光蛋白的細(xì)胞系用在PT-67包裝細(xì)胞系中制備的被包裝的病毒粒子感染許多腫瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系有乳腺癌細(xì)胞系MX-1；前列腺癌細(xì)胞系MDA-PCA2B和PC3；胰腺癌細(xì)胞系CAPAN-1；結(jié)腸癌細(xì)胞系PKO；肉瘤細(xì)胞系MES-SA/DX5；肺癌細(xì)胞系H460、Lewis肺和A549以及黑色素瘤系B16F0。列出了其中的一些。這些細(xì)胞系發(fā)出的熒光列在圖5B(B16F0)和5C(PC3)中。所述熒光可保持?jǐn)?shù)周。
實施例3腫瘤標(biāo)記腫瘤是通過皮下注射無免疫應(yīng)答的小鼠由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系生長成的，并通過監(jiān)測熒光觀察腫瘤的發(fā)展情況。說明性的結(jié)果顯示在圖6A-6D中。
通過使用pFB-RWV GFP表達(dá)載體制造GFP細(xì)胞系
權(quán)利要求
1.一種含有圖1A的A/C蛋白質(zhì)的氨基酸序列的熒光蛋白或一種與所述A/C蛋白質(zhì)有至少90％同源性的熒光蛋白。
2.如權(quán)利要求1所示的熒光蛋白，其特征在于，它與圖1A的A/C蛋白質(zhì)有至少95％的同源性。
3.如權(quán)利要求2所示的熒光蛋白，其特征在于，它與圖1A的A/C蛋白質(zhì)至少有99％的同源性。
4.如權(quán)利要求1所示的熒光蛋白，其特征在于，它含有圖1A的A/C蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1所示的熒光蛋白，其特征在于，第66-68位中至少1個氨基酸被不同的氨基酸取代。
6.如權(quán)利要求5所示的熒光蛋白，其特征在于，所述第66位的氨基酸被取代。
7.一種核酸分子，其特征在于，所述氨基酸分子含有編碼權(quán)利要求1的熒光蛋白的核苷酸序列。
8.一種核酸分子，其特征在于，所述氨基酸分子含有編碼權(quán)利要求4的熒光蛋白的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求8所示的核酸分子，其特征在于，它含有圖1B所列的核苷酸序列，并任選地含有1或多個如圖2A、2B或2C所示的核苷酸取代基。
10.一種重組表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1的熒光蛋白的核苷酸序列，所述序列可操作地結(jié)合到控制序列以便表達(dá)。
11.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，它包括權(quán)利要求10的表達(dá)系統(tǒng)。
12.一種制造熒光蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求11的細(xì)胞，其中所述核酸序列被表達(dá)以制造所述熒光蛋白，以及任選地回收所述熒光蛋白。
13.與權(quán)利要求1的熒光蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。
14.一種包含與尋靶部分結(jié)合的權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的共軛物。
15.如權(quán)利要求14所述的共軛物，其特征在于，所述尋靶部分是抗體或受體的配體。
16.如權(quán)利要求10所述的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，所述編碼熒光蛋白的核苷酸序列與編碼其它蛋白質(zhì)的核苷酸序列融合。
17.監(jiān)控蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法，其特征在于，所述方法包括提供一表達(dá)系統(tǒng)，所述表達(dá)系統(tǒng)包括編碼所述蛋白質(zhì)的第一核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)與編碼權(quán)利要求1的熒光蛋白的第二核苷酸序列融合；將所述表達(dá)系統(tǒng)置于可監(jiān)測表達(dá)的環(huán)境中；并且評估熒光的產(chǎn)生，由此熒光的產(chǎn)生說明了所述蛋白質(zhì)的表達(dá)。
18.一種評價啟動子活性的方法，其特征在于，所述方法包括但不限于提供含有啟動子的核酸，所述啟動子可操作地連接到編碼權(quán)利要求1的熒光蛋白的核苷酸序列；將所述核酸置于可評估所述啟動子活性的環(huán)境中；監(jiān)測熒光的出現(xiàn)和量；其中所述熒光的出現(xiàn)和量說明了所述啟動子的活性。
19.一種標(biāo)記組織的方法，其特征在于，所述方法包括使所述組織與權(quán)利要求14的共軛物接觸，其中所述尋靶部分是所述組織特異的。
20.一種評估腫瘤的位置和進(jìn)展及其轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，所述方法包括修飾所述腫瘤以表達(dá)權(quán)利要求1的熒光蛋白，并觀察熒光的位置。
21.一種改進(jìn)的進(jìn)行免疫測定的方法，其特征在于，所述免疫測定包括將分析物或其類似物捕獲在夾層結(jié)構(gòu)上，所述夾層結(jié)構(gòu)包含與固體支持物結(jié)合的所述分析物的第一特異性結(jié)合伴侶和帶有標(biāo)記的第二特異性結(jié)合伴侶，其中所述改進(jìn)包括將權(quán)利要求1的熒光蛋白用作標(biāo)記。
全文摘要
揭示了具有高熒光性和低毒性的熒光蛋白的改進(jìn)形式。MVSKQILKNTGLQEIMSFKVNLEGVVNNHVFTMEGCGKGNILFGNQLVQIRVTKGAPLPFAFDILSPAFQYGNRTFTKYPEDISDFFIQSFPAGFVYERTLRYEDGGLVEIRSDINLIEEMFVYRVEYKGRNFPNDGPVMKKTITGLQPSFEVVYMNDGVLVGQVILVYRLNSGKFYSCHMRTLMKSKGVVKDFPEYHFIQHRLEKTYVEDGGFVEQHETAIAQLTSLGKPLGSLHEWV
文檔編號C12N15/12GK1549859SQ02804249
公開日2004年11月24日 申請日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月29日
發(fā)明者趙明, 徐明旭, 姜平, 楊萌, 明 趙 申請人:抗癌公司