專利名稱：通過(guò)發(fā)酵制備一種或多種抑制素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵制備一種或多種抑制素的方法。本發(fā)明還涉及含有一種或多種抑制素的食物制品。
背景技術(shù)：
抑制素是已知對(duì)人血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-膽固醇)含量具有降低效果的化合物。LDL-膽固醇升高(血膽固醇過(guò)多)與增加患冠心病的危險(xiǎn)有直接關(guān)系。抑制素可抑制羥甲戊二酸單酰輔酶(HMG-CoA)還原酶，膽固醇生物合成中的速控步驟。
科學(xué)家研究證實(shí)了抑制素特別針對(duì)LDL血液-膽固醇和三酸甘油酯含量降低活性方面的健康特性，并且在動(dòng)物和人中都有這種特性(Li等，Nutrition Research 18，71-81(1998)；Heber等，Am.J.Clin.Nutr.69，231-236 (1999))。
關(guān)于抑制素效果的早期報(bào)告是在1979年作出的。日本科學(xué)家Endo從紅曲霉中分離出可人工降低大鼠中誘導(dǎo)型高脂蛋白血的代謝物(Endo，J.Antibiotics 32，852-854，(1979))。這些代謝物已知是紅曲霉素。紅曲霉素等同于膽固醇降低藥物洛伐他丁。洛伐他丁由Merck公司以商品名稱Mevacor出售。洛伐他丁的衍生物，辛伐他丁，作為膽固醇降低藥品以名稱Zocor出售。洛伐他丁的其它衍生物，例如普伐他丁和美伐他丁，也作為血膽固醇過(guò)多的液體降低藥品出售。在日本，紅曲霉-提取物以膠囊的形式作為飲食制品紅曲霉素出售。上述抑制素的通常劑量為20mg/天，具有至少20％血液LDL-膽固醇降低的效果。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，除上述紅曲霉菌種外，使用其它真菌的發(fā)酵中也能產(chǎn)生抑制素。據(jù)顯示，抑制素可以通過(guò)各種絲狀真菌來(lái)生產(chǎn)，包括紅曲霉、曲霉屬、青霉屬、灰側(cè)耳茵屬、腐霉屬、隱殼霉屬、擬青霉屬、Eupenicillium和束孢霉屬。
藥物制劑中所用的抑制素的制備和純化包括很多步驟，其中所用的成分都是食品工業(yè)中不常用的。相比具有較少加工步驟的工藝，很多加工步驟增加了成本。出于這些原因，為藥用而制備的抑制素是無(wú)法在食品工業(yè)中得到使用的。
作為食物制品，用紅色紅曲霉屬真菌發(fā)酵的稻米(紅米)是已知的并且在中國(guó)已有上百年的歷史。紅米得到使用并且仍在造酒中使用，作為食品著色劑和作為傳統(tǒng)中國(guó)醫(yī)藥中的藥品。我們發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上可獲得的大部分紅米中并不合抑制素或含非常少量的抑制素。食品和藥品管理局(The Food and Drug Administration)的結(jié)論認(rèn)為，可從市場(chǎng)上獲得的紅色酵母米中不含顯著量的洛伐他丁(FDA，Docket No.97-0441，F(xiàn)inal Decision)。
WO 99/23996描述了一種用于治療高血清膽固醇和/或三酸甘油酯的含有紅米制品的組合物，其中所說(shuō)的紅米制品中含有至少0.05wt％洛伐他丁。
紅米粉末膠囊由Pharmanex公司作為飲食補(bǔ)劑的形式以名稱Cholestin出售。Pharmanex還銷售含有紅色酵母米(Monascuspurperus went)的Cholestin條狀食品。
紅米具有強(qiáng)烈的紅色。紅米的深紅色當(dāng)用作著色劑使用時(shí)是有利的，而當(dāng)在食物制品中使用時(shí)是不利的。由于紅米制品具有強(qiáng)烈紅色，由紅米制備的食品，根據(jù)向食物制品中添加的紅米制品的量，而被染成黃色、橙色或紅色。食品中添加的紅米的量越高，食物制品的紅色越深。在已知的食物制品中，為添加足夠的抑制素就不得不添加相對(duì)大量的紅米。這樣就不可避免地導(dǎo)致制品帶有紅顏色。
在一些食物制品中，紅米染色是不期望的。特別是在西方世界，消費(fèi)者不愿意使用那些他們所習(xí)慣的顏色被改變了的產(chǎn)品。例如涂抹料，包括人造奶油、奶油、低脂涂抹料或色拉油，當(dāng)這些產(chǎn)品的顏色是橙色或紅色時(shí)，消費(fèi)者認(rèn)為是不可接受的。然而，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，這些類型的產(chǎn)品卻是每日攝取足夠量抑制素以獲得血液LDL-膽固醇降低效果的杰出載體。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種食物制品，這種食物制品沒(méi)有因添加抑制素而產(chǎn)生不期望的顏色。本發(fā)明的另一個(gè)目的是增加含抑制素的已知食物制品的保健效果。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含抑制素的食物制品的制備方法，該方法所中包括的加工步驟少于制備藥物形式的抑制素時(shí)的步驟。另一種目的是提供一種方法，該方法可避免使用食品工業(yè)中不常用的配料或加工助劑。
這些目的的一個(gè)或多個(gè)是由通過(guò)發(fā)酵制備一種或多種抑制素的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中用產(chǎn)抑制素的真菌發(fā)酵底物，其特征在于，底物含有大于20wt％的大豆成分。
此外，上述目的的一個(gè)或多個(gè)由含有以下成分的食物制品來(lái)實(shí)現(xiàn)a)一定量的一種或多種抑制素，b)一定量的一種或多種選自以下的化合物多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、肽、膳食纖維包括可溶性纖維、多酚和皂苷，其中該食物制品的色彩a值小于20，優(yōu)選小于20，最優(yōu)選小于0。
優(yōu)選，a)的量為5-100mg/kg和b)的量為1wt或更高。更優(yōu)選b)的量是5wt％或更高。
我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于紅曲霉發(fā)酵的底物是大豆和/或大豆成分時(shí)，可以避免紅米發(fā)酵中的發(fā)酵產(chǎn)物變成紅色，即可獲得不變色或僅微微變色的發(fā)酵產(chǎn)物。此外，我們發(fā)現(xiàn)存在于大豆中的具有有益健康效果的化合物也存在于發(fā)酵產(chǎn)物中。這些化合物包括(但不限于)多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、肽、膳食纖維包括可溶性纖維、多酚和皂苷。發(fā)酵產(chǎn)物中含有這些化合物的結(jié)果是使本發(fā)明的食物制品，相比含有抑制素的已知食物制品，其保健效果得到增加。
發(fā)明詳述本文中將使用如下定義。
抑制素定義為具有下式(I)所示結(jié)構(gòu)式的物質(zhì)。
在此結(jié)構(gòu)式中，R1和R2可以是任何基團(tuán)。優(yōu)選的抑制素是下表1中給出的化合物。
表1根據(jù)式(1)的優(yōu)選的抑制素R1R2紅曲霉素 K CH3紅曲霉素 L CH3 H紅曲霉素 J CH3 OH紅曲霉素 X CH3紅曲霉素 M CH3密實(shí)菌素H (ML-236B)ML-236-AH OHNL-236-CH H本文中的多酚是指植物來(lái)源的多酚。包括黃酮類化合物，其中包括異黃酮。多酚包括異黃酮、1，2-二苯乙烯、木酚素、香豆雌醇和resorcyclic acid內(nèi)酯。異黃酮的實(shí)例是染料木素、大豆黃酮、牛尿酚、大豆黃素、雞豆黃素A、香豆雌酚、maitaresinol、芒柄花黃素、0-去甲基engolesin、腸內(nèi)酯和腸二醇。本發(fā)明中優(yōu)選的異黃酮是染料木素和大豆黃酮以及大豆黃素，它們存在于大豆中。
本文中，皂苷是以β-D-吡喃葡糖苷醛酸衍生物的形式獲得。皂苷的實(shí)例是大豆三萜苷元(soya sapogenol)A、B、C、D和E，大豆皂苷元I、II和III，如Lebensmittel Lexikon，B.Behr′s Verlag GmbH& Co.Hamburg，Bd.2，L-Z-3，1993，第550-552頁(yè)中所述。
多不飽和脂肪酸酯定義為在脂肪酸鏈中具有一個(gè)以上不飽和基團(tuán)的脂肪酸酯。多不飽和脂肪酸酯的實(shí)例是亞油酸酯、亞麻酸酯、花生四烯酸酯。
本文中，膳食纖維是指對(duì)人的胃腸酶消化具有耐受性的各種植物物質(zhì)的集合性術(shù)語(yǔ)。取決于它們的溶解性，膳食纖維可以分成不溶性的(纖維素，一些半纖維素，木質(zhì)素)和可溶性的(其余的半纖維素，樹(shù)膠，粘膠)。大豆colyledon纖維中同時(shí)含有可溶性和不溶性的膳食纖維。
本文中，植物甾醇定義為由植物中產(chǎn)生的甾醇化合物，其結(jié)構(gòu)上非常類似于膽固醇，不同之處是它們?cè)阽薮紓?cè)鏈上的C24位含有一些取代基。植物甾醇包括4-去甲基甾醇、4-單甲基甾醇、4，4’-二甲基甾醇及其混合物。這種植物甾醇的實(shí)例是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇。本文中，術(shù)語(yǔ)“植物甾醇”還包括飽和植物甾醇(phytostanols)，植物甾醇的飽和等價(jià)物。
多酚、多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、肽、膳食纖維和皂苷在下面將統(tǒng)稱為大豆活性物。
除非另有說(shuō)明，所給出的量按wt％或每百萬(wàn)分之重量份(ppm)，mg/kg或g/kg計(jì)，相對(duì)于食物制品的總重量(除非另有說(shuō)明)。
除非另有說(shuō)明，本文中給出的抑制素的量是每種抑制素的量的總和，例如通過(guò)色譜法測(cè)定的。
本文中，底物定義為當(dāng)使用液體、水基發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中溶劑除外、例如水除外的總的化合物。當(dāng)不含溶劑時(shí)，底物等于發(fā)酵培養(yǎng)基。
本文中給出的蛋白質(zhì)量是每種蛋白質(zhì)的量的總和，除非有另外的說(shuō)明。
大豆活性物的量按多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、肽、膳食纖維(包括可溶性纖維)、多酚和皂苷的總和(wt％或ppm)計(jì)。
食物制品的色彩a*值小于20，優(yōu)選小于20，最優(yōu)選小于0。色彩a*值的測(cè)定在以下的實(shí)施例中描述。
優(yōu)選，本發(fā)明的食物制品不包括特別是適合用于飼養(yǎng)動(dòng)物的制品(飼料)。
根據(jù)本發(fā)明可以制備很多食物制品，例如，涂抹料、湯料、面條、冰淇淋、調(diào)味汁、飾料、小吃、谷物制品、飲料、面包、餅干、其它焙烤制品、糖果、條狀食品、巧克力、口香糖、乳制品、療效制品例如減肥制品或代餐品等等。
如果將此食物制品按照消費(fèi)者的普通需要使用，食物制品中存在的抑制素和大豆活性物的量應(yīng)當(dāng)足以獲得血液LDL-膽固醇降低效果。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)節(jié)抑制素和大豆活性物在食物制品中的百分比來(lái)達(dá)到上述效果。此百分比取決于食物制品的類型，因?yàn)槭褂靡环菔澄镏破返牧恐凳遣煌摹４送?，食物制品的消費(fèi)模式(每天一份和幾天內(nèi)分配)取決于食物制品。關(guān)于一份食物的量值數(shù)據(jù)可見(jiàn)美國(guó)食品和藥品管理局(the United States Food and DrugAdministration)(FDA)出版的標(biāo)題為“每份食物常規(guī)消費(fèi)的參考量(Reference Amounts customarily con sumed per eatingoccasion)”的目錄表。
優(yōu)選，本發(fā)明的食物制品中，抑制素的量為5-500mg/kg，并且大豆活性物的量為1wt％或更高。更優(yōu)選，大豆活性物的量為5wt％或更高，或者10wt％或更高。最優(yōu)選，大豆活性物的量為20wt％或更高。
作為示例，下表2中顯示了一些本發(fā)明可以制備的制品以及典型的一份的量。
表2制品每日一份的量人造奶油15g肉制品 50g飾料30g糖果10g條狀食品75g代餐飲料330ml飲料200ml優(yōu)選，本發(fā)明的食物制品中含有抑制素和非糖基化的異黃酮。在大豆以及從大豆獲得的大豆物料中，異黃酮基本上是以糖基化的形式存在。一般來(lái)說(shuō)，約5wt％的異黃酮是以非糖基化的形式存在的。最重要的糖基化異黃酮是染料木苷，大豆苷和glycetin。非糖基化的形式分別是染料木素、大豆黃酮和甘油黃酮(glycetein)。染料木素、大豆黃酮和甘油黃酮(glycetein)據(jù)報(bào)道具有有利于健康的效果，包括雌激素和抗氧化劑特性。
我們發(fā)現(xiàn)，由于本發(fā)明的發(fā)酵，使糖基化的異黃酮轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的非糖基化的異黃酮，從而達(dá)到更有益。例如，相比未發(fā)酵的大豆，在發(fā)酵大豆中的染料木素和大豆黃酮的量有所增加。意想不到的是，隨著這種有利轉(zhuǎn)化的同時(shí)還產(chǎn)生出抑制素。
因此，本發(fā)明還涉及一種食物制品，其中抑制素的量為5-500mg/kg，并且含有一定量的染料木素和染料木苷，其中染料木素的量為染料木素和染料木苷總量的10-99wt％、優(yōu)選15-99wt％、更優(yōu)選20-95wt％、進(jìn)一步優(yōu)選20-90wt％、最優(yōu)選20-80wt％。
因此，本發(fā)明還涉及一種食物制品，其中抑制素的量為5-500mg/kg，并且含有一定量的大豆黃酮，其中大豆黃酮的量為大豆黃酮和大豆苷總量的10-99wt％、優(yōu)選15-99wt％、更優(yōu)選20-95wt％、進(jìn)一步更優(yōu)選20-90wt％、最優(yōu)選20-80wt％。
對(duì)每種食物制品而言，染料木素和大豆黃酮的絕對(duì)量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)調(diào)整至需要的含量。這可以例如通過(guò)從具有不同異黃酮含量的物料中選擇發(fā)酵用的大豆物料；通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵條件，諸如發(fā)酵時(shí)間以及通過(guò)選擇向食物制品中添加的發(fā)酵大豆的量來(lái)實(shí)現(xiàn)。按此方式，可以將所說(shuō)的量調(diào)整至使每天攝取需要的異黃酮，例如對(duì)染料木素而言可以是50-80mg/天。本發(fā)明食物制品中染料木素的優(yōu)選的絕對(duì)含量，取決于食品的類型，可以是50mg/kg或更多、更優(yōu)選100mg/kg或更多、200mg/kg或更多、500mg/kg或更多，最優(yōu)選200-5000mg/kg。同樣，大豆黃酮的絕對(duì)含量取決于食品的類型，可以是50mg/kg或更多、更優(yōu)選100mg/kg或更多、200mg/kg或更多、500mg/kg或更多，最優(yōu)選200-5000mg/kg。
優(yōu)選，本發(fā)明的食物制品是涂抹料、肉制品、調(diào)味汁如醬油、醋、湯料、焙烤品、飲料或條狀食品。這些制品是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兊氖秤?，相比其它食物制品，可以達(dá)到更恒定地?cái)z取抑制素和大豆活性物的方式。本發(fā)明的更優(yōu)選的食物制品是涂抹料、谷物制條狀食品、飲料或早餐谷物制品。
下面將通過(guò)描述更優(yōu)選食物制品的適宜的實(shí)施方案，來(lái)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的舉例說(shuō)明。使用本文所提供的教導(dǎo)來(lái)制備本發(fā)明的其它產(chǎn)品是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的。
涂抹料一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的涂抹料是水包油型或油包水型乳液，但還有的涂抹料基本上不含脂肪，也包括在本發(fā)明中。涂抹料包括人造奶油和液體烹調(diào)制品。涂抹料可以是可涂抹并且不能傾倒的，或者是在使用溫度如2-10℃下可傾倒的。脂肪含量可以有很大不同，例如全脂肪人造奶油中含有60-90wt％脂肪，中等脂肪含量的人造奶油中含有30-60wt％脂肪，低脂肪制品中含有10-30wt％脂肪，以及非常低或無(wú)脂肪人造奶油中含有0-10wt％脂肪。
人造奶油或其它涂抹料中的脂肪可以是任何食用脂肪，經(jīng)常使用的是大豆油、菜籽油、向日葵油和棕櫚油。脂肪可以原樣使用或者以改性的形式使用，例如經(jīng)過(guò)氫化、酯化、精制等。其它適宜的油是本領(lǐng)域公知的并且可以按需要進(jìn)行選擇。
有利地，人造奶油或涂抹料的pH可以是5.0-6.5，但其它pH范圍也是可以的。
除人造奶油外，涂抹料的實(shí)例是干酪涂抹料、甜涂抹料、酸奶涂抹料等等。
涂抹料中的非必須的其它成分可以是乳化劑、著色劑、維生素、防腐劑、乳化劑、樹(shù)膠、增稠劑等。產(chǎn)品的其余成分正常情況下是水。
平均一份人造奶油或其它涂抹料的典型量值是15克。人造奶油或涂抹料中抑制素的優(yōu)選含量是20-500mg/kg抑制素，更優(yōu)選的范圍是50-250mg/kg抑制素。
飲料本發(fā)明的優(yōu)選的食物制品是飲料，例如茶、果汁、軟飲料、代餐飲品等。代餐飲品將在下面作更詳細(xì)描述。顯然，對(duì)于其它含抑制素和大豆活性物的飲料來(lái)說(shuō)可以使用相似的含量和組成。
一份飲料的典型量值是取200ml。飲料中抑制素的優(yōu)選含量是5-100mg/kg，更優(yōu)選10-80mg/kg。
條狀食品，包括谷物制條狀食品這種制品中經(jīng)常含有可食物料的基質(zhì)，其中可以摻加抑制素和大豆活性物。例如，基質(zhì)可以是脂肪基料的(例如糖皮或巧克力)，或者可以是以焙烤制品為基料的(面包，面團(tuán)，曲奇等)。優(yōu)選，食物制品是谷物制條狀食品，其中基質(zhì)是以附聚的谷物顆粒為基料(稻米，谷粒，果仁，葡萄干，水果顆粒)。
條狀食品的基質(zhì)物質(zhì)的量可以占條狀食品重量的60-95wt％，優(yōu)選70-90wt％，最優(yōu)選75-85wt％。
谷物制條狀食品中的其它成分可以是淀粉、糖(例如0-10wt％)、糖漿、蜂蜜、乳固體、鹽(例如0-5wt％)、碳酸鈣、維生素、增香劑和著色劑。
通常，將成分混合并且熟化(例如，通過(guò)熟化擠出)，來(lái)生產(chǎn)(谷物制)條狀食品。
條狀食品的典型量值可以是20-200g，通常是40-100g。這種制品中優(yōu)選含量是25-500mg/kg抑制素。此含量的更優(yōu)選的范圍是50-300mg/kg。
可以向產(chǎn)品中添加其它成分，例如增香物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等。
食物制品的制備根據(jù)本發(fā)明，將從大豆和/或其成分制備的底物，用產(chǎn)抑制素的真菌發(fā)酵，并且使用這種發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)制備食物制品。下面將舉例說(shuō)明這些步驟。在此舉例說(shuō)明中，產(chǎn)抑制素的真菌是紅曲霉屬。
發(fā)酵按已知方式進(jìn)行。發(fā)酵在至少一個(gè)發(fā)酵容器(發(fā)酵罐)中進(jìn)行，其中在發(fā)酵容器中存在含有大豆和/或其成分的培養(yǎng)基。通過(guò)添加紅曲霉屬真菌孢子的懸浮液(接種物)來(lái)使發(fā)酵開(kāi)始進(jìn)行(接種)，其中所說(shuō)的懸浮液是通過(guò)將紅曲霉真菌在分離(separate)培養(yǎng)基中發(fā)酵制成。發(fā)酵可以間歇式進(jìn)行或者以連續(xù)式過(guò)程來(lái)進(jìn)行。
發(fā)酵包括以下步驟，按所給的順序進(jìn)行a)制備接種物用的培養(yǎng)基和亟待在發(fā)酵罐中使用的培養(yǎng)基b)將培養(yǎng)基、發(fā)酵罐和輔助設(shè)備滅菌c)生產(chǎn)接種物d)在發(fā)酵罐中，向含有大豆和/或其成分的培養(yǎng)基中添加接種物e)進(jìn)行發(fā)酵f)從發(fā)酵罐中取出發(fā)酵產(chǎn)物。
將此發(fā)酵產(chǎn)物用于制備本發(fā)明的食物制品。
非必須地，在將發(fā)酵產(chǎn)物用于制備食物制品之前，可以進(jìn)行以下附加的加工步驟
g)將發(fā)酵產(chǎn)物滅菌h)將發(fā)酵產(chǎn)物(或經(jīng)過(guò)滅菌的發(fā)酵產(chǎn)物)干燥i)進(jìn)行一步或更多步分離步驟，例如萃取，以便從發(fā)酵產(chǎn)物中的紅曲霉生物質(zhì)中分離抑制素和大豆活性物。
發(fā)酵罐中所用的培養(yǎng)基可以是固體或液體。有利地，培養(yǎng)基是固體，最優(yōu)選的培養(yǎng)基基本上由經(jīng)過(guò)破碎的整大豆組成，將其用水浸泡(例如30wt％水)。當(dāng)培養(yǎng)基是液體時(shí)，通常是存在水作為培養(yǎng)基的主要構(gòu)成成分。
優(yōu)選使用整大豆作為發(fā)酵用的底物。整大豆的典型組成是42wt％蛋白質(zhì)、20wt％油、35wt％總碳水化合物、5wt％灰分和5.5wt％粗纖維(Kawamura，S.，Tech.Bull.Faculty Agric.，Kagawa Univ.，18，117(1967))。
可以在發(fā)酵罐用的培養(yǎng)基中使用大豆的部分或成分來(lái)代替整大豆，例如使用大豆蛋白(包括質(zhì)構(gòu)化的植物蛋白質(zhì))、大豆乳、大豆薄片等。需要注意的是，培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)含有可以提供用于紅曲霉屬真菌生長(zhǎng)的碳源和氮源的化合物。
本發(fā)明中所用的紅曲霉屬真菌可以是能夠產(chǎn)生抑制素的任何紅曲霉屬真菌。優(yōu)選真菌選自紅色紅曲霉。首選的是紅色紅曲霉F125M1-4。
菌株F125和F125 M1-4保藏在the Centraal Bureau voorSchimmelculturen(CBS)，保藏號(hào)為CBS 109070(2000年11月14日保藏)和CBS 109269(2001年1月23日保藏)。
這些保藏是布達(dá)佩斯條約規(guī)定下，根據(jù)微生物保藏的國(guó)際承認(rèn)，用于專利程序及其細(xì)則目的而作出的(布達(dá)佩斯條約)。
保藏材料的利用不能解釋為是在違背任何政府的主管部門根據(jù)其專利法所授權(quán)的權(quán)利的前提下實(shí)踐本發(fā)明的許可。
通常情況下，在發(fā)酵前要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅茵，例如通過(guò)熱處理，如巴氏滅菌法。
發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基可以含有其它可能有助于發(fā)酵的物質(zhì)，例如糖、氨基酸和維生素。
發(fā)酵可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)發(fā)酵技術(shù)普通常規(guī)知識(shí)來(lái)確定的方式進(jìn)行。下面描述一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案作為舉例說(shuō)明。
發(fā)酵溫度是重要的。溫度優(yōu)選在10-37℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選20-30℃。我們發(fā)現(xiàn)，在37℃和更高溫度下，抑制素的產(chǎn)生降低。
優(yōu)選，在發(fā)酵過(guò)程中，給培養(yǎng)基充氣，例如通過(guò)攪拌、搖動(dòng)等。充氣可以通過(guò)讓空氣吹過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)實(shí)施。優(yōu)選當(dāng)采用固態(tài)發(fā)酵時(shí)，將空氣用水蒸氣完全或部分地飽和。這樣可以避免發(fā)酵培養(yǎng)基的干燥。
抑制素對(duì)大豆活性物的相對(duì)含量取決于發(fā)酵時(shí)間。因此發(fā)酵時(shí)間依發(fā)酵產(chǎn)物中抑制素的所需量而定。優(yōu)選的發(fā)酵時(shí)間是1-60天，更優(yōu)選1-50天，進(jìn)一步更優(yōu)選15-40天，最優(yōu)選20-30天。
在添加到食物制品中之前，可以對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離步驟的處理，以便從發(fā)酵產(chǎn)物中的紅曲霉生物質(zhì)中分離抑制素和大豆活性物。這種分離可以用已知的分離技術(shù)來(lái)進(jìn)行，例如過(guò)濾或離心。
還可以將發(fā)酵產(chǎn)物萃取，并且可以將萃取物用于制備食物制品。優(yōu)選的萃取劑是食用級(jí)的萃取劑。更優(yōu)選的萃取劑是乙醇。最優(yōu)選的萃取劑是植物油，例如大豆油或向日葵油。
可以對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行萃取。或者，可以在萃取之前將紅曲霉生物質(zhì)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離，例如通過(guò)過(guò)濾?？梢詫?duì)這種紅曲霉生物質(zhì)單獨(dú)進(jìn)行萃取，并且所得的萃取物也可以用于制備食物制品。
可以將萃取物原樣直接用于制備食物制品。優(yōu)選，可以從萃取物中除去萃取溶劑，例如將萃取溶劑蒸發(fā)。
有利地，可以使用食用油作為萃取劑。食用油優(yōu)選是植物油，例如大豆油或向日葵油。當(dāng)用植物油萃取發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)，據(jù)發(fā)現(xiàn)抑制素可被有效萃取，并且可獲得含有基本上所有抑制素的油相。所得的萃取物非常適合直接用作食品成分。
最有利的是，在發(fā)酵過(guò)程中將萃取劑，例如植物油，添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。我們發(fā)現(xiàn)，在萃取劑的存在下，發(fā)酵過(guò)程中抑制素的產(chǎn)生有可觀地增加。通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加植物油，相比不加萃取劑的發(fā)酵，可以使所產(chǎn)生的抑制素的量增加至少10倍，更優(yōu)選至少40倍。優(yōu)選萃取劑應(yīng)當(dāng)不干擾發(fā)酵，特別是它對(duì)產(chǎn)抑制素的真菌而言應(yīng)當(dāng)不是有毒的。在發(fā)酵過(guò)程中，底物中存在的油的量?jī)?yōu)選是至少5wt％油(w/w底物)，更優(yōu)選大于10wt％，最優(yōu)選至少20wt％。優(yōu)選油是可食用的油，更優(yōu)選是植物食用油，例如向日葵油或大豆油。盡管可以使用動(dòng)物和植物脂肪，但出于保健原因，它們是不太優(yōu)選的。
在本發(fā)明的制備食物制品的過(guò)程中，可以將這種發(fā)酵產(chǎn)物(包括萃取物等)直接添加到食物制品成分中。可以將其添加到食物制品組合物的其它成分中，或者可以將它添加到一部分成分中，然后加入其它成分。如果食物制品中存在有一個(gè)以上的相，則發(fā)酵產(chǎn)物可以存在于這些相的一個(gè)或更多個(gè)相中。優(yōu)選，發(fā)酵產(chǎn)物基本上存在于油相中，如果這種油相存在的話。
本發(fā)明將在以下的實(shí)施例中作進(jìn)一步舉例說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例1A.制備紅曲霉菌株F125 M1-4將紅色紅曲霉菌株F125在麥芽汁水液體培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)4天。從此培養(yǎng)物中，取1ml作為用于Hybond-N濾器(Amersham，UK)的接種物使用，將其中所說(shuō)的濾器放在YE平板上(4％葡萄糖，0.3％KH2PO4，1.0％酵母提取物(Difco)，1.5％瓊脂)。經(jīng)過(guò)3天的在30℃下的保溫培養(yǎng)后，通過(guò)用10ml含0.1％吐溫80的生理鹽水洗滌濾器，收獲得到孢子。將孢子通過(guò)Mira濾布過(guò)濾4次，獲得不含茵絲的孢子懸浮液。使用此懸浮液用于隨后的誘變。
將孢子稀釋至108個(gè)孢子/ml的濃度，然后暴置于100焦耳/m2強(qiáng)度的UV光下。將此誘變處理的孢子放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Oxoid)上，并且保溫培養(yǎng)3周。選擇所得集落中的一個(gè)比其它集落顏色較淺的集落，并且在此定義作紅曲霉菌株F125 M1-4。
B.制備紅曲霉孢子通過(guò)從PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)(oxoid)斜面培養(yǎng)基中收獲紅曲霉菌絲體，來(lái)制備紅曲霉f125M1-4孢子，即用5ml生理鹽水洗滌斜面培養(yǎng)基，并且將菌絲體在150ml麥芽汁水(oxoid)中于30℃下保溫培養(yǎng)4天。通過(guò)Mira濾布過(guò)濾收獲得到孢子。
C.發(fā)酵C.1.制備接種物在含有大豆的搖瓶中，接種懸浮于含0.1wt％吐溫80(聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，得自ICI Specialty ChemicalsTM)生理鹽水溶液中的絲狀孢子。將此搖瓶保溫培養(yǎng)，讓霉菌生長(zhǎng)。由此得到紅曲霉孢子懸浮液，通過(guò)稀釋調(diào)整至1×106個(gè)孢子/ml的濃度。
C.2.制備發(fā)酵培養(yǎng)基將1kg大豆浸泡在自來(lái)水(50℃)中30分鐘。浸泡過(guò)后，將大豆用冷自來(lái)水漂洗。隨后，將50g批量的浸泡大豆(97％大豆)送入300ml錐形燒瓶中。
C.3.發(fā)酵給每個(gè)搖瓶接種1ml制備的紅曲霉孢子懸浮液，并且在30℃下保溫培養(yǎng)30天。每周從搖瓶中取樣，來(lái)監(jiān)測(cè)抑制素的產(chǎn)生。
發(fā)酵后，剩留約600g的大豆。
D.發(fā)酵產(chǎn)物的抑制素分析將發(fā)酵產(chǎn)物樣品在50ml管(Falcon)中，通過(guò)添加6ml乙腈、水和磷酸的混合物(1∶1∶0.05，v/v/v)來(lái)萃取。將混合物與Ultraturrax共混1分鐘。然后，將混合物在室溫下于rollerbank上保溫培養(yǎng)24小時(shí)以上。之后將樣品離心，并且使用上清液用于HPLC分析。在Shimadzu儀器上按照Morovjan等，J.chromatogr.A 763(1997)165-172中所述的方法使用HPLC分析來(lái)分離樣品。該系統(tǒng)由ShimadzuSCL-10A系統(tǒng)控制器、CTO-10AS柱烘箱、LC-10AT vp泵系統(tǒng)、RID-10A折射率檢測(cè)器、SPD-M10A二極管陣列檢測(cè)器和SIL-10AD自動(dòng)進(jìn)樣器組成。對(duì)于色譜測(cè)定抑制素，使用Waters NovaPak C18(150×3.9mm I.D.，4μm)柱，在25℃下操作。洗脫液是乙腈-0.1％磷酸(50∶50，v/v)溶液，流速為1.5ml/min。洗脫進(jìn)行15分鐘。使用二極管陣列檢測(cè)器從190nm至最高800nm進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定光譜中屬于抑制素的所有峰的面積的總和。與標(biāo)準(zhǔn)樣(Mevinolin，Sigma)比較，計(jì)算抑制素含量(按mg/kg被分析產(chǎn)物計(jì))。
分析結(jié)果得到抑制素含量為1200mg/kg產(chǎn)物。
E.萃取發(fā)酵產(chǎn)物將發(fā)酵產(chǎn)物用乙醇和乙腈萃取。如上述D所述，通過(guò)HPLC測(cè)定，大豆萃取物中含有0.0545g抑制素/kg(乙醇萃取物)或0.0978g抑制素/kg(乙腈萃取物)。
F.萃取物的顏色分析當(dāng)對(duì)顏色進(jìn)行分類時(shí)，可以將它們分解成三原素。一個(gè)是色彩(顏色)，另一個(gè)是色調(diào)(亮度)，以及第三個(gè)是色度(飽和度，如鮮明顏色或黯淡顏色)。為能夠使任何人告訴其他任何人他們所談?wù)摰拇_切是什么顏色，使用通用數(shù)碼。所用的這種數(shù)碼是L*a*b*。當(dāng)按此體系來(lái)表達(dá)顏色時(shí)，色調(diào)變成L*，而色彩和色度分別按a*和b*來(lái)表示。測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間樣品的L*a*b*。將樣品的上清液用微孔0.22μm濾器過(guò)濾滅菌。用Shimatzu的UV 1601分光熒光計(jì)(spectofotometer)測(cè)定此澄清液體的L*a*b*。
大豆萃取物的L*a*b*值用紅色紅曲霉M1-4發(fā)酵的大豆L*＝90.2；a*＝-4.8；b*＝33.8G.制備可傾型人造奶油使用發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇萃取物作進(jìn)一步加工。借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去乙醇。使用殘余物制作可傾型人造奶油組合物。使用不合發(fā)酵產(chǎn)物殘余物的可傾型人造奶油組合物進(jìn)行顏色方面的比較。
可傾型人造奶油的組成見(jiàn)下表3。
表3.實(shí)施例1的可傾型人造奶油的組成

可傾型人造奶油的顏色不同于不合抑制素萃取物、但含20wt％水的對(duì)照。
對(duì)比實(shí)施例A重復(fù)實(shí)施例1，步驟B-G，但用從紅米(中國(guó)的市售產(chǎn)品)中分離的紅曲霉菌株代替紅曲霉茵株F125 M1-4。
按照實(shí)施例1的步驟F測(cè)定萃取物的L*a*b*值。這些值是L*＝90.2；a*＝56.1；b*＝63.9
對(duì)比實(shí)施例B重復(fù)實(shí)施例1步驟B-G的過(guò)程，然而在步驟C.2中，使用1kg稻米(煮半熟的稻米，Oryza)代替1kg大豆。發(fā)酵后，剩留約500g稻米。
按照實(shí)施例1的步驟F測(cè)定萃取物的L*a*b*值。這些值是L*＝80；a*＝54；b*＝49實(shí)施例2制備具有下表4所示組成的涂抹料。
表4實(shí)施例2的涂抹料的組成

脂肪共混物是65wt％棕櫚油硬脂酸甘油酯的中間級(jí)分和35wt％棕櫚仁油的混合物。
涂抹料的制備是通過(guò)將成分在預(yù)混罐中于55℃下預(yù)混，并且將預(yù)混物送入帶有兩個(gè)刮板表面熱交換器(A-單元)和一個(gè)結(jié)晶器(C-單元)的Votator中，其中所說(shuō)的刮板表面熱交換器在每分鐘800轉(zhuǎn)(rpm)下操作，結(jié)晶器在200rpm下操作。其構(gòu)型是A-A-C。
抑制素在涂抹料中的含量為74mg/kg。此涂抹料的顏色不同于不含抑制素萃取物、但含20wt％水的對(duì)照。
實(shí)施例3添加油的發(fā)酵在10升反應(yīng)器中裝入8升底物(葡萄糖20g/l，甘油100g/l，淀粉20g/l，NaNO32g/l，MgSO45g/l)，并且設(shè)定至每分鐘6體積變化(vvm)的空氣流速。在YPD中于30℃下制備預(yù)培養(yǎng)物兩天，并且用來(lái)接種1×107孢子/1濃度的紅色紅曲霉F125M1-4發(fā)酵罐。將培養(yǎng)物在25℃和200rpm條件下保溫培養(yǎng)3周。22天之后，向10升反應(yīng)器中添加400ml大豆油。
49天后，停止發(fā)酵，并且測(cè)定水相和油相中的抑制素的量。結(jié)果示于下表5中。
表5. 49天發(fā)酵后不同相中的抑制素的量(mg/l)

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，97wt％的抑制素存在于油相中?？梢?jiàn)油相和水相中的抑制素含量之間有很大的差異。補(bǔ)充油增加了反應(yīng)器中抑制素的總量。沒(méi)有補(bǔ)充油的對(duì)照反應(yīng)器中含有1.8mg/l抑制素，而補(bǔ)充油的反應(yīng)器中顯出具有總量為83.4mg/l的抑制素。補(bǔ)充油的反應(yīng)器中的抑制素含量，比沒(méi)有油發(fā)酵所獲得的抑制素的量高45倍。
向固態(tài)發(fā)酵添加大豆油也可刺激抑制素的產(chǎn)生。
實(shí)施例4按照實(shí)施例1進(jìn)行步驟A、B和D。
C.發(fā)酵C.1.制備接種物在含有脫皮大豆的搖瓶中，接種懸浮于含0.1wt％吐溫80(聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，得自ICI Specialty ChemicalsTM)生理鹽水溶液中的絲狀孢子。將此搖瓶保溫培養(yǎng)，讓霉菌生長(zhǎng)。由此得到紅曲霉孢子懸浮液，通過(guò)稀釋調(diào)整至1×106個(gè)孢子/ml的濃度。
C.2.制備發(fā)酵培養(yǎng)基將1kg脫皮大豆浸泡在自來(lái)水(50℃)中30分鐘，并且隨后用空氣干燥2小時(shí)。隨后，將50g批量的干燥脫皮大豆送入300ml錐形燒瓶中。
C.3.發(fā)酵給每個(gè)搖瓶接種1ml制備的紅曲霉孢子懸浮液，并且在30℃下保溫培養(yǎng)30天。每周從搖瓶中取樣，來(lái)監(jiān)測(cè)抑制素的產(chǎn)生。
發(fā)酵后，剩留約600g的大豆。根據(jù)步驟D的分析，抑制素含量為2800mg/kg產(chǎn)物。
E.發(fā)酵產(chǎn)物的異黃酮分析按照Franke A.A.，等(1998)食品和人流體中異黃酮類化合物和其它酚類試劑的HPLC分析(HPLC analysis of isoflavonoidsand other phenolic agents from foods and human fluids)；Proceed.Soc.Exp.Biol.Med；217(3)，274-280中描述的方法，測(cè)定異黃酮濃度。
測(cè)試兩種樣品。第一種(對(duì)比)樣品取自如上步驟C2所制備的未發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基。第二種樣品為相等(固體)重量，但取自發(fā)酵產(chǎn)物。這些樣品的異黃酮測(cè)定結(jié)果示于下表3。
表3.發(fā)酵和未發(fā)酵大豆中異黃酮的濃度

表3顯示了發(fā)酵產(chǎn)物中的總的異黃酮的量比未發(fā)酵物料有所降低，但是意想不到的是，染料木素和大豆黃酮的量有所增加。發(fā)酵產(chǎn)物中除抑制素外還含有顯著量的異黃酮。
權(quán)利要求
1.通過(guò)發(fā)酵制備一種或多種抑制素的方法，其中用產(chǎn)抑制素的真菌發(fā)酵底物，其特征在于，底物中含有大于20wt％的大豆成分。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，底物中含有大于50wt％的大豆成分。
3.權(quán)利要求2的方法，其中，底物中含有大于80wt％的大豆成分。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中，產(chǎn)抑制素的真菌是紅曲霉屬真菌。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中，在發(fā)酵過(guò)程中，底物中存在有至少5wt％的油。
6.權(quán)利要求5的方法，其中油是食用油。
7.權(quán)利要求5的方法，其中油是植物食用油。
8.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的方法，其中油的量為至少10wt％。
9.紅曲霉菌株F125 M1-4，其于2000年11月14日保藏在theCentraal Bureau voor Schimmelculturen，保藏號(hào)為CBS 109070。
10.含有以下成分的食物制品a)一定量的一種或多種抑制素，b)一定量的一種或多種選自以下的化合物多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、肽、膳食纖維、多酚和皂苷，其中，該食物制品的色彩a*值小于20。
11.權(quán)利要求10的食物制品，其中，一種或多種抑制素的量為5-500mg/kg，含有一定量的染料木素和染料木苷，其中染料木素的量為染料木素和染料木苷總量的10-99wt％。
12.權(quán)利要求11的食物制品，其中，染料木素的量為染料木素和染料木苷總量的20-95wt％。
13.權(quán)利要求12的食物制品，其中，染料木素的量為染料木素和染料木苷總量的20-80wt％。
14.權(quán)利要求10的食物制品，其中，a)的量是5-500mg/kg并且b)的量是1wt或更高。
15.權(quán)利要求11的食物制品，其中，b)的量是5wt％或更高。
16.權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)的食物制品，其中，食物制品的色彩a*值小于10。
17.權(quán)利要求10的食物制品，其中，選自以下化合物的一種或多種化合物基本上得自于大豆多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、肽、膳食纖維、多酚和皂苷。
18.權(quán)利要求10的食物制品，其中，食物制品是人造奶油、飾料、糖果、條狀代餐食品、早餐谷物制品或飲料。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種通過(guò)發(fā)酵制備一種或多種抑制素的方法，其中用產(chǎn)抑制素的真菌發(fā)酵底物，其中底物含有大于20wt％的大豆成分。本發(fā)明還描述了一種食物制品，其含有一定量的一種或多種抑制素，以及一定量的一種或多種選自以下的化合物多不飽和脂肪酸、植物甾醇、蛋白質(zhì)、肽、膳食纖維、多酚和皂苷，其中該食物制品的色彩a*值小于20。
文檔編號(hào)A23G9/32GK1491284SQ02804794
公開(kāi)日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2002年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月9日
發(fā)明者G·J·范奧爾肖特, G J 范奧爾肖特, E·特爾舒雷, 胬 , E·特勞特魏恩, 吞匚憾 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司