專利名稱：用于選擇含有編碼針對(duì)毒性分子的解毒劑蛋白的序列的重組克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組DNA技術(shù)的領(lǐng)域。
更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及一種方法，一種核酸構(gòu)建體，一種載體和一種用于選擇重組克隆的細(xì)胞，該重組克隆含有編碼針對(duì)毒性分子的解毒劑蛋白的序列。
背景技術(shù)：
及現(xiàn)有技術(shù)有可能將DNA插入片段克隆到載體中而不需要選擇重組體，卻需要花費(fèi)時(shí)間進(jìn)行利用放射性標(biāo)記探針的雜交鑒定，通過限制性酶切小規(guī)模制備的質(zhì)粒進(jìn)行篩選或在有X-Gal存在的條件下基于α互補(bǔ)失活進(jìn)行篩選(藍(lán)/白篩選)。
這些用了十多年的方法并不適應(yīng)大規(guī)模的克隆計(jì)劃，該計(jì)劃將在完整基因組測(cè)序計(jì)劃之后出現(xiàn)。可獲得的序列信息已經(jīng)迅猛增加而且在將來還將進(jìn)一步增加。
為了評(píng)價(jià)已被鑒定的編碼序列的生物學(xué)功能，必須對(duì)生物體基因組中的其相應(yīng)基因進(jìn)行特異性突變(缺失或修飾)(例如在剔除小鼠中)，以便研究與引入的突變相關(guān)的表型。突變的特異性是由導(dǎo)向載體(在大腸桿菌中構(gòu)建的)所給予的，所述導(dǎo)向載體含有同源重組臂。
如果測(cè)序技術(shù)的發(fā)展能夠滿足測(cè)序基因數(shù)目迅猛增加的需要，為了獲得重組克隆和得到相應(yīng)基因功能的相關(guān)資料而對(duì)基因進(jìn)行大規(guī)模的克隆和亞克隆仍然是功能性基因組計(jì)劃的限制性步驟。
對(duì)每種基因進(jìn)行克隆和亞克隆是“功能性基因組計(jì)劃”的瓶頸。因此需要加快這些進(jìn)程的新克隆方法。
由于重組體的鑒定是一個(gè)限制性步驟，因此很清楚需要進(jìn)行重組體的正選擇來由傳統(tǒng)的方法進(jìn)展到進(jìn)行高產(chǎn)量克隆，從而能夠處理成千上萬(wàn)的基因。
已經(jīng)提出了能夠直接選擇(正選擇)重組菌株的克隆載體(例如，參見Pierce等，1992；Kuhn等.1986)。然而，大多數(shù)克隆載體表現(xiàn)出下列缺點(diǎn)(i)它們不能被用來引入大的核苷酸片段，(ii)它們不易操作處理，以及(iv)它們不能由微生物以多拷貝來進(jìn)行制備且不導(dǎo)致所述微生物死亡。
而且，傳統(tǒng)的限制性酶切和連接酶反應(yīng)可以被位點(diǎn)專一性重組所取代，而且重組體可以通過所感興趣的插入片段取代ccdB基因(毒物/解毒劑基因家族的成員)來進(jìn)行選擇(美國(guó)專利US5,910,438，US6,180,407和國(guó)際專利WO 99/58652)。
含CcdB的載體比其它正選擇系統(tǒng)具有下列主要優(yōu)勢(shì)i)其選擇基因小(ccdB303bp)，ii)所述載體能在一種宿主中擴(kuò)增，該宿主含有一個(gè)賦予其針對(duì)CcdB毒物的總體抗性的突變(gyrA462抗性菌株；Bernard和Couturier，1992)。由于大腸桿菌是大多數(shù)分子克隆技術(shù)方案所采用的宿主，所以研制能夠增強(qiáng)和拓寬克隆可能性范圍的新型系統(tǒng)是非常重要的。利用CcdB的正選擇技術(shù)已被用來構(gòu)建適于特殊目的的新載體PCR克隆載體(Gabant等，1997)，適于細(xì)菌遺傳學(xué)的載體(Gabant等，1998)，而且最近采用一種屬于CcdB家族的kid基因設(shè)計(jì)了新型的克隆載體(Gabant等，2000和WO01/46444)。
CcdB基因用途的另一個(gè)實(shí)例由美國(guó)專利US5,888,732給出。該文獻(xiàn)公開了被稱作″通道系統(tǒng)(the Gateway system)″的克隆方法的基本原理。在該方法中，傳統(tǒng)的限制性酶切和連接酶反應(yīng)被位點(diǎn)專一性重組位點(diǎn)所取代而且通過插入目的基因致使ccdB基因失活(通過缺失)來選擇重組體。該方法使得生物體的所有基因通過自主亞克隆而快速并有效地由一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到不同的載體(即表達(dá)載體)。所產(chǎn)生的亞克隆保留了允許進(jìn)行翻譯融合的定向以及讀框(有關(guān)綜述參見Hartley等，2000)。
然而，所述技術(shù)是基于可反選擇基因，需要使用rpsl，tetR，sacB或ccdB可反選擇基因，從而產(chǎn)生一種無縫的第二輪產(chǎn)物，該產(chǎn)物沒有從第一輪重組中攜帶上″疤(scar)″。
由于目的重組只是若干種反選擇壓力方案中的一種，所以反選擇(用于選擇毒性基因的失活或缺失)通常比正選擇(新性能的獲得)效率低。任何消除可反選擇基因表達(dá)的突變事件也將在反選擇壓力下生長(zhǎng)。
因此對(duì)于罕見的遺傳事件(其發(fā)生頻率與可反選擇基因的突變失活相當(dāng))來說，需要對(duì)來自第二輪反選擇策略的候選物進(jìn)行篩選從而找出所需的重組事件。
在實(shí)踐中，由于存在著一些仍然不確定的因素，目的產(chǎn)物與不需要的產(chǎn)物之比的變化范圍似乎很寬(從＜1％至15％-85％)(Muyrers G.P.P.，Trends in Biochemical Sciences，Vol.26，no.5，p.325-331，2001)。
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的在于提供一種新的和改進(jìn)的方法和產(chǎn)品，其克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)并使得對(duì)重組克隆的正選擇得到改進(jìn)。
本發(fā)明的具體目的是提供這樣的方法和產(chǎn)品，其能進(jìn)行罕見遺傳事件的選擇，尤其是能選擇整合了長(zhǎng)DNA片段的重組克隆。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法和產(chǎn)品，其不受用于所述正選擇的在細(xì)胞中發(fā)生的抗性突變的影響或者受其影響較小。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種用于選擇整合了一個(gè)目的基因和一條編碼針對(duì)毒性分子(針對(duì)一種細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞)的功能性解毒劑蛋白的核苷酸序列的重組克隆的方法，其中所述重組克隆是被整合到宿主細(xì)胞中后仍存活的重組克隆，所述宿主細(xì)胞的基因組中含有編碼所述毒性分子的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及被用來實(shí)施所述方法的產(chǎn)品，具體地是含有至少一條盒式核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述盒式核苷酸序列由至 少一條編碼針對(duì)毒性分子(針對(duì)一種細(xì)胞，優(yōu)選地一種原核細(xì)胞)的解毒劑蛋白的核苷酸序列和一個(gè)目的基因或一個(gè)用于所述目的基因的插入位點(diǎn)(優(yōu)選地，所述插入位點(diǎn)不在編碼所述解毒劑蛋白的核苷酸序列中)構(gòu)成；所述盒式核苷酸序列處于所述核酸構(gòu)建體的第一個(gè)重組位點(diǎn)和第二個(gè)重組位點(diǎn)之間(所述第一個(gè)重組位點(diǎn)和所述的第二個(gè)重組位點(diǎn)互相不重組)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，解毒劑蛋白和毒性分子分別是一種抗-毒物蛋白和一種毒物蛋白。所述抗-毒物或毒物蛋白可以是野生型蛋白或者經(jīng)修飾的蛋白，其天然具有毒性或經(jīng)人工的方式而具有毒性，影響細(xì)胞(優(yōu)選原核細(xì)胞)的一種或多種生活機(jī)能并且可能導(dǎo)致殺死細(xì)胞。
解毒劑蛋白和毒性分子優(yōu)選地選自CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它質(zhì)粒來源或非質(zhì)粒來源的抗-毒物/毒物分子對(duì)。
毒性分子也可以是一種天然具有毒性或經(jīng)人工的方式而具有毒性的毒素蛋白并且影響細(xì)胞(原核細(xì)胞)的一種或多種生活機(jī)能。
由基因sacB編碼的蛋白(來源于解淀粉芽孢桿菌)，蛋白GpE，蛋白GATA-1和蛋白Crp是這種毒性分子的其它實(shí)例。
基因sacB編碼能催化蔗糖水解成對(duì)大腸桿菌具有毒性的產(chǎn)物的果聚糖蔗糖酶(Pierce等.Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.89，N°6(1992)，pp2056-2060)。源自噬菌體X174的E基因編碼蛋白GpE，所述E基因含有六個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)和編碼gpE并且引起大腸桿菌細(xì)胞的裂解(Heinrich等，Gene，Vol.42n°3(1986)，pp345-349)。蛋白GATA-1由Trudel等記載(Biotechniques 1996，Vol.20(4)，PP684-693)。蛋白Crp已由Schlieper等記載(Anal.Biochem.1998，Vol.257(2)，p.203-209)。
針對(duì)所述毒性分子的解毒劑蛋白是任何能夠減少或抑制相應(yīng)毒性分子對(duì)細(xì)胞(優(yōu)選地是原核細(xì)胞)的作用的蛋白，其中所述毒性分子由所述細(xì)胞產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，編碼解毒劑蛋白的核苷酸序列是編碼無活性解毒劑蛋白的第一核苷酸片段，在將目的基因正確整合到盒式序列中后，可使其具有活性(有功能)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的盒式序列還含有啟動(dòng)子/操縱子序列用于實(shí)現(xiàn)解毒劑蛋白表達(dá)，所述解毒劑蛋白可以組成型表達(dá)或在插入目的基因(插入基因)后或通過重組事件進(jìn)行表達(dá)。
例如，當(dāng)目的基因(插入基因)帶有一條含有使解毒劑蛋白進(jìn)行表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯信號(hào)的序列時(shí)，或者當(dāng)所述目的基因通過插入或通過重組事件整合了另一條解毒劑序列、其一部分或其C-轉(zhuǎn)錄或翻譯信號(hào)時(shí)，可以獲得解毒劑活性。
通過所述機(jī)理，也可以有利地選擇目的基因正確插入所述核酸構(gòu)建體內(nèi)。
所述目的基因還可含有一條實(shí)現(xiàn)或改善所述解毒劑蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子/活化子序列或者含有一個(gè)第二核苷酸片段，該第二核苷酸片段將補(bǔ)充所述解毒劑蛋白的第一核苷酸片段，從而使所述解毒劑蛋白具有功能(對(duì)毒性分子有活性)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，目的基因的插入位點(diǎn)是一個(gè)克隆位點(diǎn)，諸如重組位點(diǎn)或被一種或多種限制酶特異性切割的核苷酸序列。
有利地是，所述目的基因的插入位點(diǎn)包含在編碼毒性分子優(yōu)選毒物蛋白的核苷酸序列中。因此，本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體首先基于一種負(fù)選擇，其在目的基因整合到編碼毒性分子的核苷酸序列中后使所述序列失活；其次基于一種正選擇，該正選擇致使解毒劑蛋白在此之后進(jìn)行表達(dá)。
所述雙選擇有利地使對(duì)發(fā)生了罕見遺傳事件的重組克隆的選擇得到了改進(jìn)，所述事件如很長(zhǎng)的DNA片段整合到本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中。
在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，由重組(recombinance)識(shí)別的第一和第二重組位點(diǎn)優(yōu)選地是基于噬菌體λ的att位點(diǎn)(特異性重組位點(diǎn)如由Ptashne M等記載的位點(diǎn)(Genetic switch，Cell Press，Cambridge，1992))。優(yōu)選地，所述att位點(diǎn)通過由Landy A等記載的方法(AnnualReview，Biochemistry，Vol.58，p.913，1989)被整合到本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中。
然而，也可以將其它類型的重組位點(diǎn)整合到本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中。
本發(fā)明的另一方面涉及一種包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的載體(一種自主復(fù)制載體如質(zhì)粒、噬菌體、病毒、陽(yáng)離子囊泡或任何其它類型的載體)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及一種載體供體DNA分子，含有第一DNA片段和第二DNA片段，所述第一或第二DNA片段含有至少一條核苷酸序列作為可選擇標(biāo)記，該序列編碼針對(duì)毒性分子的解毒劑蛋白，而且其中所述第一和第二DNA片段的側(cè)翼是至少第一和第二重組位點(diǎn)，所述重組位點(diǎn)互相不重組。
本發(fā)明載體DNA分子中的所述可選擇標(biāo)記還可含有所述解毒劑序列的至少一個(gè)失活片段，當(dāng)通過所述第一和第二重組位點(diǎn)與另一個(gè)含有所述可選擇標(biāo)記的失活片段的DNA片段(解毒劑序列的其它片段)進(jìn)行重組時(shí)，就可獲得有功能的可選擇標(biāo)記。
在載體供體DNA分子中，重組位點(diǎn)是上述的重組位點(diǎn)，優(yōu)選地選自多種重組位點(diǎn)，如美國(guó)專利US5,888,732中記載的重組位點(diǎn)。
本發(fā)明的載體供體DNA分子有利地在一個(gè)試劑盒(優(yōu)選地在一種克隆試劑盒中)中與插入供體DNA分子相組合，所述插入供體DNA分子含有側(cè)翼為第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)的第一DNA序列，所述第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)相互不重組。所述插入DNA分子的特征是美國(guó)專利US5,888,732和專利WO99/21977，WO01/31039，WO01/42509中記載的特征，這些文獻(xiàn)被引入本文作參考。
本發(fā)明的另一方面涉及一種細(xì)胞，可能包括在上述試劑盒中，優(yōu)選地是本發(fā)明的載體或核酸構(gòu)建體的原核宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞在其染色體DNA中摻入了至少一條(優(yōu)選至少兩條或多條)編碼毒性分子(存在于所述核酸構(gòu)建體中的核苷酸序列編碼一種針對(duì)該毒性分子的解毒劑)的核苷酸序列，所述毒性分子的表達(dá)優(yōu)選地通過轉(zhuǎn)錄和/或翻譯阻遏工具而被負(fù)阻遏(受控制)，例如通過向所述編碼毒性分子的核苷酸序列中添加一條阻遏型啟動(dòng)子/操縱子核苷酸序列，所述阻遏型啟動(dòng)子/操縱子核苷酸序列可實(shí)現(xiàn)對(duì)所述蛋白毒物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯阻遏調(diào)控從而避免了細(xì)胞的死亡。
然而，所述阻遏調(diào)控可以通過向細(xì)胞中加入或抑制加入一種特定化合物(即一種糖)來消除，所述特定化合物使得細(xì)胞進(jìn)行毒性分子的表達(dá)。
而且，毒性分子的活性也可以是有條件的(例如，通過在細(xì)胞中引入一種熱敏等位基因或一種特定的琥珀突變抑制)。
而且，所述細(xì)胞還可以含有一種解毒劑，該解毒劑在特定條件下被表達(dá)并且能夠在細(xì)胞中阻斷所述毒性分子的有害作用。
優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞的保藏號(hào)為L(zhǎng)MGP-21399。
所述細(xì)胞于2002年2月15日被保藏在Laboratorium voorMicrobiologie-Universiteit Généralement，K.L.ledeganckstraat 35，B-9000Gent，比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(Collection of the BelgianCoordinated Collection of micro-organisms)，BCCM，保藏號(hào)為L(zhǎng)MGP-21399。已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約關(guān)于微生物保藏國(guó)際再委托的規(guī)定進(jìn)行了所述保藏。
本發(fā)明的另一方面涉及所述產(chǎn)品用于選擇重組體的用途以及涉及一種用于選擇重組克隆的方法，該方法包括以下步驟提供一種在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體中的盒式序列，或?qū)⒛康幕虿迦氲皆谒龊惺叫蛄兄刑峁┑牟迦胛稽c(diǎn)中，用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化本發(fā)明的細(xì)胞，以及選擇存活下來的重組細(xì)胞克隆。
本發(fā)明將通過以下非限制性酶切實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
本發(fā)明的詳細(xì)描述質(zhì)粒和菌株的描述

圖1描述了本發(fā)明的核酸構(gòu)建體1，該構(gòu)建體1含有盒式核苷酸序列2，該序列由核苷酸序列3(編碼針對(duì)毒性分子5的解毒劑蛋白4)和目的基因6或用于插入目的基因6的插入位點(diǎn)構(gòu)成，以及一個(gè)啟動(dòng)子/操縱子序列9；所述盒式序列2位于第一重組位點(diǎn)7和第二重組位點(diǎn)8之間，所述第一和第二重組位點(diǎn)7、8彼此不重組。
所述核酸構(gòu)建體1有利地被整合到一個(gè)載體中，該載體是含有另一個(gè)可選擇標(biāo)記11的插入供體DNA載體10。所述插入供體DNA載體10可以與含有重組位點(diǎn)13和另一個(gè)可選擇標(biāo)記14的插入受體DNA載體12相結(jié)合，所述插入供體DNA載體10和所述插入受體載體或分子12在重組后形成本發(fā)明的重組載體15。正確的重組取向通過利用選擇標(biāo)記11的特性并且通過利用在其染色體中表達(dá)一種或多種編碼毒性分子5的基因序列的細(xì)菌菌株來選擇。
在本例中，編碼解毒劑蛋白4的核苷酸序列是編碼CcdA蛋白的核苷酸序列，所述CcdA蛋白是針對(duì)由細(xì)菌表達(dá)的毒性分子5(CcdB蛋白)的解毒劑。
存在于插入供體DNA載體10中的第一可選擇標(biāo)記11是蛋白毒物kid而第二可選擇標(biāo)記14是一種對(duì)抗生素(氨芐青霉素(ampicyline))的基因抗性。
有利地是，所述插入供體DNA載體10可以在細(xì)菌中擴(kuò)增，所述細(xì)菌對(duì)第一可選擇標(biāo)記11的活性具有抗性，例如一種表達(dá)針對(duì)蛋白毒物kid的解毒劑蛋白kis的細(xì)菌。
這種組成型包含kis序列的細(xì)菌被記載在文獻(xiàn)WO01/46444中并且受到保護(hù)，保藏號(hào)為L(zhǎng)MGP-19171。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及菌株宿主細(xì)胞20，在其中進(jìn)行重組克隆的選擇。
優(yōu)選的菌株是大腸桿菌菌株CYS10，該菌株來源于DH10B菌株(mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZdM15ΔlacW74endAl recAldeoRΔ(ara，leu)7697araD139ga/U ga/K nupG rpsL，Invitrogen的商品)。該菌株攜帶一個(gè)受染色體dcm基因中的Ptac啟動(dòng)子22調(diào)控的ccdB毒物基因21，一個(gè)受λPERFLUOROCARBON LIQUID啟動(dòng)子和溫度敏感性CI857阻遏物(該系統(tǒng)的描述見Yu等，2000，PNAS 975978-5983)調(diào)控的表達(dá)Red和Gam功能的缺陷型λ和兩個(gè)質(zhì)粒(Pulb356623n Psc101Laclq 24)。pULB3566質(zhì)粒23在Pbad啟動(dòng)子的調(diào)控下產(chǎn)生CcdA解毒劑3并且攜帶氨芐青霉素抗性基因。Psc101laclq 24質(zhì)粒產(chǎn)生Laclq阻遏物并且攜帶壯觀霉素抗性基因?？刂芻cdB毒物基因表達(dá)的Ptac啟動(dòng)子22受Laclq蛋白阻遏，并且通過向培養(yǎng)基中添加IPTG 26(異丙基β-D硫代半乳糖苷，C9H18O5S，Roche；0,5毫摩爾/升)而被誘導(dǎo)。然而，即使在有Laclq蛋白存在的條件下，Ptac啟動(dòng)子22也不被完全阻遏，引起殘余表達(dá)?？刂芻cdA解毒劑基因3表達(dá)的Pbad啟動(dòng)子在沒有阿拉伯糖25存在的條件下被完全阻遏并且通過在培養(yǎng)基中加入阿拉伯糖25(1％)而被誘導(dǎo)(Guzman等，1995，Journal of bacteriology，Vol.177，p.4121-4130)。
由于溫度敏感性DI857阻遏物的作用，菌株僅在30℃下生長(zhǎng)。由于染色體中ccdB的存在，菌株僅在阿拉伯糖存在的條件下生長(zhǎng)從而能夠產(chǎn)生CcdA解毒劑。因此，所述菌株在30℃下，于LB培養(yǎng)基中并在有阿拉伯糖(1％)存在的條件下生長(zhǎng)。
CYS10的構(gòu)建圖解見圖2。
然而，所述菌株的特性可以通過去除熱敏感特性和通過引入編碼更多毒性分子的附加基因序列來得到改進(jìn)，從而減少或避免選擇對(duì)所述毒性分子的活性具有抗性的突變體(產(chǎn)生ccdB)。
權(quán)利要求
1.一種用于選擇整合了目的基因(6)和編碼針對(duì)毒性分子(5)的功能性解毒劑蛋白(4)的核苷酸序列(3)的重組克隆的方法，其中所述重組克隆是被整合到宿主細(xì)胞(20)中后仍存活的重組克隆，所述宿主細(xì)胞的基因組中含有編碼所述毒性分子(5)的核苷酸序列(21)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述解毒劑蛋白(4)和毒性分子(5)分別是抗-毒物蛋白和毒物蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗-毒物蛋白和毒物蛋白選自下列成對(duì)蛋白CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它質(zhì)粒來源或非質(zhì)粒來源的抗-毒物/毒物蛋白對(duì)。
4.一種核酸構(gòu)建體(1)，其含有一個(gè)盒式序列(2)，該盒式序列(2)由編碼針對(duì)毒性分子(5)的解毒劑蛋白(4)的核苷酸序列(3)和目的基因(6)或用于整合所述目的基因的位點(diǎn)構(gòu)成；所述盒式序列(2)被置于第一個(gè)重組位點(diǎn)(7)和第二個(gè)重組位點(diǎn)(8)之間。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸構(gòu)建體(1)，其中編碼解毒劑蛋白(4)的核苷酸序列(3)含有至少一個(gè)編碼無活性解毒劑蛋白(4)的核苷酸，其中在將目的基因(6)正確整合到盒式序列(2)中之后，所述解毒劑蛋白(4)重組為有功能的解毒劑蛋白(4)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的核酸構(gòu)建體(1)，其中解毒劑蛋白(4)和毒性分子(5)分別是抗-毒物蛋白和毒物蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建體(1)，其中抗-毒物蛋白和毒物蛋白選自下列成對(duì)蛋白CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它質(zhì)粒來源或非質(zhì)粒來源的抗-毒物/毒物蛋白對(duì)。
8.如權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸構(gòu)建體，其中含有用于插入目的基因(6)的位點(diǎn)的核苷酸序列是編碼毒性分子的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸構(gòu)建體(1)，其中編碼解毒劑蛋白(4)的核苷酸序列(3)或目的基因(6)被連接到啟動(dòng)子/操縱子序列(9)上。
10.如權(quán)利要求4至9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸構(gòu)建體，其中第一個(gè)重組位點(diǎn)(7)和第二個(gè)重組位點(diǎn)(8)是基于噬菌體λ的att位點(diǎn)。
11.含有權(quán)利要求4至10中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸構(gòu)建體的載體。
12.如權(quán)利要求11所述的載體，其是一種自主復(fù)制載體，優(yōu)選病毒或質(zhì)粒載體。
13.如權(quán)利要求11所述的載體，其是一種載體供體DNA分子(10)。
14.一種載體供體DNA分子(10)，其含有包含至少一個(gè)可選擇標(biāo)記的第一DNA片段和/或第二DNA片段，其中所述第一或第二DNA片段的側(cè)翼是互相不重組的至少第一重組位點(diǎn)第二重組位點(diǎn)，并且其中可選擇標(biāo)記是編碼針對(duì)毒性分子的解毒劑蛋白的核苷酸序列。
15.如權(quán)利要求14所述的載體，其中所述可選擇標(biāo)記是編碼針對(duì)毒物蛋白的抗-毒物蛋白的核苷酸序列。
16.如權(quán)利要求15所述的載體，其中所述抗-毒物蛋白和毒物蛋白選自下列成對(duì)蛋白CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它質(zhì)粒來源或非質(zhì)粒來源的抗-毒物/毒物蛋白對(duì)。
17.如權(quán)利要求4至16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的載體或核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞(20)，所述細(xì)胞(20)在其染色體DNA中摻入了至少一個(gè)編碼毒性分子(5)的第一核苷酸序列(21)，所述第一核苷酸序列被阻遏，優(yōu)選地受阻遏型啟動(dòng)子/操縱子核苷酸序列的調(diào)控，和/或受編碼針對(duì)所述毒性分子的解毒劑蛋白的第二基因序列的調(diào)控，所述第二核苷酸序列可能被阻遏，優(yōu)選地受阻遏型啟動(dòng)子/操縱子核苷酸序列的調(diào)控。
18.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其具有保藏號(hào)LMGP-21399。
19.一種克隆和/或測(cè)序試劑盒，其包含如權(quán)利要求4至10中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸構(gòu)建體，如權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的載體和/或如權(quán)利要求17或18所述的細(xì)胞，并且可能含有插入供體DNA分子(11)，該供體DNA分子(11)含有側(cè)翼是至少第一重組位點(diǎn)和可能的第二重組位點(diǎn)的第一DNA片段，所述第一重組位點(diǎn)與第二重組位點(diǎn)相互不重組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于選擇整合了目的基因(6)和編碼針對(duì)毒性分子(5)的功能性解毒劑蛋白(4)的核苷酸序列(3)的重組克隆的方法，其中所述重組克隆是被整合到宿主細(xì)胞(20)中后仍存活的重組克隆，所述宿主細(xì)胞的基因組中含有編碼所述毒性分子(5)的核苷酸序列(21)。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，含有所述核酸構(gòu)建體的載體，宿主細(xì)胞和用于實(shí)施所述方法的克隆和/或測(cè)序試劑盒。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1688699SQ02805357
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2002年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月23日
發(fā)明者P·伽班特, L·范枚爾德倫, C·Y·斯皮爾 申請(qǐng)人:布魯塞爾自由大學(xué)