專利名稱：一種生產(chǎn)具有預(yù)先選擇的免疫型和 /或基因型的純合干細(xì)胞群的方法 ,適于從其衍生的 ...的制作方法
一種生產(chǎn)具有預(yù)先選擇的免疫型和/或基因型的純合干細(xì)胞群的方 法，適于從其衍生的移植物的細(xì)胞，和使用它們的材料及方法本申請(qǐng)要求2001年1月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/258， 881 的權(quán)益。I. 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)純合干(HS)細(xì)胞同源群的方法，所述純合干細(xì) 胞是從供體純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞中進(jìn)行了免疫型 和/或基因型預(yù)先選擇。本發(fā)明還涉及使用這種組織相容性HS細(xì)胞進(jìn) 行診斷，治療性和整容移植，細(xì)胞替換和/或基因治療，并治療各種 遺傳病，神經(jīng)變性疾病，創(chuàng)傷性損傷和癌癥的方法.本發(fā)明還涉及使用預(yù)先選擇了非疾病基因型的組織相容性HS細(xì)胞 進(jìn)行預(yù)防性和治療性干預(yù)的方法，所述預(yù)防性和治療性干預(yù)包括但不 限制于診斷，治療性和整容移植(包括但不限制于為傷口和燒傷修復(fù) 而進(jìn)行的植皮，替換骨，軟骨和腱，用于斷肢重建和修復(fù)耳，鼻，唇， 和頭皮)，細(xì)胞替換和/或基因治療，及各種遺傳病，包括但不限制于 神經(jīng)變性疾病，創(chuàng)傷性損傷，和癌癥的治療.此外，本發(fā)明涉及使基因分型和/或HLA分型("免疫分型")HS細(xì) 胞分化，從而產(chǎn)生祖細(xì)胞和其它分化細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)或組織類型的方法。最后，本發(fā)明涉及為多個(gè)供體的HS細(xì)胞系提供分類的移植物庫(kù)的 方法，其中每個(gè)HS細(xì)胞系對(duì)于獨(dú)特的HLA單倍型是純合的，并與攜 帶這種單倍型的HLA成分的任何個(gè)體組織相容，目的是為診斷，治療 和/或移植提供穩(wěn)定，可靠，廣泛的細(xì)胞.此外，本發(fā)明所述方法可與2001年11月30日提交的，名稱為"分 離的純合干細(xì)胞，由其衍生的分化細(xì)胞，以及制備和使用上述細(xì)胞的 材料和方法"的美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240中公開的材料和方 法結(jié)合使用，該美國(guó)專利申請(qǐng)要求2000年11月30日提交的美國(guó)臨 時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943的權(quán)益，這兩篇美國(guó)專利申請(qǐng)都引入此處 作為參考。6II. 發(fā)明背景從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)體的組織移植有發(fā)生排斥的危險(xiǎn).危險(xiǎn)程度 與某些遺傳產(chǎn)物，即在供體和受體細(xì)胞表面表達(dá)的抗原之間的差異程 度成比例，為了確保移植成功，供體組織必須與受體組織免疫組織學(xué) 相容，也就是說(shuō)，供體和受體組織必須匹配。匹配是在供體組織表達(dá)"自身"抗原時(shí)實(shí)現(xiàn)的。然后，受體的T-細(xì)胞將識(shí)別作為"自身"的 供體組織，而且不會(huì)形成抗它的免疫應(yīng)答。在研究過(guò)的所有哺乳動(dòng)物物種中，存在著一個(gè)單一的遺傳基因座， 其編碼最強(qiáng)的移植抗原。它被認(rèn)為是主要的組織相容性復(fù)合體(MHC)。 人白細(xì)胞抗原(HLA)是MHC的人類對(duì)應(yīng)物的遺傳名稱.HLA以高度特 異的方式限制，并因此調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答.由HLA編碼的分子結(jié)合并呈遞 外源性的微生物抗原給個(gè)體自身的T-細(xì)胞.事實(shí)上，如果外源抗原存 在于個(gè)體自身的HLA分子中，那么它們只能被個(gè)體的T-細(xì)胞識(shí)別.因 此，HLA分子參與一個(gè)三-分子復(fù)合體，所述三-分子復(fù)合體由T-細(xì)胞 受體，外源微生物抗原，和自身HLA分子組成.在移植中，表達(dá)非自身HLA抗原的供體組織很容易被細(xì)胞毒性的T-細(xì)胞殺死.組織移植物可能基于HLA分子與自身HLA分子之間少至一 個(gè)氨基酸的不同而被排斥.據(jù)信，這種排斥的主要原因是非自身HLA 分子識(shí)別并與很多不能被自身HLA分子識(shí)別的肽形成復(fù)合體.T-細(xì)胞 對(duì)這些非自身HLA肽復(fù)合體不耐受，而且可能結(jié)合非自身HLA分子的 不同特征。因此，使供體和受體組織對(duì)HLA匹配可減少受體中細(xì)胞毒性T-細(xì) 胞應(yīng)答的可能性，并因此提高移植物存活的可能性.然而，匹配自身 也為移植提出了一個(gè)問題.首先，存在兩類HLA分子，I類和II類。 第二，每類HLA都有數(shù)個(gè)基因，這些基因的每一個(gè)都有很多等位基因 (即，HLA是多態(tài)的)。盡管HLA為個(gè)體提供多種免疫應(yīng)答能力，它使 得從一個(gè)個(gè)體到另 一個(gè)體的移植成為一項(xiàng)困難的工作，這是因?yàn)樗?得供體-受體的匹配難以達(dá)到.在人類中，I類HLA分于有3種基因，HLA-A， HLA-B，和HLA-Cw, II類HLA分子有三種基因，HLA-DR， -DP，和-DQ。此外，HLA基因是 多態(tài)的。有22種不同的HLA-A等位基因，42種不同的-B等位基因，9種不同的-Cw等位基因，和18種不同的-DR等位基因。加上匹配的 復(fù)雜性，個(gè)體有A, B， Cw，和DR等位基因中的兩個(gè)，其中一組A， B， Cw，和DR (單倍型)是從各自父母繼承的，因此個(gè)體對(duì)于A， B, Cw， 和DR單倍型可能是純合或雜合的。目前，使用HLA-A， -B， -Cw，和-DR匹配的，無(wú)關(guān)的供體組織進(jìn) 行移植會(huì)對(duì)組織分型來(lái)源提出很多要求.這主要是由于HLA基因的多 態(tài)性，及對(duì)高度嚴(yán)格匹配的需要，而高度嚴(yán)格的匹配是為了使排斥和 急性移植物抗宿主疾病最少. 一般來(lái)說(shuō)，由于肌A的多態(tài)性，找到對(duì) HLA- A， -B， -Cw，和-DR匹配的供體-受體的可能性為1/1， 000-1/幾 百萬(wàn)，這取決于患者組織類型在一般群體中的頻率.也見，Hansen, J. A. ， Anasetti， C. ， Peterdorf， E. ， Clift， R丄和Martin, P. J.， "沒有親緣關(guān)系的供體的骨髓移植"，Transplant Proc. ， 1994年6 月；26: 1719-1712 (綜述).本發(fā)明提供一種攜帶兩組相同HLA單倍型的細(xì)胞或組織的可靠來(lái) 源，它可顯著增加供體與受體之間組織學(xué)匹配的可能性，并因此用于 診斷，移植和/或治療.HS細(xì)胞是純合的，而且僅表達(dá)一種HLA單倍 型。因此， 一個(gè)供體HS細(xì)胞只有一個(gè)HLA單倍型與受體相匹配，而 雜合干細(xì)胞中則有兩個(gè)與之相匹配。HS細(xì)胞可從多個(gè)種族的供體隨機(jī) 采集，從而提供HS細(xì)胞群儲(chǔ)存庫(kù)或庫(kù)，所述HS細(xì)胞群與至少一個(gè)， 由一般群體的個(gè)體攜帶的單倍型免疫組織學(xué)匹配.該庫(kù)只需含有大約 200種不同的HS細(xì)胞系，每種都具有不同的HLA單倍型，從而適于絕大多數(shù)一般群體使用(即，提供適于移植的免疫組織相容性細(xì)胞).此外，人類基因療法還提出了對(duì)倫理道德的擔(dān)心.人們已經(jīng)描述 過(guò)僅涉及體細(xì)胞的遺傳操作與涉及生殖細(xì)胞的操作間的區(qū)別。體細(xì)胞 操作通常是允許的，因?yàn)樗鼈冎挥绊懟颊?，而生殖?xì)胞操作則是不允 許的，因?yàn)樗鼈冇绊懟颊叩暮蟠?此外，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究已經(jīng)證 實(shí)，基因缺陷只能通過(guò)胚胎的遺傳操作而被有效地校正.然而，由于 實(shí)際操作的原因，這種方法對(duì)于人類基因療法并不可行，例如，通過(guò) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合到細(xì)胞DNA中所引起的插入性誘變水平可能過(guò) 高。本發(fā)明還預(yù)期了基因-替代療法的顯著進(jìn)步。目前，基因療法還存 在著很多困難。有關(guān)疾病是否適于遺傳干預(yù)，是否已經(jīng)鑒定并克隆了疾病的基因，是否存在將基因引入細(xì)胞的有效途徑，基因是否能在除 受影響組織之外的其它組織中有效表達(dá)的擔(dān)心顯著阻礙了基因療法的 可行性。
因此，人們可很清楚地知道，本領(lǐng)域需要一種組織相容性細(xì)胞或 組織的可靠來(lái)源，它可用于移植和/或治療，包括基因治療。例如，
與遺傳病患者組織相容的HS細(xì)胞可在分化成用于移植的特定細(xì)胞類 型之前被遺傳操作。
III. 發(fā)明概述
本發(fā)明涉及分離的純合干(HS)細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)可通過(guò)免疫型和基 因型選擇這些細(xì)胞，因此用于診斷，移植和/或治療。
本發(fā)明還提供了 HS細(xì)胞系的儲(chǔ)存庫(kù)或庫(kù)，其中HS細(xì)胞系是通過(guò) 血清學(xué)或分子方法，對(duì)HLA-A， -B， -Cw，和-DR分型的，其可減少對(duì) 組織分型來(lái)源的要求。此外，本發(fā)明提供了不僅對(duì)免疫型，而且對(duì)基 因型進(jìn)行選擇的細(xì)胞.因此，它提供了一種治療遺傳病的方法，例如， 通過(guò)細(xì)胞移植，其中針對(duì)非疾病基因型預(yù)先選擇的HS細(xì)胞可被移植 到受影響區(qū)域。因此，有效提供沒有實(shí)際遺傳干預(yù)的基因療法.
此外，這里公開的本發(fā)明提供了生產(chǎn)HLA分型的HS細(xì)胞，和從其 衍生的祖細(xì)胞及分化細(xì)胞的方法。西此，本發(fā)明還可與2001年11月 30曰提交的，名稱為"分離的純合干細(xì)胞，從其衍生的分化細(xì)胞，及 制造和使用它們的方法"的美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240和美國(guó) 臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943結(jié)合使用，其中美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第 60/253, 943提供了多能純合干(HS)細(xì)胞，制造它們的方法和材料， 及體內(nèi)或體外把HS細(xì)胞分化成祖細(xì)胞或其它所需分化細(xì)胞，細(xì)胞群 或組織的方法。
HS細(xì)胞是移植到活體動(dòng)物中時(shí)，在激活未受精的，減數(shù)分裂I后 的二倍體生殖細(xì)胞時(shí)從干質(zhì)(stemplasm)產(chǎn)生的.另一個(gè)目的是從 所述干質(zhì)發(fā)育的各個(gè)階段分離HS細(xì)胞。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供選 擇細(xì)胞的方法，該細(xì)胞是從所述干質(zhì)中分離出來(lái)的。
本發(fā)明的HS細(xì)胞是多能的，而且不會(huì)產(chǎn)生對(duì)倫理道德的擔(dān)心，因 為它們是從未受精的，而且不能發(fā)育成活胚胎的細(xì)胞團(tuán)中分離出來(lái) 的。此外，當(dāng)把雜合ES細(xì)胞系用于組織或細(xì)胞移植療法中，或保存在庫(kù)和/或儲(chǔ)存庫(kù)中時(shí)，免疫組織相容性匹配難以完成。這是因?yàn)镋S 細(xì)胞系，包括通過(guò)高級(jí)細(xì)胞技術(shù)和其它組織發(fā)育成的那些，來(lái)源于受 精的胚胎，或來(lái)源于使用成人分化細(xì)胞的核移植技術(shù)，而且ES細(xì)胞 系是基因組雜合的(例如，W001/84920A1 ， W001/79445A2和 W001/29206A1)。因?yàn)楸景l(fā)明來(lái)源于減數(shù)分裂I后的生殖細(xì)胞，或干 質(zhì)的多能干細(xì)胞是基因組純合的(具有最低的雜合性或均勻的純合 性)，或選擇MHC純合性(如，在兩個(gè)單倍體生殖細(xì)胞融合及核轉(zhuǎn)移 的情況下)，因此這種細(xì)胞可用于克服目前所用移植，細(xì)胞替換，和 基因治療技術(shù)所面臨的免疫組織相容性問題，其中所述基因治療技術(shù) 使用的是ES細(xì)胞系，或保存ES細(xì)胞系的庫(kù)和/或儲(chǔ)存庫(kù)。
在配子發(fā)生過(guò)程中，雜合生殖細(xì)胞，即，具有父本和母本染色體 的生殖細(xì)胞，經(jīng)歷減數(shù)分裂。在第一次減數(shù)分裂(減數(shù)分裂I)中， 同源染色體分離形成兩個(gè)純合的子細(xì)胞，其含有父本或母本染色體， 所述父本或母本染色體具有某些由于交叉現(xiàn)象而引入的雜合性.此 外，在卵子發(fā)生過(guò)程中，觀察到一個(gè)子細(xì)胞(第一極體)擠出。另一 個(gè)子細(xì)胞在分裂中期II停止。這種分裂中期II的二倍體卵母細(xì)胞可 用于衍生具有最小雜合性的純合干細(xì)胞。
在適當(dāng)激活后，分裂中期II的卵母細(xì)胞可通過(guò)一個(gè)染色單體(即， 第二極體)的擠出而繼續(xù)進(jìn)行完全的減數(shù)分裂，并產(chǎn)生單倍體細(xì)胞. 這種減數(shù)分裂完全的單倍體卵母細(xì)胞在沒有胞質(zhì)分裂的情況下自我復(fù) 制，使它成為二倍體，而且均勻純合。因此，這種減數(shù)分裂完全的單 倍體卵母細(xì)胞也可用于生產(chǎn)本發(fā)明沒有雜合性的純合干細(xì)胞.還見， Kaufman M. H. ， Robertson E. J. ， Handyside A, H. ， Evans M. J.，"從 單倍體的小鼠胚胎建立多能細(xì)胞系"，J. Embryol.Exp.Morphol.， 73: 249-61 ( 1983 ).來(lái)源于干質(zhì)的干細(xì)胞也具有上述純合性，所述干 質(zhì)來(lái)源于減數(shù)分裂I或II后的生殖細(xì)胞。來(lái)源于個(gè)體兩個(gè)單倍體生 殖細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移或融合的干細(xì)胞可能具有較大程度的雜合性，然而， 可選擇對(duì)于MHC純合的那些，并用于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療應(yīng)用中。
具有最低雜合性和均勻純合性的HS細(xì)胞要優(yōu)于具有雜合ES細(xì)胞 (如，來(lái)源于4吏用受精胚胎，核轉(zhuǎn)移，治療性克隆胚胎，和成人干細(xì) 胞)的干細(xì)胞，其中純合干細(xì)胞可含有兩組相同的主要組織相容性復(fù) 合體(MHC)單倍型。因此，使用HS細(xì)胞更容易獲得供體與需要進(jìn)行移植治療的個(gè)體之間的免疫組織相容性匹配。這種對(duì)于一個(gè)MHC單倍 型純合的干細(xì)胞不僅可被攜帶相同單倍型的受體耐受，而且可被在親 本單倍型中具有相同MHC成分的受體耐受.
人類的MHC基因座位于染色體6上的4Mb內(nèi)，而且MHC等位基因 通常是整體遺傳的。某些MHC等位基因組合以明顯更高的頻率在群中 分配，例如，有21. 3%的白種美國(guó)人具有15個(gè)最常見的HLA-A， -B， -Cw， -DR單倍型，而且單倍型頻率的相似觀察結(jié)果也可在其他人種中 見到。此外， 一個(gè)種族群體中的常見HLA單倍型也可被其他群體共有. 例如，白種美國(guó)人184個(gè)普通單倍型中的156個(gè)單倍型至少被非洲美 國(guó)人，亞洲美國(guó)人，拉丁美國(guó)人，或本地美國(guó)人共有。其他種族群體 的普通單倍型數(shù)及相應(yīng)的共有單倍型數(shù)是非洲美國(guó)人(198/63 ); 亞洲美國(guó)人(210/100 );拉丁美國(guó)人(194/147 );和本地美國(guó)人 (194/173 )。 Mori, M.等，"北美人群中HLA基因和單倍型的頻率國(guó) 家骨髓供體計(jì)劃供體登記庫(kù)"，移植64 ( 7 ) : 1017-27 ( 1997 ).考慮 到支持這種連鎖不平衡的證據(jù)，使用來(lái)源于未受精的，減數(shù)分裂I后 的二倍體配子的HS細(xì)胞可減少免疫學(xué)上不同的細(xì)胞系數(shù)，而細(xì)胞系 需要保存在用于進(jìn)行組織或細(xì)胞移植的干細(xì)胞庫(kù)或儲(chǔ)存庫(kù)中。
因此，可能有幾百個(gè)對(duì)不同單倍型純合的干細(xì)胞系就足以匹配人 群的大多數(shù)。與維持干細(xì)胞系庫(kù)或儲(chǔ)存庫(kù)所需的單倍型數(shù)相比，這個(gè) 數(shù)算是非常小了，其中所述干細(xì)胞系來(lái)源于胚胎干細(xì)胞，成人干細(xì)胞， 或治療性克隆干細(xì)胞。例如，每200個(gè)單倍型有超過(guò)20, 000種雜合 可能性(

圖1).
當(dāng)與美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240，和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第 60/253， 943描述的發(fā)明結(jié)合使用時(shí)，本發(fā)明可用于，包括但不限制于， 各種疾病，如遺傳病，神經(jīng)變性疾病，與內(nèi)分泌有關(guān)的疾病和癌癥， 創(chuàng)傷性損傷的診斷和治療，整容和治療性移植，和基因治療及細(xì)胞替 換治療。
本發(fā)明提供一種生產(chǎn)純合干細(xì)胞群的方法，所述純合干細(xì)胞是針 對(duì)免疫型和/或基因型選擇的.使用本領(lǐng)域已知的血清學(xué)和/或分子技 術(shù)，可對(duì)HS細(xì)胞進(jìn)行HLA-A， -B， -Cw，和-DR的免疫分型。使用本
領(lǐng)域已知的分子技術(shù)，可針對(duì)基因型進(jìn)一步選擇HS細(xì)胞。然后，這 種HS細(xì)胞還可用于衍生祖細(xì)胞，和/或其它分化細(xì)胞，細(xì)胞群或組織類型，這是使用美國(guó)專利申請(qǐng)系列第07/997, 240和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系 列第60/253, 943描述的方法進(jìn)行的，這兩篇申請(qǐng)均引入此處作為參 考。此外，本發(fā)明還提供使用來(lái)源于預(yù)-HLA分型的HS的分化細(xì)胞和/ 或組織用于治療性或整容移植，和/或治療遺傳和神經(jīng)變性疾病，創(chuàng) 傷性損傷及癌癥的方法。
本發(fā)明其中一個(gè)目的是提供一種從有絲分裂激活的，純合的，減 數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞生產(chǎn)純合干細(xì)胞群的方法，其中所述生 殖細(xì)胞具有靶免疫型，這樣它們才適于移植到目標(biāo)受體中，該方法是 通過(guò)(a)分析免疫型，即，目標(biāo)受體的純合或雜合HLA單倍型，從 而確定靶免疫型，(b)生產(chǎn)有絲分裂激活的，減數(shù)分裂I后的二倍體 生殖細(xì)胞樣品，從而產(chǎn)生多個(gè)胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)都含有一個(gè)對(duì)于特 定HLA單倍型純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)， (c)確定每個(gè)所述ICM的免疫 型，以便選擇攜帶靶HLA單倍型的那一個(gè)，和(d)培養(yǎng)從所選ICM 中分離出來(lái)的HS細(xì)胞，產(chǎn)生對(duì)靶HLA單倍型純合的永久HS細(xì)胞系. 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供來(lái)源于目標(biāo)受體，或目標(biāo)受體的近親，或與 目標(biāo)受體沒有親緣關(guān)系的人的HS細(xì)胞，他們都攜帶至少一個(gè)與目標(biāo) 受體共有的HLA單倍型.已知技術(shù)可用于鑒定并采集攜帶靶HLA單倍 型的HS細(xì)胞，并確定目標(biāo)受體和供體的免疫型。
如美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第 60/253, 943中的詳細(xì)描述，這兩篇申請(qǐng)均引入此處作為參考，HS細(xì) 胞來(lái)源于胚泡樣團(tuán)，而胚泡樣團(tuán)是通過(guò)下列步驟產(chǎn)生的(a)融合兩 個(gè)卵母細(xì)胞或兩個(gè)精子細(xì)胞；(b)在卵子發(fā)生過(guò)程中，阻止第二極體 擠出；(c)在適當(dāng)條件下，使第二極體擠出，并進(jìn)行自發(fā)的基因組自 我-復(fù)制；或(d)把兩個(gè)單倍體卵核或精核轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞中， 其中方法(a)和(d)還需要附加的，通過(guò)基因型分析篩選純合干細(xì) 胞的步驟。
本發(fā)明另 一個(gè)目的是提供一種從干質(zhì)中分離受體組織相容性純合 干細(xì)胞群的方法，其中干質(zhì)是按照美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240 和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943中詳細(xì)描述的過(guò)程生產(chǎn)的，這兩 篇申請(qǐng)均引入此處作為參考。這種受體組織相容性HS細(xì)胞群可通過(guò) 下列步驟生產(chǎn)，(a)測(cè)定目標(biāo)受體的免疫型和基因型，從而確定靶免 疫型和基因型；(b)有絲分裂激活供體純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞，從而發(fā)育成多個(gè)胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)團(tuán)都含有一個(gè)對(duì)于
特定等位基因純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)UCM); (c)從所選的ICM中分離HS 細(xì)胞，并培養(yǎng)所述HS細(xì)胞，從而產(chǎn)生細(xì)胞系；(d)測(cè)定每個(gè)所述HS 細(xì)胞系的基因型，并選擇對(duì)于靶基因型純合的那一個(gè)。所述HS細(xì)胞 可能是從干質(zhì)鑒定的，所述干質(zhì)是在移植后通過(guò)組織學(xué)方法生產(chǎn)的， 而且已經(jīng)對(duì)適當(dāng)?shù)腍LA單倍型和基因型進(jìn)行了測(cè)定。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種從有絲分裂激活的，純合的，減數(shù) 分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞生產(chǎn)受體組織相容性純合干細(xì)胞群的方 法，其中所述生殖細(xì)胞具有靶基因型，即，靶基因的非疾病等位基因， 這樣它們可適于移植到目標(biāo)受體中，該方法是通過(guò)下列步驟進(jìn)行的 (a)確定目標(biāo)受體的基因型和HLA-單倍型，從而確定靶免疫型和基 因型；(b)有絲分裂激活供體純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì) 胞，從而發(fā)育成多個(gè)胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)團(tuán)都含有一個(gè)對(duì)于特定等位 基因和特定HLA單倍型純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM); ( c )從所述ICM中分 離HS細(xì)胞，并培養(yǎng)所述HS細(xì)胞，從而產(chǎn)生細(xì)胞系；(d)確定每個(gè)所 述HS細(xì)胞系的HLA單倍型和基因型，并選擇攜帶靶HLA單倍型和基 因型的那一個(gè)。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供HS細(xì)胞，所述HS細(xì)胞來(lái)源于攜帶一個(gè) 功能性等位基因的目標(biāo)受體，或目標(biāo)受體的近親，或與目標(biāo)受體沒有 親緣關(guān)系的人，他們攜帶至少一個(gè)與目標(biāo)受體共有的HLA單倍型，和 至少一個(gè)耙基因的非疾病等位基因。已知技術(shù)可用于測(cè)定并采集攜帶 靶HLA單倍型和把基因型的HS細(xì)胞，并確定目標(biāo)受體和供體的免疫 型和基因型。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供制造所需細(xì)胞，細(xì)胞群，或組織類型的 方法，該方法包括在適宜條件下，使用體內(nèi)或體外因子，直接分化分 離的免疫分型的和/或基因分型的HS細(xì)胞，從而得到所需的細(xì)胞，細(xì) 胞群或組織類型.代表性的組織包括，但不限制于，上皮組織，結(jié)締 組織，肌肉姿且織或神經(jīng)組織。
上皮細(xì)胞的代表性類型包括，但不限制于，角質(zhì)化上皮細(xì)胞；濕 潤(rùn)-復(fù)層屏障上皮；被覆上皮細(xì)胞；外分泌-分泌上皮細(xì)胞；內(nèi)分泌-分泌上皮細(xì)胞；細(xì)胞外基質(zhì)-分泌上皮細(xì)胞；吸收上皮細(xì)胞，如胃腸 道，外分泌腺，和生殖泌尿道的那些；及可收縮上皮細(xì)胞。結(jié)締組織細(xì)胞的代表性類型包括，但不限制于，細(xì)胞外基質(zhì)-分泌細(xì)胞；特化 用于新陳代謝和貯藏的細(xì)胞；和血液及免疫系統(tǒng)的循環(huán)細(xì)胞.肌細(xì)胞 的代表性類型包括，但不限制于，可收縮細(xì)胞和具有推進(jìn)功能的纖毛 細(xì)胞。神經(jīng)或感覺細(xì)胞的代表性類型包括，但不限制于，感覺傳感器； 自主神經(jīng)元；感覺器官和外周神經(jīng)元的支持細(xì)胞；及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞.生殖細(xì)胞的代表性類型包括，但不限制于， 生殖細(xì)胞和撫育細(xì)胞.
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種含有來(lái)源于多個(gè)供體的預(yù)-HLA分型 的HS細(xì)胞群的分類的庫(kù)或儲(chǔ)存庫(kù)，其中每個(gè)群對(duì)于至少一個(gè)HLA單 倍型是純合的，以便為診斷，移植和/或治療提供可靠，穩(wěn)定，廣泛 的免疫組織相容性細(xì)胞.
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種治療個(gè)體紊亂或疾病狀況的方法， 該方法包括從分離的HS細(xì)胞原位或體外生產(chǎn)適宜的替代細(xì)胞，細(xì)胞 群，組織或器官，其中所述分離的HS細(xì)胞與所述個(gè)體免疫組織學(xué)相 容，代表性的紊亂和疾病狀況包括，但不限制于，創(chuàng)傷性損傷(例如， 創(chuàng)傷后的修復(fù)和再造，肢體替換，脊髄損傷，燒傷等)和先天性缺陷； 細(xì)胞，組織，和器官的病理學(xué)和惡性狀況(例如，癌癥)；和肌肉(例 如，嚢性纖維化，肌營(yíng)養(yǎng)不良，心臟狀況)，神經(jīng)(例如，阿爾茨海 默氏病，帕金森氏病和多發(fā)性硬化)，上皮(例如，失明和肌病，動(dòng) 脈粥樣硬化及其它狹窄性血管狀況，酶缺乏，如克隆氏病，和激素缺 乏，如糖尿病)，及結(jié)締組織(例如，免疫狀況和貧血)的細(xì)胞和組 織的變性及先天性疾病.需要時(shí)，可將HS-衍生的細(xì)胞和組織移植到 被試者中，優(yōu)選使用被試者自身的供體材料.
本發(fā)明這些和其它目的是通過(guò)下面的詳細(xì)描述，實(shí)施例，和權(quán)利 要求完整描述的，它們都不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
IV. 附圖簡(jiǎn)述
圖1:描述非-HS細(xì)胞庫(kù)與HS細(xì)胞庫(kù)所需的細(xì)胞量差異的圖。 圖2:舉例說(shuō)明從減數(shù)分裂I后的卵母細(xì)胞衍生HS細(xì)胞的簡(jiǎn)圖. 圖3:表示精子發(fā)生和卵子發(fā)生的圖。 圖4A:表示HLA基因座的血清學(xué)特異性的表。圖4B:正式識(shí)別的HLA-DR和HLA-DQ的特異性。 圖5:用于II類HLA等位基因的基因型分析的代表性限制性內(nèi)切 核酸酶列表.
圖6:用于II類HLA分型的代表性SSO探針列表。
圖7:用于微衛(wèi)星分型和測(cè)序的代表性引物序列的列表.
圖8:表示12個(gè)微衛(wèi)星相對(duì)位置的I， II，和III類HLA區(qū)的圖。
圖9A: C57/駆2小鼠。
圖9B:超數(shù)排卵-衍生的胚泡樣團(tuán)
圖9C:典型集落I
圖9D:典型集落II
圖9E:基因型分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
圖9F:免疫分型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
圖10A:來(lái)源于小鼠HS細(xì)胞的，在飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)的分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán) 的照片。
圖10B:描述桑葚胚樣團(tuán)生長(zhǎng)的照片，所述桑葚胚樣團(tuán)來(lái)源于人純 合的，減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細(xì)胞.
圖10C:早期胚泡樣團(tuán)的照片，所述胚泡樣團(tuán)來(lái)源于人純合的，減 數(shù)分裂I后的二倍體卵母細(xì)胞.
圖10D:胚泡樣團(tuán)的照片，顯示內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來(lái)源于人純合的，減數(shù)分 裂I后的二倍體卵母細(xì)胞.
圖11:用于擴(kuò)增II類HLA等位基因的PCR引物的代表性列表.
L 本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明和優(yōu)選實(shí)施方案
這里引證的所有參考文獻(xiàn)全部引入此處作為參考。這里沒有什么 被認(rèn)為是由于先前發(fā)明的這種公開而使本發(fā)明不能被授權(quán)，通過(guò)這種 描述，給出的優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)施例被認(rèn)為是舉例說(shuō)明，而不是對(duì)本 發(fā)明的限制。
A.紐
在本發(fā)明中，HS細(xì)胞系是指來(lái)源于胚泡樣團(tuán)的于細(xì)胞，而所迷胚 泡樣團(tuán)則來(lái)源于未受精純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞的有 絲分裂激活，或兩個(gè)單倍體生殖細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移或融合，HS細(xì)胞系統(tǒng)還指來(lái)源于天然存在的致畸組織的干細(xì)胞，及來(lái)源于美國(guó)專利申請(qǐng)系列
第09/997, 240，和美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列第60/253, 943所述的干質(zhì) 的干細(xì)胞，其中所述這兩篇專利申請(qǐng)均引入此處作為參考。從HS細(xì) 胞系統(tǒng)分離的HS細(xì)胞是多能的，而且在適宜條件下，可分化產(chǎn)生多 能的祖細(xì)胞，體細(xì)胞前體，和其它類型的分化細(xì)胞。
"分化"是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞成長(zhǎng)為正 常的功能細(xì)胞。分化細(xì)胞具有不同的特性，發(fā)揮特定的功能，而且很 少會(huì)分裂。相反，未分化的細(xì)胞會(huì)迅速分裂成具有非特異性表觀和多 種非特異性活性及功能的不成熟的胚細(xì)胞或原始細(xì)胞。
此處所用術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞"是指相對(duì)未分化的細(xì)胞，它活躍地分裂 并循環(huán)，對(duì)成熟，分化的功能細(xì)胞系產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拇碳?干細(xì)胞的定義 性質(zhì)包括(a)它不會(huì)自身最終分化；(b)在動(dòng)物的一生中，它可無(wú) 限制地分裂；而且(c)當(dāng)它分裂時(shí)，每個(gè)子代都可選擇是保留干細(xì) 胞，還是開始不可逆導(dǎo)致最終分化的過(guò)程.最初能力沒有受到限制 (即，能夠產(chǎn)生多種類型的分化細(xì)胞)的那些干細(xì)胞是所謂"多能的". 目前多能細(xì)胞的來(lái)源包括胚胎(ES)干細(xì)胞，胚胎(EC)癌細(xì)胞，從 體細(xì)胞克隆，畸胎瘤，畸胎癌產(chǎn)生的細(xì)胞.
祖細(xì)胞系，每個(gè)都能夠從三個(gè)胚層，即內(nèi)胚層，中胚層和外胚層 中的一個(gè)產(chǎn)生細(xì)胞，在本申請(qǐng)中被稱作"多能的".盡管每個(gè)祖細(xì)胞 系都不會(huì)最終分化，而且在動(dòng)物的一生中，它還可以繼續(xù)分裂，認(rèn)為 僅僅一種類型的胚層就可將定型為不同的組織或細(xì)胞.因此，特定的 祖細(xì)胞系可分化成骨，軟骨，平滑肌，橫紋肌和造血細(xì)胞(中胚層)； 肝，原腸，和呼吸道上皮(內(nèi)胚層)；或神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，毛 嚢和芽蕾(外胚層)。因此，術(shù)語(yǔ)"祖細(xì)胞"可與"多能干細(xì)胞"或 "前體細(xì)胞"同義使用。這種祖細(xì)胞系，它是通過(guò)體內(nèi)(其中術(shù)語(yǔ)"體 內(nèi)"包括通過(guò)將所述HS細(xì)胞包在無(wú)免疫應(yīng)答的動(dòng)物中而誘導(dǎo)分化， 進(jìn)而從這種包被細(xì)胞而生產(chǎn)干質(zhì))或體外HS細(xì)胞的直接分化產(chǎn)生的， 可作為永久細(xì)胞系維持在培養(yǎng)基中。
"畸胎瘤"是細(xì)胞的無(wú)規(guī)則團(tuán)，所述細(xì)胞含有多種類型的分化組 織，來(lái)源亍全部三個(gè)胚層的組織，如骨，肌肉，軟骨，神經(jīng)，芽蕾， 腺上皮等，這些細(xì)胞與繼續(xù)分裂并產(chǎn)生更多這些分化組織的未分化干 細(xì)胞混合。"畸胎癌"繼發(fā)于畸胎瘤.畸胎瘤大多是良性的；然而如果它們 變成惡性的，就會(huì)發(fā)展成畸胎癌，并可導(dǎo)致宿主死亡.與其它腫瘤相 比，畸胎瘤顯示出獨(dú)特的組織學(xué)特征。它們是由各種分化組織組成的， 包括表皮，中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，或成熟的軟骨.它們還含有非特異性 組織類型，例如，淋巴組織或纖維性基質(zhì)。
"干質(zhì)(stemplasm)"是一個(gè)新派生的術(shù)語(yǔ)，用于描述在HS細(xì)胞 移植到宿主中后生長(zhǎng)的團(tuán)。與畸胎瘤不同，干質(zhì)表現(xiàn)為受控生長(zhǎng)，同 時(shí)仍然含有來(lái)源于全部三個(gè)胚層的細(xì)胞，因此，它可被用作本發(fā)明HS 細(xì)胞體內(nèi)分化的工具。
"純合干細(xì)胞"是一種來(lái)源于未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體 生殖細(xì)胞的未分化干細(xì)胞，優(yōu)選，它是通過(guò)在卵子發(fā)生過(guò)程中阻止第 二極體擠出，或使第二極體擠出，并在適宜條件下，使單倍體卵母細(xì) 胞進(jìn)行自發(fā)的基因組自我-復(fù)制而形成的.純合干(HS)細(xì)胞是產(chǎn)生 自胚泡樣團(tuán)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離細(xì)胞，所述胚泡樣團(tuán)在"有絲分裂激活" 未受精的生殖細(xì)胞時(shí)生長(zhǎng)，這可通過(guò)下列步驟實(shí)現(xiàn)(a)融合兩個(gè)卵 母細(xì)胞或兩個(gè)精子細(xì)胞；(b)在卵子發(fā)生過(guò)程中，阻止第二極體擠出； (c)在適當(dāng)條件下，使笫二極體擠出，同時(shí)進(jìn)行自發(fā)的基因組自我-復(fù)制；或(d)把兩個(gè)單倍體卵核或精核轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞中.
在哺乳動(dòng)物的發(fā)育中，裂解產(chǎn)生一種薄壁中空的球體，即"胚泡"， 胚胎由一側(cè)的細(xì)胞團(tuán)表示的，其它則被稱為"內(nèi)細(xì)胞團(tuán)"。胚泡是在 移植前形成的，并相當(dāng)于"囊胚"。薄壁中空球體的壁被稱作"滋養(yǎng) 層"，它是在哺乳動(dòng)物胚泡周圍形成，并連接胚胎和子宮壁的上皮的 外胚層。所述滋養(yǎng)層形成絨毛膜的外層，并與母體組織一起形成胎盤.
在本發(fā)明中，"胚泡樣團(tuán)"與(本領(lǐng)域所用的)"胚泡"不同，因 為它是有絲分裂激活的，未受精的，減數(shù)分裂I后的生殖細(xì)胞產(chǎn)物.
此處所用術(shù)語(yǔ)"有絲分裂激活的"是指經(jīng)有絲分裂而獲得進(jìn)行規(guī) 則細(xì)胞分裂的能力.有絲分裂激活是指激活生殖細(xì)胞，這樣一來(lái)，減 數(shù)分裂II或者(1)繼續(xù)，而且在它們的基因組沒有胞質(zhì)分裂而自我 復(fù)制后，單倍體配子細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂，或(2)繼續(xù)，但單倍體配 于細(xì)胞不能核分裂和胞質(zhì)分裂，然后經(jīng)歷有絲分裂，
此處所用術(shù)語(yǔ)"純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞"是指 配子發(fā)生階段的生殖細(xì)胞，該階段的細(xì)胞含有父本或母本同源染色體的兩個(gè)拷貝。且單倍體生殖細(xì)胞是指已經(jīng)完成減數(shù)分裂，而且只攜帶 染色體的一個(gè)拷貝的生殖細(xì)胞。
"等位基因"是遺傳基因座的替代形式。每個(gè)基因座的單一等位 基因是分別從各自父母繼承的。在本發(fā)明中，如果細(xì)胞含有同一等位 基因的兩個(gè)拷貝，則它被歸為"純合的"。相反，"雜合的"細(xì)胞含有 同一遺傳基因座的兩個(gè)不同的等位基因。
在本發(fā)明中，個(gè)體的"免疫型"是通過(guò)位于細(xì)胞表面的蛋白，即 組織相容性抗原的獨(dú)特排列描述的。在人類中，這些組織相容性抗原
被稱作人白細(xì)胞抗原或HLAs，即一種在身體細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的基因遺傳
蛋白的復(fù)合體家族。
細(xì)胞免疫型的主要決定簇是HLA分布，即白細(xì)胞和血小板上的遺
傳指紋，它由在激活機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)外源生物體應(yīng)答中起重要作用的 蛋白組成。HLAs可決定移植過(guò)程中，預(yù)定宿主與可能供體之間是否匹 配.對(duì)HLA抗原的反應(yīng)是組織移植排斥的主要原因.HLA因子是從母 親和父親繼承的(分別從每個(gè)人中繼承一個(gè))，因此具有相同HLA型 的最大機(jī)會(huì)在兄弟姐妹之間(例如，1/4).與宿主天然細(xì)胞的那些一 樣，具有相同免疫型或HU分布的外源細(xì)胞可被宿主"自身"接受， 而且不會(huì)被宿主的免疫系統(tǒng)排斥。
HLA抗原是通常作為完整單位遺傳的單一染色體上，多個(gè)緊密連接 基因的產(chǎn)物。這種組織相容性復(fù)合體，或HLA區(qū)，還含有對(duì)補(bǔ)體和免 疫應(yīng)答非常重要的基因.
HLA基因復(fù)合體含有至少4個(gè)基因座，即HLA-A， -B， -Cw，和-DR, 有兩類HLA抗原，I類由HLA-A， -B，和-Cw組成.有22個(gè)不同的HLA-A 抗原，42個(gè)不同的-B抗原，9個(gè)不同的-Cw抗原，和18個(gè)不同的-DR 抗原。HLA-A， -B，和-C抗原幾乎在所有人類細(xì)胞上表達(dá)，個(gè)體I類 HLA的分布可用于確定個(gè)體之間，如腎，骨髄等移植中的可能供體和 受體之間的相容性的程度或遺傳關(guān)系，還可用于確定血小板或白細(xì)胞 的融合，或用于系譜研究。I類抗原可通過(guò)血清學(xué)方法鑒定.例如， 個(gè)體I類HLA的分布可通過(guò)使用一系列抗血清培養(yǎng)樣品淋巴細(xì)胞而確 定，其中所迷抗血清對(duì)亍某些A-， B-，或C-基因座抗原而言，具有 已知的特異性。陽(yáng)性細(xì)胞/血清的相互作用描述了細(xì)胞的HLA抗原。
II類由HLA-DR和-DQ組成。有18種不同的DR抗原。這些抗原通常在B淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨謹(jǐn)細(xì)胞，樹突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)， 雖然它們是通過(guò)免疫刺激在其它細(xì)胞上被誘導(dǎo)的。II類抗原(例如， DRP1， DRP3， DRP4， DRP5，和DQ 0 1基因)可通過(guò)患者DNA的血 清學(xué)和/或分子分析而檢測(cè)，如果只要求中分辨率分型，那么人們可 對(duì)基因的所有區(qū)使用序列特異性寡核苷酸探針(SS0P)。如果要求高 分辨率(等位基因水平)分型，可使用SS0P試驗(yàn)與DNA測(cè)序的結(jié)合。 高分辨試驗(yàn)通常只在骨髓受體和他們未來(lái)的供體上進(jìn)行，這種情況 下，更高程度的匹配是必需的。
表達(dá)一個(gè)或多個(gè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的HLA蛋白的細(xì)胞被宿主的免疫 系統(tǒng)當(dāng)作"自身"而感覺，而表達(dá)其它HLA蛋白的那些則被當(dāng)作"外 源"或"非自身"而感覺.宿主免疫系統(tǒng)可促進(jìn)對(duì)"外源"或"非自 身"蛋白的應(yīng)答，并消滅外源組織，如果外源組織是移植的器官，那 么這種應(yīng)答被稱為排斥.
在本發(fā)明中，如果供體細(xì)胞可沒有排斥地，穩(wěn)定地移植到宿主中， 那么它們"適于移植"給預(yù)定宿主.為適于移植，供體細(xì)胞必須與預(yù) 定宿主"組織相容"，即HLA "匹配"，如果HLA基本匹配，那么免疫 系統(tǒng)很少會(huì)應(yīng)答。人類從他們父母的第6個(gè)染色體上繼承HLA蛋白. 因?yàn)橐粋€(gè)人得到兩個(gè)染色體6s (通常， 一個(gè)來(lái)源于母親， 一個(gè)來(lái)源于 父親)，因此每人HLA蛋白的一半與我們父母各方匹配。匹配的HLA 蛋白越多，則移植器官被受體排斥的可能性越小。
個(gè)體具有兩個(gè)A， B， Cw，和DR等位基因，其中一組A， B， Cw， 和DR ("單倍型")是從各自父母遺傳的.此外，個(gè)體對(duì)于A， B， Cw， 和DR單倍型可能是純合的或雜合的.在本發(fā)明中，如果供體細(xì)胞不 表達(dá)對(duì)受體而言是外源性的HU產(chǎn)物，那么供體細(xì)胞被認(rèn)為與目標(biāo)受 體HLA "匹配"或"組織相容".例如，對(duì)于單倍型如HLA-A1， -Cw7， -B8或HLA-A29， -Cw7， -B8純合的供體細(xì)胞可匹配具有雜合HLA分布 的受體，所述HLA分布具有HLA-A1， -Cw7， -B8或HLA-A29， -Cw8， -B65單倍型。
此處所用術(shù)語(yǔ)"基因型"是指生物體或生物體群的基因組成。在 本發(fā)明中，"靶"基因型可以是正?；蛞吧托蛄?，即，基因序列與 特定的病理學(xué)紊亂無(wú)關(guān)。這種病理學(xué)紊亂通常被稱作"遺傳病"，是 指它們與突變基因的表達(dá)有關(guān)。遺傳病通常由特定基因突變引起。在本發(fā)明中，與病理學(xué)有關(guān)的基因突變或者是遺傳的(例如，遺傳病)， 或者是誘導(dǎo)的(例如，與致癌物接觸)，
代表性的遺傳病包括，但不限制于，阿爾茨海默氏病，糖尿病， 格雷夫斯氏病，血友病，亨廷頓氏舞蹈病，肌營(yíng)養(yǎng)不良，帕金森氏病，
鐮狀細(xì)胞性貧血，和各種代謝疾病(即，酶缺乏，如苯丙酮酸尿(PKU) 及嚴(yán)重混合免疫缺陷癥(SCID)).代表性的誘導(dǎo)遺傳病包括，但不限 制于癌癥和多發(fā)性硬化。
遺傳病和與其有關(guān)的人類基因的目錄可通過(guò)Online Mendelian Inheritance in Man (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIN
(TM)， McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine, Johns Hopkins University ( Baltimore, MD ) 和 National Center for Biotechnology Information ， National Library of Medicine
( Bethesda ， MD )， 2000. World Wide Web URL: http: 〃兩.ncbi. nlm. nih. gov/omim)得到，OMIM是一個(gè)大的， 遺傳病，紊亂和性狀的檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，而且它們不同的表現(xiàn)形式由 National Center for Biotechnology Information (NCBI)維持。OMIM 可在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上使用。
B.本發(fā)明純合干細(xì)胞的產(chǎn)生
如美國(guó)申請(qǐng)系列第09/997, 240的詳細(xì)描述，HS細(xì)胞是從胚泡樣團(tuán) 中分離出來(lái)的，而胚泡樣團(tuán)有絲分裂激活未受精的，減數(shù)分裂I后的 二倍體生殖細(xì)胞后生長(zhǎng)。圖2提供了流程圖，表示從未受精的，減數(shù) 分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞發(fā)育成HS細(xì)胞的優(yōu)選方法.
激活之后，生殖細(xì)胞生長(zhǎng)成未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體生 殖細(xì)胞，從而產(chǎn)生可衍生本發(fā)明HS細(xì)胞的胚泡樣團(tuán)。本發(fā)明的HS細(xì) 胞，和/或分化細(xì)胞可用于診斷和/或治療疾病，包括但不限制于，在 需要這種治療時(shí)，將其移植到受影響的個(gè)體中。
而純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞可從相同個(gè)體獲得， 或從免疫相容性供體獲得，在某些情況下，優(yōu)選自身供體。然而，如 果為患有遺傳病的受影響個(gè)體(例如，缺乏重要基因的疾病，或由于 突變或不適當(dāng)表達(dá)導(dǎo)致的疾病)選擇療法，優(yōu)選使用非自身供體?？?選擇地，進(jìn)行選擇的本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇具有所需基因型的那些自身生殖細(xì)胞(例如，缺乏裂縫或突變基因的細(xì)胞)，能夠表達(dá)缺陷基 因的那些細(xì)胞.這種選擇技術(shù)還可用于防止免疫-不相容性基因型或 表型進(jìn)行組織移植。
對(duì)于HLA單倍型和靶基因純合的HS細(xì)胞可來(lái)源于并選擇自(a ) 融合兩個(gè)卵母細(xì)胞或兩個(gè)精子細(xì)胞；(b)在卵子發(fā)生過(guò)程中，阻止第 二極體擠出；(c)在適當(dāng)條件下，使第二極體擠出，同時(shí)進(jìn)行自發(fā)的 基因組自我-復(fù)制；或(d)把兩個(gè)單倍體卵核或精核轉(zhuǎn)移到去核卵母 細(xì)胞中。圖3提供表示精子發(fā)生和卯子發(fā)生的圖解，顯示男性和女性 有絲分裂和減數(shù)分裂階段的差異.
本發(fā)明中使用的卵母細(xì)胞可利用本領(lǐng)域已知的，或已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的任 何適當(dāng)方法獲得。人類卵母細(xì)胞通常采集自供體的卵巢濾泡，分離自 周圍或粘著細(xì)胞。為使產(chǎn)量最大，在供體中誘導(dǎo)超數(shù)排卵.超數(shù)排卵 可通過(guò)給予適當(dāng)?shù)拇傩韵偌に鼗虼傩韵偌に仡愃莆锒T導(dǎo)，而它們可 單獨(dú)或與克羅米酚枸櫞酸鹽聯(lián)合給藥(Barriere等，Rev.Prat. , 40 (29 ) : 2689-93 ( 1990 )，其引入此處作為參考)。在小鼠中，代表性 的方法包括給予卵泡刺激激素(FSH)的孕馬血清(PMC)，和模擬促 黃體生成激素(LH)的人絨毛膜促性腺素(hCG)。見Hogan等， Manipulating the mouse embryo:A Laboratory Manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994,超數(shù)排卵的有效諸導(dǎo)取決 于幾個(gè)可變參數(shù)，包括但不限制于，女性的年齡和體重，促性腺激素 的劑量，給藥時(shí)間，和所用抹系.
排卵的超誘導(dǎo)和卵母細(xì)胞的采集是本領(lǐng)域已知的。代表性的，詳 細(xì)的小鼠方案見Hogan等，supra， pp. 130-132，其全部?jī)?nèi)容均引入此 處作為參考。例如，Hogan描述了 PMS和hCG的腹膜內(nèi)給藥，兩者都 是將凍千粉末重懸浮在無(wú)菌的0.9%NaCl中，從而誘導(dǎo)超數(shù)排卵。PMS 和hCG都應(yīng)在釋放內(nèi)源性LH前給藥。涉及采集小鼠卵母細(xì)胞的Hogan 方案通常適于沒有進(jìn)行過(guò)不當(dāng)實(shí)驗(yàn)的人。
聚乙二醇已知可誘導(dǎo)排卵的卵母細(xì)胞融合(見，例如，Sekirina， G. G. ， Ontogenez. 16 (6): 583-8( 1985 )，和Gulyas， B. J. ， Dev. Biol. 101 (1 ) : 246-50 ( 1984 )，其引入此處作為參考)?？蛇x擇地，Nogues等 在Zygote, 2 ( 1 ) : 15-28 ( 1994 )，(其引入此處作為參考)中描述了 通過(guò)滅活仙臺(tái)病毒而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞融合，導(dǎo)致"合子"或"卵母細(xì)胞
21融合產(chǎn)物(0FP廣的產(chǎn)生，其能夠經(jīng)歷胚胎發(fā)育的第一階段.卵母細(xì) 胞融合技術(shù)的綜述見Gulyas， B. J. ， Dev. Biol. ， 4: 57-80 ( 1986 )， 其引入此處作為參考。
可選擇地，阻止第二極體從卵母細(xì)胞擠出可產(chǎn)生HS細(xì)胞。激活小 鼠卵母細(xì)胞的詳細(xì)方案在Hogan等，supra， pp. 148-150中描述，其 中把采集到的，與卵丘相連的卵保存在7%乙醇的Dulbecco，s PBS溶 液中5分鐘，用培養(yǎng)基洗滌，并于37TC時(shí)溫育5小時(shí)。隨后，通過(guò)用 透明質(zhì)酸酶處理而除去卵丘.實(shí)際上，在第一次減數(shù)分裂和第一極體 分離之后，卵母細(xì)胞在中期II被抑制，而且當(dāng)受到精子的刺激時(shí)， 卵母細(xì)胞可能只能經(jīng)歷第二次減數(shù)分裂.在體外，精子的刺激可通過(guò) 使卵母細(xì)胞與試劑，如0&++離子栽體(A23187 )或乙醇接觸，從而激 發(fā)繼續(xù)進(jìn)行減數(shù)分裂II而模擬.在第二極體擠出之前，核分裂(染 色體的分離)和胞質(zhì)分裂(細(xì)胞的分裂)可被試劑抑制，所述試劑包 括，但不限制于，6-二甲氨基噪呤(6-DMAP),或細(xì)胞松弛素D，導(dǎo)致 這種二倍體卵母細(xì)胞激活，及隨后胚泡樣團(tuán)的形成。圖2描述了激活
的產(chǎn)物。
在另一實(shí)施方案中，第二極體的擠出可通過(guò)使卵母細(xì)胞單獨(dú)與Ca++ 離子載體(A23187 )接觸，或接下來(lái)與噪呤霉素接觸而實(shí)現(xiàn).二倍體 卵母細(xì)胞可進(jìn)一步經(jīng)過(guò)沒有分裂的基因組自我-復(fù)制，而且當(dāng)在適宜 條件下培養(yǎng)時(shí)，所得的二倍體卵母細(xì)胞可形成胚泡樣團(tuán)，并用于衍生 HS細(xì)胞。見，Taylor, A. S.等，Hum. Reprod. ， 9 ( 12 ): 2389-97 ( 1994 ); 和Kaufman, M. H.等，J. Embryol. Exp. Morphol. ， 73: 249-61 ( 1983 ),
本發(fā)明所用的精子細(xì)胞可利用本領(lǐng)域已知的或已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的任何適 宜方法，特別是體外受精領(lǐng)域的那些常規(guī)方法獲得.為了產(chǎn)生用于男 性的HS細(xì)胞，采集精子細(xì)胞(減數(shù)分裂II完全的)，然后誘導(dǎo)它融 合。精子細(xì)胞的融合可使用確鑿的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。例如，Asakura S 等，Exp. Cell. Res. ， 181 ( 2 ) : 566-73 ( 1989 ),其引入此處作為參 考，教導(dǎo)使用低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)精子細(xì)胞對(duì)的融合及單一頂體 (synacrosome)的最終形成。可選擇地，次級(jí)精子細(xì)胞(減數(shù)分裂I 完全的)可使用本領(lǐng)域已知的方法獲得。
純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞可使用常規(guī)技術(shù)，特別 是體外受精領(lǐng)域常用的那些技術(shù)從供體采集。見，例如，Jones等，F(xiàn)ertil. Steril. 37 (1): 26-29 ( 1982 )，描述了從人卵巢濾泡抽出卵 母細(xì)胞的技術(shù)；Lisek等，Tech. Urol. ， 3 ( 2 ) : 81-85 ( 1997 )，描 述了從附睪和睪丸采集精子的技術(shù)；Stice等，Mol. Reprod. Dev., 38 ( 1 ) : 61-8 ( 1994 )，和Takeuchi等，Hum. R印rod. ， 14 (5) :1312— 7 ( 1999 )，描述了將一個(gè)供體的核材料移植到另一個(gè)供體的去核卵母 細(xì)胞中的技術(shù)。這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均引入此處作為參考。
最后，如上所述，分離的HS細(xì)胞可通過(guò)將兩個(gè)二倍體生殖細(xì)胞核 轉(zhuǎn)移到去核卯母細(xì)胞中而產(chǎn)生。特別是，可將兩個(gè)精子或二倍體卵核 轉(zhuǎn)移到去核卯母細(xì)胞中，從而產(chǎn)生未受精的二倍體卵母細(xì)胞，其中在 卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中具有男性或女性供體的核遺傳信息，供體核材料可 使用本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)采集和/或分離。同樣，轉(zhuǎn)移步驟可使用 體外受精領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)完成(見，美國(guó)專利第5, 945, 577 ， W098/07841,和上面討論的Stice和Takeuchi,及Wobus等，Cells Tissue Organs, 166:1-5 ( 2000)，其引入此處作為參考)，
遺傳修飾可通過(guò)多核普酸轉(zhuǎn)染技術(shù)而被引入到HS細(xì)胞中，這種技 術(shù)包括但不限制于，病毒載體轉(zhuǎn)移，細(xì)菌栽體轉(zhuǎn)移，及合成載體轉(zhuǎn)移 (例如，經(jīng)由質(zhì)粒，脂質(zhì)體和膠態(tài)復(fù)合體).
從受精胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離ES細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的.這種 方法也適于從胚泡樣團(tuán)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離HS細(xì)胞.例如，見Gardner 等，Curr. Op. Obst.Gyn. ， 11: 307—311 ( 1999 )，美國(guó)專利第5, 843, 780 (Thomson等)和美國(guó)專利第5, 905, 042 (Stice等)，其內(nèi)容引入此 處作為參考。
HS細(xì)胞可從任何動(dòng)物供體材料產(chǎn)生，并用于任何動(dòng)物系統(tǒng)中.本 發(fā)明預(yù)期了人和非-人的HS細(xì)胞。適當(dāng)?shù)?獸醫(yī)應(yīng)用包括從哺乳動(dòng)物， 魚類，爬行動(dòng)物，鳥，和兩棲動(dòng)物產(chǎn)生HS細(xì)胞，并將HS細(xì)胞用于它 們之中。
C.選擇免疫型的方法 通過(guò)上述方法產(chǎn)生的，所采集純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生 殖細(xì)胞可用于獲得HS細(xì)胞，并最終獲得HS-衍生的祖細(xì)胞，和其它分 化細(xì)胞。本發(fā)明包括進(jìn)一步相對(duì)于靶基因的免疫型和基因型選擇HS 細(xì)胞，這樣它們就可用于治療疾病，例如在需要這種治療時(shí)，移植到受影響的個(gè)體中。
純合的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞最初可從受影響的個(gè)體 得到，這種情況下不需要匹配免疫型.在從與受體有親緣關(guān)系或沒有 親緣關(guān)系的供體中采集這種生殖細(xì)胞的情況下，需要相對(duì)于免疫型進(jìn) 行選擇。此外，本發(fā)明的目的是建立干細(xì)胞庫(kù)，其中所述干細(xì)胞先前 已經(jīng)在免疫組織學(xué)上被分型。在某些情況下，優(yōu)選自身供體.然而， 在受影響的個(gè)體患有遺傳病(即，特征在于缺乏重要基因的疾病，或 由于突變或不適當(dāng)表達(dá)導(dǎo)致的疾病)的情況下，優(yōu)選使用非自身供體. 可選擇地，本發(fā)明另一個(gè)目的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行選擇時(shí)，可 選擇那些自身的生殖細(xì)胞，其顯示出所需的基因型(例如，缺少缺陷
基因或突變基因的細(xì)胞)，還可選擇能夠表達(dá)缺陷基因的那些細(xì)胞，
這種選擇技術(shù)還可用于防止把免疫-不相容的基因型或表型用于組織移植。
本發(fā)明還考慮了生產(chǎn)適于移植的純合細(xì)胞群的方法，該方法需要 測(cè)定受體的免疫型('組織分型，)，然后選擇免疫相容性干細(xì)胞群。 目前所用的組織分型技術(shù)兩種，即血清學(xué)(淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn))，
和分子(基于DNA)技術(shù).這些可用于選擇干細(xì)胞群，它們?cè)谙旅婷?述。
1.血清學(xué)技術(shù)
為進(jìn)行本發(fā)明中受體的血清學(xué)分型，需要從受體采集兩種約20ml 的抗凝血樣品，用于完全的I類和II類組織分型。對(duì)于I類分型而 言，將其中一份血液樣品用枸櫞酸鈉處理，然后去纖維蛋白，以便除 去可能導(dǎo)致假陰性反應(yīng)的血小板.然后將樣品鋪在密度梯度培養(yǎng)基 上，離心，從而分離淋巴細(xì)胞中的紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞.將紅細(xì)胞 和多形核白細(xì)胞沉淀物，及淋巴細(xì)胞帶轉(zhuǎn)移到另 一個(gè)試管中并洗滌。 然后計(jì)算淋巴細(xì)胞數(shù)并將其調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞數(shù)，如1.5-2.0百萬(wàn) 個(gè)細(xì)胞/血l，用于進(jìn)行淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)。在試驗(yàn)平板的孔中培養(yǎng)計(jì) 數(shù)細(xì)胞和分型血清，HLA抗-血清則與淋巴細(xì)胞表面上的特異性細(xì)胞膜 靶抗原結(jié)合。I類等位基因的血清學(xué)特異性見圖4A,然后加入兔血清 或補(bǔ)體溶解細(xì)胞。只有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成抗體-^原復(fù)合體，
然后激活導(dǎo)致細(xì)胞溶解的補(bǔ)體時(shí)，細(xì)胞才會(huì)溶解.溶解的細(xì)胞可通過(guò) 指示陽(yáng)性反應(yīng)的死細(xì)胞染色來(lái)檢測(cè)。如果沒有發(fā)生溶解，則細(xì)胞不染色，指示陰性反應(yīng)。
對(duì)于II類分型而言，用EDTA處理第二份樣品.然后用免疫磁性 珠(用單克隆抗體包被的超順磁性單分散聚合物顆粒)培養(yǎng)樣品，并 將其放在磁場(chǎng)中.因?yàn)镮I類抗原是在B細(xì)胞上表達(dá)的，因此用單克 隆抗體包被的免疫磁性珠對(duì)B細(xì)胞特異.B細(xì)胞和珠子被磁場(chǎng)捕獲， 洗滌它們，并利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)計(jì)數(shù).然后將60^1標(biāo)準(zhǔn)體積用于進(jìn)行上 述的淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn).II類等位基因的血清學(xué)特異性見圖4B。淋 巴細(xì)胞毒性承J定法由Hui等，Handbook of肌A Typing Techniques, p. 194 ( 1993 )描述。
淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)也可用于干細(xì)胞分型.將一組免疫學(xué)上詳細(xì)-描 述的抗-血清加入到有或沒有親緣關(guān)系供體的干細(xì)胞樣品中，培養(yǎng)。 然后將兔血清，即補(bǔ)體的來(lái)源，加入到混合物中，如果抗-血清與干 細(xì)胞表面上的HLA抗原結(jié)合，則其被激活。激活后，補(bǔ)體溶解細(xì)胞， 使它們吸收標(biāo)準(zhǔn)染料，從而被檢測(cè)。
因?yàn)檫€不清楚HS細(xì)胞是否已經(jīng)攜帶適當(dāng)?shù)腍LA分子，因此在生長(zhǎng) 的早期，應(yīng)利用分子試驗(yàn)(見下面的部分2).
在可選擇的實(shí)施方案中，混合白細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)(MLC)還可用于受 體和II類干細(xì)胞分子'該試驗(yàn)，在Bach等，(1964 )，淋巴細(xì)胞的相 互作用 一種可能的體外組織相容性試驗(yàn)，Science 143:813-814，測(cè) 量了可能受體的T細(xì)胞對(duì)存在于可能供體細(xì)胞上的同種抗原的反應(yīng)， 這篇文章引入此處作為參考.
2.分子技術(shù)
這些技術(shù)需要受體血液樣品的基因組DM或干細(xì)胞.首先利用本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過(guò)程擴(kuò)增基因組DNA。然后 利用兩種技術(shù)將PCR擴(kuò)增的血液DM分型，即用限制酶消化(限制性 片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析)，或與多種序列特異性寡核苷酸探針(SSOP) 雜交。優(yōu)選RELP分析，這是因?yàn)樗且环N可靠而且更方便的方法， 無(wú)需放射性標(biāo)記.它在某些等位基因中摻入可識(shí)別特異性位點(diǎn)的酶， 因此特異性HLA-單倍型可通過(guò)簡(jiǎn)單檢查酶是否消化擴(kuò)增DMs來(lái)檢測(cè). 閨5列出了可用于II類分型的限制性內(nèi)切核酸酶。詳細(xì)方法可從Hui 等，Handbook, 9獲得。
SSOP分析需要將擴(kuò)增DM固定在尼龍薄膜上，然后與所選擇的，
25針對(duì)特異性HLA-等位基因的放射性寡核苷酸探針雜交。圖6是可用于 II類分型的SS0Ps列表.還可利用這種技術(shù)的改進(jìn)，即序列特異性引 物分型(SSP)。此處，分型系統(tǒng)的特異性是PCR反應(yīng)的一部分。寡核 苷酸引物可用于擴(kuò)增特異性HLA-等位基因，因此完全匹配的引物可更 有效地用于PCR反應(yīng)中，然后可利用瓊脂糖凝膠電泳和透照法檢測(cè)。
其它PCR方法，如通過(guò)PCR指紋法進(jìn)行II類匹配，Hui等，Handbook, 99，HLA多態(tài)微衛(wèi)星基因座的PCR特性描述，Martin等，Immunogenetics 47: 131-138， ( 1998 )，也是本發(fā)明預(yù)期的。
HLA多態(tài)微衛(wèi)星基因座的表征是一種優(yōu)選技術(shù)，它可預(yù)測(cè)受體和供 體的單倍型，而且當(dāng)供體和受體有親緣關(guān)系時(shí)特別有效.如Martin 等，supra所述，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)散布有大量微衛(wèi)星重復(fù)。這些 微衛(wèi)星是高度多態(tài)的，而且以孟德爾方式遺傳，因此它們可用作遺傳 標(biāo)記。Martin等對(duì)HLA內(nèi)或附近的12個(gè)微衛(wèi)星進(jìn)行了分型和測(cè)序。 用于對(duì)微衛(wèi)星進(jìn)行測(cè)序的PCR引物見圖7。此外，根據(jù)大小給等位基 因命名。這些微衛(wèi)星與某些HLA等位基因之間的連鎖不平衡表明這些 微衛(wèi)星可預(yù)測(cè)HLA分型，并可被用作標(biāo)記。圖8表示HLA-I， II和III 區(qū)及12個(gè)微衛(wèi)星相對(duì)位置的圖。
D.選擇基因型的方法
在某些情況下，必需在靶基因型存在的情況下進(jìn)行選擇。如上所 述，本發(fā)明的"靶"基因型是指非-突變或"正常"形式的基因型， 即，基因序列與病理學(xué)無(wú)關(guān)。因此，在生殖細(xì)胞供體受到影響或生殖 細(xì)胞供體是遺傳病載體的那些情況下，必需測(cè)定每個(gè)HS細(xì)胞系統(tǒng)的 基因型，其中HS細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)源于每個(gè)供體純合的，減數(shù)分裂I后的 二倍體生殖細(xì)胞，并只選擇攜帶所需靶基因型的那些群。攜帶突變基 因型的那些群應(yīng)當(dāng)從進(jìn)一步的研究中被排除.每個(gè)供體的生殖細(xì)胞都 是二倍體，并對(duì)于特定單倍型是純合的。因此，來(lái)源于它們的細(xì)胞的 每個(gè)群(即，有絲分裂激活減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞系統(tǒng)和干 質(zhì)系統(tǒng))均勻攜帶一個(gè)單倍型或另一個(gè)單倍型，而不是攜帶兩個(gè)單倍 型。
確定細(xì)胞群的基因組成或"基因型"的技術(shù)有很多。絕大多數(shù)都 是從提取衍生cDNA的基因材料樣品(例如，基因組DNA或mRNA)開始的，cDNA也可來(lái)源于典型細(xì)胞。所述樣品通常利用PCR技術(shù)擴(kuò)增， 并被克隆，從而衍生部分或完全的基因"文庫(kù)"。然后篩選該文庫(kù)中 正?；蛲蛔冃蛄械拇嬖?如上所述，選擇含有正常序列的那些群做進(jìn) 一步的研究；排除含有突變序列的那些(即，與病理學(xué)相關(guān))?；?突變可通過(guò)很多方法選擇，這些技術(shù)包括，但不限制于，凝膠測(cè)序， 非-凝膠測(cè)序，和基因標(biāo)記。所得序列可被自動(dòng)掃描突變或靶(即， 正常)序列的存在.
1. 凝膠測(cè)序
最普遍的核酸測(cè)序方法包括分離基因組DNA或cDNA中的DNA片段， 其中DNA或cDNA是通過(guò)特異性裂解切割的，或通過(guò)DNA聚合酶合成 的，其中使用了凝膠，如聚丙烯酰胺凝膠。凝膠測(cè)序技術(shù)的例子包括， 但不限制于，Maxam-Gilbert測(cè)序(也稱為化學(xué)降解方法)和Sanger 測(cè)序(也稱為鏈終止或雙脫氧方法)。
Maxam-Gilbert效4序(Maxam等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564， 1977，引入此處作為參考)使用化學(xué)制劑裂解特異性堿 基上的DNA，得到不同長(zhǎng)度的片段.被稱為多重測(cè)序的改進(jìn)的Maxam-Gilbert 方法可使研究人員在單一 DNA測(cè)序凝膠上分析大約40個(gè)克 隆。
Sanger測(cè)序(Sanger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467， 1977,引入此處作為參考)包括利用酶促過(guò)程在四個(gè)不同的反 應(yīng)中合成各種長(zhǎng)度的DNA鏈，在被四個(gè)堿基中的一個(gè)占據(jù)的位置上終 止DNA復(fù)制，然后測(cè)定所得片段的長(zhǎng)度.
Maxam-Gilbert和Sanger以不同方式生產(chǎn)了重疊DM片段.兩種 方法均可進(jìn)行，這是因?yàn)槟z電泳可高-分辨分離DNA分子；甚至能 夠分離只相差一個(gè)核苷酸的片段.現(xiàn)在，這些測(cè)序方法中幾乎所有的 步驟都是自動(dòng)化的.某些已知疾病的基因可用高壓毛細(xì)管和超薄電泳 測(cè)序，從而增加片段的分離速度，并利用共振離子化光譜檢測(cè)穩(wěn)定的 同位素標(biāo)記。
2. 非凝膠測(cè)序
也可使用非凝膠測(cè)序技術(shù)，其目的在于提高效率。這些技術(shù)包括 但不限制于(a)提高流式細(xì)胞術(shù)中各個(gè)標(biāo)記的堿基的熒光檢測(cè)；(b) 利用掃描隧道或原子力學(xué)顯微鏡直接閱讀DNA鏈上的堿基序列；(c)提高DM序列的質(zhì)譜分析；(d)通過(guò)與已知序列的一小段核苷酸雜交 而測(cè)序。
雜交測(cè)序(SBH)可在較短時(shí)間內(nèi)有效鑒定并對(duì)一個(gè)或多個(gè)DNA樣 品進(jìn)行測(cè)序。該過(guò)程在DNA診斷，辨論，和基因圖譜中具有多種應(yīng)用。 它還可用于鑒定造成遺傳病和其它性狀的突變，從而評(píng)估生物多樣 性，并根據(jù)MA序列產(chǎn)生許多其它類型的數(shù)據(jù).
還有許多通過(guò)雜交測(cè)序的方法(SBH).在SBH Format 1中，排列 DNA樣品，并使標(biāo)記探針與樣品雜交。具有同組樣品DNA的復(fù)制膜可 用于多個(gè)探針的平行評(píng)估，和/或探針可以是多樣的.排列及在尼龍 膜上雜交DNA樣品的技術(shù)已經(jīng)取得很大發(fā)展。每種排列都可重復(fù)使用 很多次。Format 1對(duì)于成批處理大量樣品特別有效。
在SBH Format 2中，排列探針，并使標(biāo)記過(guò)的DNA樣品片段與排 列的探針雜交。在這種情況下， 一個(gè)片段的完全序列可根據(jù)同時(shí)進(jìn)行 的，與排列探針的雜交反應(yīng)確定.為了對(duì)其它DNA片段進(jìn)行測(cè)序，可 重復(fù)使用相同的寡核苷酸排列.在Format 2的變體中，排列DNA錨， 并進(jìn)行連接，從而確定存在于靶DNA末端的寡核苷酸序列。
在Format 3中，使用了兩組探針。其中一組可以是序列形式，另 一個(gè)標(biāo)記組則儲(chǔ)存在多孔平板中。在這種情況下，無(wú)需標(biāo)記耙DM, 將靶DM和其中一個(gè)標(biāo)記過(guò)的探針加入到探針的排列組.如果一個(gè)并 聯(lián)探針和一個(gè)標(biāo)記探針都在靶DNA上相連雜交，那么它們共價(jià)連接， 產(chǎn)生是所評(píng)估兩倍長(zhǎng)的序列。該方法可對(duì)較長(zhǎng)的DNA片段進(jìn)行測(cè)序， 例如，完全的細(xì)菌基因組，在較小的片段中沒有DNA亞克隆.
對(duì)SBH的其它詳細(xì)描述見美國(guó)專利第5, 503, 980， 5, 683, 881，和 6, 025, 136，它們引入此處作為參考.還見Bainst， W.等，J. Theoret. Biol. ， 135: 303-307， 1988; Matthews, J. A.等，Anal. Biochem.， 169， 1-25， 1988; Syvanen， A. C. ， Medical Biology, 64， 313-324 1986; 和Lehrach， H.等，Genome Analysis, 1， 39-71， 1990，它們?nèi)恳?入此處作為參考。
3.遺傳標(biāo)記
遺傳標(biāo)記，即，與特定基因序列存在有關(guān)的短序列，可用于檢測(cè) 突變或正?；虻拇嬖?。本發(fā)明所用遺傳標(biāo)記的例子包括，但不限制 于，序列標(biāo)記位點(diǎn)(STSs),用作物理作圖中的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記的短序列，和已表達(dá)序列標(biāo)記(ESTs)，用于鑒定已表達(dá)基因的獨(dú)特標(biāo)記。這些 標(biāo)記提供了一種快速鑒定絕大多數(shù)人類基因的方法.EST方法的其它 應(yīng)用包括沿著染色體確定基因的位置，鑒定基因組序列中的編碼區(qū)。 當(dāng)遺傳標(biāo)記是高度可遺傳的，多等位基因的，而且數(shù)目眾多時(shí)， 它們具有最大的功用。絕大多數(shù)標(biāo)記都是高度可遺傳的，這是因?yàn)樗?們的等位基因是通過(guò)DNA的核苷酸序列測(cè)定的，其從一代到另一代保 存得非常好，而且它們等位基因的檢測(cè)不受自然環(huán)境的影響。標(biāo)記有 多個(gè)等位基因，這是因?yàn)樵谶M(jìn)化過(guò)程中，在定義標(biāo)記基因座的DM序 列中產(chǎn)生罕有的遺傳-穩(wěn)定突變，并與其它現(xiàn)存基因一起在各代中傳 播。高度保守的DM特性與很少出現(xiàn)的穩(wěn)定突變結(jié)合，使得遺傳標(biāo)記 是可預(yù)測(cè)的，而且可以辨別不同的基因型.
DM指紋法是一個(gè)寬泛的術(shù)語(yǔ)，用于命名評(píng)估DNA序列差異的方 法，其中DNA是從各種來(lái)源分離出來(lái)的，而評(píng)估DM序列差異的方法 是通過(guò)比較分離DM樣品中標(biāo)記DNA的存在進(jìn)行的。通常，DNA指故 法用于分析和比較來(lái)源于不同物種生物體的DNA或來(lái)源于相同物種不 同個(gè)體的DNA.通過(guò)指紋法檢測(cè)的DNA序列差異被稱作DNA多態(tài)性。 生物體DM中DNA多態(tài)性的存在表明這種生物體的遺傳來(lái)源與DNA不 具有多態(tài)性的生物體的遺傳來(lái)源不同.這種多態(tài)性可由基因組中的插 入，缺失，和/或突變事件產(chǎn)生，
有很多遺傳-標(biāo)記技術(shù)都適于指紋法，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RELP) (Bostein等，Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331 ， 1980 );單 鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) (Fischer等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1579-1583， 1983; 0rita等，Genomics 5: 874-879， 1989 );擴(kuò)增 片段-長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP) (Vos等，Nucleic Acids Res. 23: 4407-4414， 1995 );微衛(wèi)星或單一序列重復(fù)(SSR) (Weber, J. L.等，Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396， 1989 );快速-擴(kuò)增多肽DNA ( RAPD ) ( Williams 等，Nucleic Acids Res. 18: 6531—6535， 1990 );序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS) (Olson等，Science 245: 1434-1435， 1989 );基因逐位-分析(GBA) (Nikiforov等，Nucleic Acids Res. 22:4167-4175， 1994 );等位 基因-特異性聚合酶鏈反應(yīng)(ASPCR ) ( Gibbs等，Nucleid Acids Res. 17: 2437-2448， 1989; Newton等，Nucleic Acids Res. 17: 2503-2516， 1989 );切口-翻譯PCR(例如，TaqMan.TM. ) ( Lee等，Nucleic AcidsRes. 21: 3761-3766， 1993 );和等位基因-特異性雜交(ASH ) (Wallace 等，Nucleic Acids Res. 6: 3543-3557， 1979; Sheldon等，Clin. Chem. 39 (4) :718-719， 1993 )。上述每一篇文章均引入此處作為參考.
進(jìn)行RAPD和AFLP分析的試劑盒可從市場(chǎng)上購(gòu)買，例如，從Perkin Elmer Applied Biosystems (Foster City, Calif.)購(gòu)買。例如，限 制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)技術(shù)采用DNA的限制性酶消化，接著是 通過(guò)凝膠電泳按大小分離消化DNA，并使按大小分離的DNA與特異性 的多核苷酸片段雜交.與多核苷酸探針結(jié)合的限制片段大小的差異可 反映DNA樣品的序列差異，或DNA的多態(tài)性。見Tanksley， Biotechnology 7: 257-264 ( 1988 )，引入此處作為參考.
基于PCR的指紋法導(dǎo)致大量可被分離的，通常是利用凝膠電泳分 離的，特定大小的可再生DNA片段的產(chǎn)生。這些片段顯示可產(chǎn)生擴(kuò)增 DM的"指紋"。按大小分離的片段的顯示可通過(guò)直接顯示，例如使用 熒光染料，或通過(guò)與多核苷酸探針雜交，或通過(guò)在PCR過(guò)程中(放射 性或熒光)標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，然后檢測(cè)凝膠中的標(biāo)記產(chǎn)物而實(shí)現(xiàn).這些 指紋具有多種用途血統(tǒng)分析；特定性狀的連鎖分析；物種個(gè)體之間 種屬關(guān)系程度的分析；和物種之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析。它還具有重 要的商業(yè)用途，如農(nóng)業(yè)中的標(biāo)記，幫助選擇對(duì)特定基因型特異的遺傳 性狀(例如在農(nóng)作物或動(dòng)物中)，鑒定并繪制定量性狀基因座(QTLs)等。
對(duì)遺傳標(biāo)記和不進(jìn)行測(cè)序而檢測(cè)基因的技術(shù)的其它詳細(xì)描述見美 國(guó)專利第6, 141, 657， 5, 683, 880和6, 100, 030，它們?nèi)恳氪颂幾?br> 為參考.
E.定向分化HS細(xì)胞的方法
HS細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化成各種類型的，來(lái)源于全部三個(gè)胚層(內(nèi)胚 層，中胚層，和外胚層)的組織，包括但不限制于，皮膚，毛發(fā)，神 經(jīng)組織，胰島細(xì)胞，骨，骨髄，垂體，肝臟，膀胱，及其它組織，它 們?cè)趧?dòng)物，包括人類中具有診斷或治療效用，如美國(guó)專利申請(qǐng)第 09/997, 240和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列笫60/253, 943所述，它們?nèi)恳?此處作為參考。
分化技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，特別是研究ES細(xì)胞和胚胎癌(畸胎癌)細(xì)胞分化的那些技術(shù)人員，可誘導(dǎo)多能HS細(xì)胞分化成所需類型且沒 有進(jìn)行過(guò)不適當(dāng)實(shí)驗(yàn)的組織類型。
本發(fā)明的多能分離HS細(xì)胞可被分化成為各種治療用途而選擇的組 織，包括用于研究，診斷目的，或移植到個(gè)體中的分化組織體外培養(yǎng) 物。優(yōu)選，如果供體物質(zhì)用于形成HS，則HS細(xì)胞可治療性地用于個(gè) 體中。在女性中，這可通過(guò)激活減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細(xì)胞，或 通過(guò)融合兩個(gè)單倍體卵母細(xì)胞而獲得；在男性中，這可通過(guò)激活次級(jí) 精母細(xì)胞或融合精子細(xì)胞，或通過(guò)將精核轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞中而獲 得。
分離和培養(yǎng)ES細(xì)胞的已知方法也適于HS細(xì)胞.代表性過(guò)程由Hogan 等在supra, pp. 254-262， 265-272中提供。例如，Hogan等，描述了 最適培養(yǎng)基，7.2-7.4pH緩沖的碳酸氫鹽培養(yǎng)基，如Dulbecco，s修飾 的Eagle，s培養(yǎng)基，它含有葡萄糖和丙酮酸鈉，進(jìn)一步用谷氨酰胺 (2mM)，非必需氨基酸(0. lmM)，巰基乙醇(0. lmM)或一硫代甘油 (0.15mM)，慶大霉素(50pg/ml)， 15%血清(例如，胎牛血清)，和 白血病抑制因子(LIF)補(bǔ)充.胰蛋白酶和EDTA在沒有Ca+7Mg"的磷 酸鹽緩沖生理鹽水中的混合物可用于分離組織培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，并把 它們彼此分開.干細(xì)胞優(yōu)選在補(bǔ)充有LIF的培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)， 從而提供可提高增殖并保持干細(xì)胞未分化狀態(tài)的因子.成纖維細(xì)胞， 特別是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和STO小鼠成纖維細(xì)胞是優(yōu)選的 飼養(yǎng)細(xì)胞。銅養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是有絲分裂滅活的，例如通過(guò)用絲裂霉素C， 或Y射線處理.也可使用其它類型的飼養(yǎng)細(xì)胞或沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的系 統(tǒng).制備和保存活干細(xì)胞培養(yǎng)物的每個(gè)步驟的詳細(xì)方案由Hogan等， supra中提供，
同樣，分離ES細(xì)胞的獨(dú)立群體和擴(kuò)充它們的數(shù)量至足以分離和篩 選DNA的方法也可用于HS細(xì)胞。例如，Hogan等，supra, pp. 279-281， 描述了干細(xì)胞分離技術(shù)，包括提取并使用自動(dòng)移液器將胰蛋白酶消 化的群體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿的單孔中，提取并使用與管和口相連的無(wú)菌玻 璃巴斯德移液管將沒有被胰蛋白酶消化的群體轉(zhuǎn)移到胰蛋白酶/BDTA 的微滴中。優(yōu)選克隆可使用快速技術(shù)和FCR鑒定和測(cè)定.
為使累積染色體異常的危險(xiǎn)最小，應(yīng)盡可能將盛有原液的小瓶冷 凍貯藏。對(duì)ES細(xì)胞而言，適當(dāng)冷凍和貯藏培養(yǎng)物的方法是已知的，而且也可用于HS細(xì)胞，見，例如，Hogan等，s卯ra， pp. 283，其中 描述了從細(xì)胞培養(yǎng)物冷凍，胰蛋白酶消化，使成顆粒狀物和重懸浮樣 品的方案。分化多能細(xì)胞的方法在下面討論。這些方法只是為了舉例 說(shuō)明，而不是窮舉分化多能細(xì)胞，包括本發(fā)明HS細(xì)胞的方法.本發(fā) 明可利用本領(lǐng)域已知的分化方法進(jìn)行，包括這里沒有列舉的，或是還
沒有發(fā)現(xiàn)的方法。
例如，Hole (Cells Tissues Organs 165: 181-189， 1999，引入此 處作為參考)描述了體外定向分化來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的造血細(xì)胞的方 法，該方法也適于分化HS細(xì)胞，此夕卜，Doetschman等，Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45， 1985，其引入此處作為參考，提出從生長(zhǎng)于懸浮 培養(yǎng)基中的ES細(xì)胞提取白血病抑制因子(LIF)可導(dǎo)致含有血島的囊 性胚狀體的形成，其中血烏由紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成.其它造血細(xì)胞， 包括嗜中性白細(xì)胞，肥大細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，和紅細(xì)胞樣細(xì)胞自干細(xì)胞 的產(chǎn)生也已經(jīng)被描述過(guò)(見，例如，Wiles和Keller, Devel. 111: 259-267， 1991; Keller等，Mol. Cell. Biol. 13: 473-486， 1993a; 和Lieschke和Dunn， Exp. Hematol. 23: 328-334， 1995;每篇文獻(xiàn) 均整體引入此處作為參考)。這些方法也適于本發(fā)明沒有進(jìn)行過(guò)不適 當(dāng)實(shí)驗(yàn)的HS細(xì)胞。
引入此處作為參考的，由Cho等在Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9797-9802， 1999中描述的技術(shù)可將ES細(xì)胞有效分化為成熟的Ig-分泌B'淋巴細(xì)胞，這種技術(shù)也適于本發(fā)明的HS細(xì)胞。同樣，Dani， Cells Tissue Organs 165: 173-180， 1999，引入此處作為參考，描述了一種 將ES細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的方法.例如，在分化早期，用視黃酸UA) 處理胚狀體一 小段時(shí)間似乎與脂肪形成有關(guān).
誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成各種神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)元的技術(shù)由Okabe等在 Mech. Dev. 59: 89-102， 1996中描述，這篇文獻(xiàn)引入此處作為參考。 同樣，干細(xì)胞-衍生的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元在治療受損脊髄中 有特定用途是由McDonald等在Nature Medicine 5:1410-1412， 1999 中描述，其引入此處作為參考。這些技術(shù)也適于本發(fā)明沒有進(jìn)行過(guò)不 適當(dāng)實(shí)驗(yàn)的HS細(xì)胞。
還預(yù)期了輔助細(xì)胞系，如0P9衍生特定細(xì)胞系的用途。見，例如， Nakano等，Science 265: 1098-1101， 1994 (引入此處作為參考)和
32Nakayama等，Blood 91: 2283-2295， 1998 (引入此處作為參考)，涉 及紅細(xì)胞樣細(xì)胞，骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞系.
還預(yù)期了誘導(dǎo)本發(fā)明的HS細(xì)胞分化成濾泡細(xì)胞和表皮細(xì)胞的技 術(shù)。見，例如，Taylor等，Cell 102: 451-361， 2000 (引入此處作為 參考)。特定調(diào)節(jié)基因的表達(dá)還可用于定向分化。見，例如，Hole等， Blood 90:1266-1276 1996a，和Battieres Clin. Hematol. 3: 467-483， 1997 (引入此處作為參考)，涉及造血基因.同樣，涉及脂類代謝的 核調(diào)節(jié)因子，包括但不限制于PPARs (PPAR5和PPARy )及C/EBP 5 (C/EBPP， C/EBP 5和C/EBP a )，可能是終止前脂肪細(xì)胞分化成脂肪 細(xì)胞的引發(fā)劑.這種因子可用于本發(fā)明的分化方法.
根據(jù)所需功能的不同，分化可通過(guò)檢測(cè)對(duì)分化特異的基因的表達(dá)， 通過(guò)檢測(cè)組織-特異性抗原，通過(guò)檢驗(yàn)細(xì)胞或組織形態(tài)學(xué)，通過(guò)檢測(cè) 功能表達(dá)，如離子通道功能；或通過(guò)適于檢測(cè)HS細(xì)胞分化的任何方 法評(píng)估。
誘導(dǎo)胚胎癌(EC)細(xì)胞分化成各種胚胎和胚胎外細(xì)胞類型的方法 可用于誘導(dǎo)HS細(xì)胞的分化(Andrews, APMIS 106: 158-168 1998 ). HS 細(xì)胞通過(guò)與各種因子接觸而經(jīng)歷體外定向分化，其中所述因子已知可 激發(fā)細(xì)胞定型并分化成所需的細(xì)胞類型或組織.很多體外分化方案都 包括除去已知有助于引發(fā)分化的生長(zhǎng)因子. 一旦除去培養(yǎng)基中的這些 因子，則生長(zhǎng)于沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的懸浮液中的干細(xì)胞就可形成聚簇，即 胚狀體，在其中可找到全部三個(gè)胚層的后代.胚狀體內(nèi)某些細(xì)胞系的 存在可通過(guò)向培養(yǎng)基中補(bǔ)充其它生長(zhǎng)因子和化學(xué)制品而提高.然后， 所得的細(xì)胞群就會(huì)含有比例增加的所需細(xì)胞類型，然后選擇性地分離 它們。見Edwards等，Modern Trend., 74(1):1-7， 2000 (引入此處 作為參考)，其中討論了多能干細(xì)胞及其在藥物中的用途。
這種分化控制因子的例子包括但不限制于，細(xì)胞因子，激素，和 細(xì)胞-調(diào)節(jié)因子如LIF， GM-CSF， SCF， IL-3,甲狀腺激素(T3 )，干細(xì) 胞因子(SCF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2)，血小板衍生生長(zhǎng)因子 (PDGF)，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子.而刺激細(xì)胞因子如GM-CSF， SCF，和IL-3 可促進(jìn)分化(見Keil F等，Ann. Hematol. 79 ( 5 ) : 243-8， 2000 (引 入此處作為參考))，刺激抑制因子如LIF可維持小鼠胚胎干(ES)細(xì) 胞的未分化多能狀態(tài)(Zandstra PW等，Blood 96 (4): 1215-22， 2000，引入此處作為參考).而SCF可刺激雞破骨細(xì)胞自它們推定祖代的分 化(van，t Hof RJ等，F(xiàn)ASEB J. 1997 Mar; 11 (4): 287-93， 1997，引 入此處作為參考)，F(xiàn)GF-2在引發(fā)lactotrope分化和維持促乳素在無(wú) 限增殖化GHFT細(xì)胞中表達(dá)的方面起著重要的作用，由此暗示了干細(xì) 胞控制分化成不同垂體前葉細(xì)胞的機(jī)理(Lopez-Fernandez J等， J. Biol. Chem. 275 (28) :21653-60， 2000，引入此處作為參考).血小板 -衍生生長(zhǎng)因子(PDGF-AA， -AB，和-BB)可支持神經(jīng)元分化，而睫狀 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和甲狀腺激素T3可產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞的克隆Uohe KK等，Genes Dev. 10(24): 3129-40， 1996，引入 此處作為參考)。
HS細(xì)胞還可通過(guò)體內(nèi)，優(yōu)選原位移植而誘導(dǎo)分化，其中細(xì)胞經(jīng)歷 組織學(xué)和功能分化，并與宿主細(xì)胞形成適當(dāng)?shù)倪B接。位于移植部位的 內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子可使干細(xì)胞定向分化成特定類型的分化細(xì)胞或組織. 可選擇地，趨異分化細(xì)胞和/或組織群來(lái)源于移植到皮下組織，腹膜 和腎嚢的干細(xì)胞。見Hogan， supra， pp. 183-184，其中詳細(xì)描述了腎 嚢的移植過(guò)程.
多能HS細(xì)胞到各種內(nèi)胚層細(xì)胞類型的分化具有很大的治療意義， 包括用于移植目的，或提高HS細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的攝取和加工，或用于 指導(dǎo)模式的形成，通過(guò)用高劑量RA或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p超家族成員， 包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP) -2處理，可誘導(dǎo)HS細(xì)胞分化成內(nèi)胚層祖 細(xì)胞(Pera和Herzfeld, Reprod. Fert. Dev. 80: 551-555 1998 ), 某些HS細(xì)胞系還可在不同的培養(yǎng)系統(tǒng)中被誘導(dǎo)分化.例如，非-神經(jīng) 分化可通過(guò)六亞甲基二乙酰胺(HMBA )誘導(dǎo)(Andrews, APMIS 106: 158-168 1998 )。 BMP-2可用于特異性地激發(fā)分化成體壁或內(nèi)臟的 內(nèi)胚層(Rogers等，Mol. Bio. Cell. 3: 189-196 1992 )。 BMPs是可 以誘導(dǎo)體內(nèi)軟骨和骨生長(zhǎng)的分子，但BMP信息也可在許多非-骨組織 中表達(dá)，包括會(huì)發(fā)育成心臟，毛囊和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織，這表明它 在細(xì)胞定型和分化中起著重要的作用.
F.預(yù)防和治療功用
本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施方案是一種利用移植到受影響人中的生長(zhǎng)細(xì) 胞和組織治療疾病的方法，所述疾病包括但不限制于遺傳病，神經(jīng)病學(xué)或神經(jīng)變性疾病，創(chuàng)傷性損傷及癌癥。本發(fā)明另外一個(gè)整容應(yīng)用是 用于替換毛發(fā)的植皮和/或其它這種應(yīng)用.
HS細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化成來(lái)源于全部三個(gè)胚層(內(nèi)胚層，中胚層和 外胚層)的各類型組織，包括但不限制于皮膚，毛發(fā)，神經(jīng)組織，胰 島細(xì)胞，骨，骨髓，垂體，肝臟，膀胱和其它組織，它們?cè)趧?dòng)物，包 括人中具有診斷或治療效用，如美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240和 美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943所述。
本發(fā)明提供一種通過(guò)從具有預(yù)先選擇的免疫型和/或基因型的分離 HS細(xì)胞原位或體外產(chǎn)生適宜的替代細(xì)胞，細(xì)胞群，組織或器官，從而 治療紊亂或疾病狀況的方法。原位或體外定向分化細(xì)胞的方法在前面 部分，和美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第 60/253, 943中描述。
代表性的紊亂和疾病狀況包括但不限制于，創(chuàng)傷性損傷(例如， 創(chuàng)傷后的修復(fù)和再造，肢體替換，脊髄損傷，燒傷等)和先天性缺陷； 細(xì)胞，組織，和器官的病理學(xué)和惡性病變(例如，癌癥)；和肌肉(例 如，嚢性纖維化，肌營(yíng)養(yǎng)不良，心臟病)，神經(jīng)(例如，阿爾茨海默 氏病，帕金森氏病和腦脊髄多發(fā)性硬化)，上皮(例如，失明和肌病， 動(dòng)脈粥樣硬化和其它狹窄性血管疾病，酶缺乏，如克隆氏病，和激素 缺乏，如糖尿病)，及結(jié)締組織(例如，免疫疾病和貧血)的細(xì)胞和 組織的變性及先天性疾病.需要時(shí)，可將HS-衍生的細(xì)胞和組織移植 到被試者中，優(yōu)選使用被試者自身的供體物質(zhì)。
目前，治療遺傳病的基因療法還沒有取得很大的成功。這有很多 原因，最重要的是無(wú)法將正常DNA放在患者的細(xì)胞中，從而使其穩(wěn)定 整合并表達(dá)。此外，基因替代療法可能目的性太強(qiáng)，例如，基因-校 正的T-細(xì)胞療法，其中將具有正常DM的T-細(xì)胞移植到患者中，用 來(lái)治療重度聯(lián)合免疫缺陷疾病(SCID)，包括ADA缺陷型.這里面臨 的問題是校正T-細(xì)胞只能相對(duì)于一種類型的抗原而被引發(fā)，而且不能 從它們衍生整個(gè)范圍的免疫應(yīng)答。目前使用的基因療法的另一個(gè)問題 是突變基因的產(chǎn)物或確切功能可能未知，或遺傳病可能包括通過(guò)基因 -替代無(wú)法治療的因子的全部級(jí)聯(lián)。
本發(fā)明提供一種方法可避免這些擔(dān)心。例如，將SCID中的HS細(xì) 胞移植到患者骨髓中，這樣局部?jī)?nèi)源性因子就可衍生整個(gè)范圍的T-細(xì)胞和B-細(xì)胞。HLA相容性或移植物對(duì)宿主疾病的問題在這里將不成為 問題，因?yàn)榧?xì)胞是免疫相容性的.同樣，HS細(xì)胞可用于治療遺傳病， 該遺傳病是由可導(dǎo)致遺漏基因產(chǎn)物或酶缺乏的突變引起的.例如，目 前笨丙酮酸尿的治療是除去患者飲食中的苯基丙氨酸，這是因?yàn)榛颊?不能生產(chǎn)出把它轉(zhuǎn)化成輅氨酸所需的酶。將分化的HS細(xì)胞移植到這 些患者中，可產(chǎn)生所需的酶。同樣，HS細(xì)胞可在疾病，如A型血友病 中找到移植應(yīng)用，其中分化的HS細(xì)胞產(chǎn)生遺漏基因的產(chǎn)物，即凝血 因子VIII。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)體內(nèi)，優(yōu)選原位移植而誘導(dǎo)HS細(xì)胞 分化的方法，由此產(chǎn)生干質(zhì)，其中細(xì)胞經(jīng)歷組織學(xué)和功能分化，并形 成與宿主細(xì)胞的適當(dāng)連接。位于移植部位中的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子可將干 細(xì)胞定向分化成特定類型的分化細(xì)胞或組織。可選擇地，趨異分化細(xì) 胞和/或組織群來(lái)源于移植到皮下組織，腹膜，和腎囊中的干細(xì)胞。 這些和其它方法在美國(guó)專利申請(qǐng)系列第09/997, 240及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) 系列笫60/253, 943中描述.
本發(fā)明的多能分離HS細(xì)胞還可通過(guò)在無(wú)免疫應(yīng)答的動(dòng)物中進(jìn)行體 內(nèi)分化而分化成所選組織，接著分離所述組織，用于各種治療用途. 且HS細(xì)胞還可被體外培養(yǎng)和分化，用于研究，或診斷目的。
G. HLA分型HS細(xì)胞的儲(chǔ)存庫(kù)
HS細(xì)胞是純合的，并只攜帶一個(gè)HLA單倍型.因此，供體HS細(xì)胞 只有一個(gè)HLA單倍型與受體相匹配，而雜合干細(xì)胞則有兩個(gè)與之相匹 配。如上所述，有22個(gè)不同的HLA A抗原，42個(gè)不同的B抗原，9 個(gè)不同的Cw抗原和18個(gè)DR抗原。由于有這么多的多態(tài)HLA單倍型， 因此受體和供體之間的兩個(gè)單倍型完全匹配是非常困難的.在大多數(shù) 情況下，即存在連鎖不平衡和特定種族的HLA單倍型時(shí)，找到兩個(gè)單 倍型匹配的機(jī)會(huì)是1/1， 000-幾百萬(wàn)。然而，在相同情況下，對(duì)于常見 單倍型而言， 一個(gè)單倍型匹配的機(jī)會(huì)可能少于1/200人(見Martin 等，supra，對(duì)于美國(guó)的白種人而言，顯示大約172個(gè)常見單倍型的 總不平衡)。因此，可從多種族供體隨機(jī)采集HS細(xì)胞，從而提供HS 細(xì)胞群的儲(chǔ)存庫(kù)或庫(kù)，其中HS細(xì)胞群與大多數(shù)群的個(gè)體所攜帶的至 少一個(gè)單倍型免疫組織學(xué)匹配。該庫(kù)只需含有大約200種不同的HS細(xì)胞系，每個(gè)都具有不同的HLA單倍型，就可供絕大多數(shù)一般人群使 用(即，提供適于移植的免疫組織相容性細(xì)胞)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，將存儲(chǔ)庫(kù)的內(nèi)容分類，例如作為一個(gè)可檢索 的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)，幫助全世界從業(yè)者進(jìn)行遠(yuǎn)程，快速的篩選。本發(fā)明 提供一種生產(chǎn)基因分型的純合干(HS)細(xì)胞的方法，所述干細(xì)胞來(lái)源 于多個(gè)供體。理想地，選擇很可能廣泛具有趨異HLA單倍型的供體。 然后測(cè)定供體的肌A單倍型和基因型。HS細(xì)胞來(lái)源于所述供體，它是 通過(guò)下列步驟得到的，即有絲分裂激活供體純合的，減數(shù)分裂I后的 二倍體生殖細(xì)胞，從而生長(zhǎng)為多個(gè)胚泡樣團(tuán)，每個(gè)團(tuán)都含有一個(gè)對(duì)于 特定等位基因純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，分離所選ICM中的HS細(xì)胞， 培養(yǎng)該HS細(xì)胞，產(chǎn)生HS細(xì)胞系，測(cè)定所述各HS細(xì)胞系的基因型， 并把與每個(gè)所產(chǎn)生HS細(xì)胞系有關(guān)的HLA單倍型和基因型分類的.
下列實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明實(shí)驗(yàn)，它可進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明優(yōu)選實(shí) 施方案的效用，而不是對(duì)前述本發(fā)明教導(dǎo)和公開的限制。
H.實(shí)施例
實(shí)施例l.純合干細(xì)胞的形成，和在干質(zhì)內(nèi)它們分化成祖細(xì)胞及三個(gè)胚 層的各種組織
實(shí)施例1 (a):通過(guò)激活，隨后阻止第二極體擠出而從小鼠減數(shù)分裂 I后的卵母細(xì)胞衍生HS細(xì)胞
給3只8-周大的雌性C57/BDA2 Fl小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)腹膜下注射5 IU/100 jxl的孕馬血 清促性腺激素(PMS; PCCA， Houston, TX ( 29-1000-1BX))和5 IU/100 Ml人絨毛膜促性腺激素(HCG; Sigma, St. Louis， M0， (C8554 ))， 使它們超數(shù)排卵，兩次注射間隔48小時(shí)，注射HCG大約17小時(shí)后， 采集了 73個(gè)卵母細(xì)胞，然后通過(guò)在透明質(zhì)酸酶(Sigma, H4272 )的 液滴(約300pl)中培養(yǎng)新獲得的卵母細(xì)胞而除去卵丘，其中透明質(zhì) 酸酶以0. 3mg/ml的最終濃度稀釋在M2培養(yǎng)基(M7167, Sigma)中， 接下來(lái)，在進(jìn)一步處理之前，用HEPES緩沖的M2培養(yǎng)基洗滌3次。 然后，通過(guò)室溫時(shí)用5pM鈣離子載體(Sigma, C7522 )溶液處理5 分鐘而激活卵母細(xì)胞，接著用HEPES緩沖的M2培養(yǎng)基洗滌2次。37"C和55 :02的條件下，在M16碳酸氫鹽-緩沖培養(yǎng)基(Sigma, M7292 ) 中的5mM 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP) (Sigma ， D2629 )中進(jìn)一步培養(yǎng) 卵母細(xì)胞3小時(shí).培養(yǎng)后，用M16培養(yǎng)基洗滌卵母細(xì)胞3次，并在覆 蓋礦物油的M16培養(yǎng)基的液滴中培養(yǎng)，直到胚泡樣團(tuán)形成(4-5天)。 然后，胚泡樣團(tuán)自然從周圍的帶狀卵殼中醉出，將胚泡樣團(tuán)轉(zhuǎn)移到絲 裂霉素C處理過(guò)的鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞層中，并在含有20%胎牛血清 (Gibco， 16141-079 )和1, 400 U/ml LIF ( Chemicon，ESG1106)的ES 培養(yǎng)基(DMEM(Gibco, Life Technologies, Rockville， MD， 11995-065 )) 中培養(yǎng)至少15天，形成干細(xì)胞系。
可選擇地，在通過(guò)下列過(guò)程在飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)之前，進(jìn)行免疫 切除從而除去胚泡樣團(tuán)中的滋養(yǎng)層細(xì)胞.孵出的胚泡樣團(tuán)首先在37TC 時(shí)，用抗-小鼠Thy-l兔血清(在干細(xì)胞培養(yǎng)基中1:10稀釋，Accurate Chemical, Westbury， NY， ACL2001 )和抗-人淋巴細(xì)胞兔血清(在干 細(xì)胞培養(yǎng)基中1:10稀釋，Accurate Chemical, CL8010)培養(yǎng)1小時(shí). 用M2培養(yǎng)基洗滌3次后，371C時(shí)用豚鼠補(bǔ)體(在干細(xì)胞培養(yǎng)基中1:10 稀釋，Accurate Chemical, ACL4051 )培養(yǎng)胚泡樣團(tuán)30分鐘.然后在 M2培養(yǎng)基中洗滌補(bǔ)體-處理過(guò)的細(xì)胞團(tuán)3次，并將它轉(zhuǎn)移到絲裂霉素 C處理過(guò)的鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞層上，用于在千細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)， 其中所述干細(xì)胞培養(yǎng)基含有8054 Dulbecco，s修飾Eagle，s培養(yǎng)基(沒 有丙酮酸鹽，高葡萄糖配制；Gibco-BRL)，其中補(bǔ)充有20%胎牛血清 (Gibco-BRL)， lmM谷氨酰胺，0. lmM巰基乙醇(Sigma )， 1X非必需氨 基酸原液(Gibco-BRL)和1, 400 U/ml LIF (Chemicon, ESG1106 ),
15天后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)-衍生的生長(zhǎng)暈形成，并通過(guò)使用微量移液管而 被機(jī)械分離成一簇一簇，在新鮮干細(xì)胞培養(yǎng)基中的鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng) 層上反復(fù)接種.用微量移液管單獨(dú)選擇具有均勻未分化形態(tài)的集落， 將它們機(jī)械分離成簇，并重新鋪板. 一旦建立并擴(kuò)展，培養(yǎng)物通過(guò)與 胰蛋白酶/EDTA溶液(0. 05%/0. 5%,Gibco-BRL)接觸5分鐘而被傳代， 接著在飼養(yǎng)細(xì)胞和新鮮的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。
鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞是從Stemcell， Inc. ( 00308 )購(gòu)買的， 使用之前被傳代了 2-3次。為了有絲分裂抑制詞養(yǎng)細(xì)胞，37"C時(shí)，用 DMEM/10'/。FBS培養(yǎng)基中的5ml lOng/ml絲裂霉素C (Sigma, M4287 ) 處理60-mm培養(yǎng)皿中的融合-擴(kuò)展銅養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)。然后用5mlDMEM/10%FBS洗滌處理過(guò)的飼養(yǎng)細(xì)胞3次，并通過(guò)37TC時(shí)胰蛋白酶消 化5分鐘，接著用5ml DMEM/10%FBS培養(yǎng)基中和，lOOOrpm離心5分 鐘而收集。然后將所得的，用絲裂霉素-處理過(guò)的細(xì)胞顆粒狀物在15ml DMEM/10%FBS培養(yǎng)基中重懸浮，在3個(gè)60-mm培養(yǎng)皿(5ml細(xì)胞懸浮液 /皿)中接種，使用前，37匸過(guò)夜培養(yǎng)。
實(shí)施例l(b)夾源千雌性C57/DBA2雜交小鼠的，對(duì)子特定基因型和免 疫型純合的HS細(xì)胞的衍生
按照實(shí)施例l(a)所述，使對(duì)于絕大多數(shù)遺傳基因座和H-2 (小鼠 MHC)雜合的5只雌性C57DBA2雜交小鼠超數(shù)排卵，從而用于HS細(xì)胞 群的研究.得到11個(gè)細(xì)胞系，使它們?cè)谂囵B(yǎng)基中繁殖，然后低溫保 存。4吏用微衛(wèi)星標(biāo)記(Research Genetics),對(duì)大約傳代過(guò)5次的各 系細(xì)胞H-2基因座中的I-E-fl進(jìn)行免疫分型(PCR引物的序列 是Ebl:CAG AAC CTG AGT CCT GGG CG; Eb2:AGC AGA CCA GGA GGT TGT GG)，對(duì)D2mit42進(jìn)行基因型分析.
小鼠HS細(xì)胞的基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增，和遺傳分析(使用D2m i 14 2 微衛(wèi)星標(biāo)記)方法在實(shí)施例l(f)中描述.H-2 (I-E-P )的免疫分型 是通過(guò)在MDE凝膠(FMC Bioproducts )上進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) 分析，分離H-2等位基因的PCR產(chǎn)物而進(jìn)行的.來(lái)源于C57/DBA2雜 交小鼠的兩個(gè)代表性HS細(xì)胞系的基因型分析和免疫分型結(jié)果在圖9A-F給出，其中顯示了 C57/DBA2小鼠(圖9A )，和它超數(shù)排卵排出的卵 母細(xì)胞-衍生的胚泡樣團(tuán)(圖9B)及來(lái)源于兩個(gè)不同HS細(xì)胞系的兩個(gè) 代表性集落(圖9C和9D)。還給出了供體小鼠(第1道)，HS細(xì)胞系 -l (第2道)和HS細(xì)胞系-2 (第3道)的基因型(圖9E)和免疫型 (圖9F),
實(shí)施例1(c):通過(guò)激活，然后阻止第二極體擠出而發(fā)盲成夾源千人二 倍體卵母細(xì)胞的胚泡樣細(xì)胞團(tuán)
用leurpolide醋酸鹽(LuproiK TAP Pharmaceuticals, Deerfield， IL) 4吏雌性卵于供體經(jīng)過(guò)下調(diào)，然后通過(guò)以300IU/天的劑量接受促卵 泡激素(FSH) (Serono， Gona-F )處理而開始COH (可控卵巢過(guò)度-刺 激)，進(jìn)而誘導(dǎo)適宜的多卵泡應(yīng)答。當(dāng)滿足卵泡成熟的超聲波檢查標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，給予單一 10， 000IU劑量的人絨毛膜促性腺激素(hCG ) ( Serono， Profasi)，給予hCG之后，經(jīng)陰道抽吸卵泡約36小時(shí).通過(guò)與80 IU/ml 的透明質(zhì)酸酶接觸約30秒，然后與補(bǔ)充有10%人血清白蛋白(服PES-HTF-HSA) (InVitroCare, Inc. , SanDiego， CA， 2002和2101 )的HEPES-緩沖人輸卵管液接觸而除去回收卵母細(xì)胞中的卵丘。
為了實(shí)現(xiàn)有絲分裂激活，331C時(shí)，用HEPES-HTF-HSA中的5 n M 鈣離子載體(A23187， Sigma)處理沒有卵丘的成熟M-II卵母細(xì)胞5 分鐘，然后用HEPES-HTF-HAS洗滌3次，并于37X:時(shí)，在IVC-TW0 (InVitroCare， 2008 )中的l-5mM 6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP， Sigma) 中培養(yǎng)3-5小時(shí)。在IVC-ONE培養(yǎng)基(InVitroCare, 2006 )中培養(yǎng)激 活的卵母細(xì)胞3天，并在IVC-T肌EE (InVitroCare)中進(jìn)一步培養(yǎng)2 天，使細(xì)胞分離并形成胚泡樣團(tuán).
可選擇地，卵母細(xì)胞與ST0小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞共-培養(yǎng)。第6天，在顯 微操作器下加速孵化，其中用手持移液管(注射抽吸系統(tǒng))固定住胚 泡樣團(tuán)，使填充酸化臺(tái)羅德氏溶液(Medi-Cut， 1060-0002 )的微型-針頭在3點(diǎn)的位置與空的卵周隙接觸，從而通過(guò)保持針尖與帶非常緊 密的接觸而輕輕排出小面積(30微米)的酸化臺(tái)羅德氏溶液。當(dāng)帶內(nèi) 部被刺穿或變軟時(shí)，立即停止排出酸化的臺(tái)羅德氏溶液.然后，胚泡 樣細(xì)胞團(tuán)將從弱化帶中釋放。胚泡樣團(tuán)自帶分離后，進(jìn)行免疫切除， 即37"C時(shí)，通過(guò)用抗-人Thy-l (在IVC-T肌EE中1:10稀釋，Accurate Chemical, Westbury， NY, CBL415-CD90)和抗-人淋巴細(xì)胞(在IVC-THREE中1:10稀釋，Accurate Chemical, CL8010)培養(yǎng)該團(tuán)1小時(shí) 而除去滋養(yǎng)層細(xì)胞.用IVC-T肌EE培養(yǎng)基洗滌3次后，37TC用L0W-T0X 豚鼠補(bǔ)體(在IVC-T肌EE中1:10稀釋，Cedarland, CL4051 )培養(yǎng)所 述胚泡樣團(tuán)30分鐘.然后在IVC-THREE培養(yǎng)基中洗滌補(bǔ)體-處理過(guò)的 細(xì)胞團(tuán)3次，并將其轉(zhuǎn)移到絲裂霉素-C處理過(guò)的STO (ATCC)飼養(yǎng)細(xì) 胞層，并在千細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中干細(xì)胞培養(yǎng)基含有80仰ulbecco，s 修飾Eagle，s培養(yǎng)基(沒有丙酮酸鹽，高葡萄糖配制；Gibco-BRL)， 其中補(bǔ)充有ImM谷氨酰胺，0. ImM巰基乙醇(Sigma), 1%非必需氨基 酸原液(Gibco-BRL)和l, 400U/ml LIF (Chemicon, ESG1106),見圖 10A。實(shí)施例l(d):通過(guò)激活，然后使第二極體擠出并進(jìn)行基因組自我-復(fù) 制而使來(lái)源于人減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細(xì)胞的胚泡樣細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng) 超數(shù)排卵，卵母細(xì)胞回收，和隨后除去卵丘的過(guò)程在實(shí)施例1 (b) 中描述。為了實(shí)現(xiàn)有絲分裂激活，沒有卵丘的成熟M-II卵母細(xì)胞經(jīng) 過(guò)假胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)，從而模擬精子導(dǎo)致的激活，接著331C 時(shí)，用25pM鈣離子栽體(A23187， Sigma)培養(yǎng)5分鐘。以這種方式 激活的卵母細(xì)胞擠出第二極體，并變成單倍體.將這種單倍體卵母細(xì) 胞在IVC-ONE培養(yǎng)基(InVitroCare， Inc.)中培養(yǎng)3天，并進(jìn)一步在 IVC-T肌EE (InVitroCare)中培養(yǎng)2天，從而使細(xì)胞分離并形成胚泡
樣細(xì)胞團(tuán)。胚泡樣團(tuán)隨后的操作在實(shí)施例1 (b)中描述.激活產(chǎn)生的 單倍體卵母細(xì)胞能夠自我-復(fù)制它們沒有細(xì)胞因子的基因組，并產(chǎn)生
二倍體細(xì)胞(Taylor, A. S.等，H咖.Reprod. 9 ( 12 ): 2389-97 ( 1994 ); Kaufman, M.H.等，J, Embryol. Exp. Morphol. 73: 249-61 ( 1983 ))。見 圖IOB-D。
實(shí)施例l(e): 小鼠HS細(xì)胞的生長(zhǎng)，小鼠腎囊下的這種HS細(xì)胞的分 化，和這種細(xì)胞胚狀體的形成
按照實(shí)施例1(a)所述，在具有干細(xì)胞培養(yǎng)基的，0.1%明膠包被 的培養(yǎng)皿(iocm)中的小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞上，接種按照實(shí)施例l(a)所述， 從胚泡樣團(tuán)獲得的HS細(xì)胞，從而形成集落.
把HS細(xì)胞的其中一個(gè)集落分成若干份，接種到26只雜交小鼠兩 個(gè)腎嚢的其中一個(gè)中，誘導(dǎo)干質(zhì)形成.然后在移植后的第1， 3， 6， 9.5， 10.5， 11， 12和14周殺死小鼠，采集干質(zhì)。把每個(gè)干質(zhì)的一半固定 在福爾馬林中，用于進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究，另一半則在-80TC冷凍，用于 進(jìn)行分子的特性描述.干質(zhì)在第3周開始形成可見的大小.通過(guò)交叉 采集干質(zhì)，研究了各種在干質(zhì)內(nèi)生長(zhǎng)的組織類型.干質(zhì)基因型是通過(guò) C. 2.部分，supra中所述的PCR-等位基因分析證實(shí)的。
為了產(chǎn)生胚狀體(EB)，首先用PBS洗滌60mm培養(yǎng)皿上的HS細(xì)胞。 然后加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液，使細(xì)胞在37TC保持5分鐘。然后 加入5ml ES培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮棒取出細(xì)胞，1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘.將 因此獲得的細(xì)胞顆粒狀物重懸浮在5ml沒有LIF的干細(xì)胞培養(yǎng)基中， 計(jì)算細(xì)胞數(shù)。然后以2xl0Vl0cm培養(yǎng)皿的密度，將細(xì)胞接種在帶有蓋子和出口的懸浮液培養(yǎng)皿(Nalge Nunc International ， 171099， 35x10mm)中。細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中飼養(yǎng)4天，其中通過(guò)每 兩天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml試管中，等待大約5分鐘，直到細(xì)胞沉淀在 試管底部而替換培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到原始培養(yǎng)皿中，聚集成胚 狀體，用于進(jìn)一步分化。
實(shí)施例l(f):畸胎瘤內(nèi)人HS細(xì)胞的分化，及這種分化組織的基因純 合性
31 個(gè)畸胎瘤是從 Armed Forces Institute of Pathology,Washington, DC和Department of Pathology, New York University, New York, NY (Dr.J.Liu)回收的。在20個(gè)女性患者的 卵巢肺瘤中發(fā)現(xiàn)了各種不同種類的專有分化組織.FISH分析證實(shí)分化 組織是二倍體，其中FISH分析是使用本領(lǐng)域已知的方法，及染色體3 和8的a-衛(wèi)星探針在代表性病例中進(jìn)行的。鑒定并選擇性顯微解剖 了在7個(gè)女性患者卵巢腫瘤和4個(gè)男性患者睪丸腫瘤中發(fā)現(xiàn)的，未分 化和分化組織的3到12個(gè)組織學(xué)區(qū)域，用于進(jìn)行遺傳分析.在每個(gè) 病例中，分化組織是基因純合的，而未分化組織是基因雜合的.
顯微解剖.用二甲苯使載玻片上的未染色6-微米切片脫蠟，在 100%-80%的乙醇中漂洗，用蘇木紫和曙紅簡(jiǎn)單染色，并在TE緩沖液 中的10%甘油中漂洗.在直射光顯微顯色下進(jìn)行組織顯微解剖.對(duì)于 每個(gè)病例而言，不同組織分化的6-12個(gè)區(qū)域是單獨(dú)顯微解剖的，用 于進(jìn)行遺傳分析。此外，獲得正常，非-肺瘤組織的多個(gè)區(qū)域。
DNA提取.將獲得的細(xì)胞立即重懸浮在25^1含有Tris-HCl， pH8. 0; 1. 0mM乙二胺四乙酸，pH8. 0; 1%吐溫20;和0. 5mg/ml蛋白酶 K的緩沖液中，37"C過(guò)夜培養(yǎng).使化合物沸騰5分鐘，從而滅活蛋白 酶K， 1. 5nl該溶液用于DNA的PCR擴(kuò)增。
遺傳分析.為了可靠鑒定顯微解剖后得到的限量DNA中的純合性， 使用了 14種不同的高度多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記分析來(lái)多種不同的顯微解 剖組織樣品，所述微衛(wèi)星標(biāo)記包括DIS1646和DIS243 (lp)， D3S2452 (3p)， D5S346 ( 5q)， D7S1822 ( 7q )， Ank-l ( 8p )， D9S171(9p)， D9S303 (9q)， Int-2和PYGM(llq)， IFNA(9p)， D17S250 ( 17q )， CYP2D(22q)， 和AR (Xq)。每份PCR樣品在總共10^1的體積中含有1. 5pl上述模板DNA， 10pmol各種引物，20nmol各種dATP， dCTP， DGTP，和DTTP， 15mM MgCl2， 0.1U Taq DM聚合酶，0. 05ml [32P] dCTP ( 6000Ci/mmol )，和l^il IOX緩沖液。PCR共循環(huán)35次95*€變性1分鐘，退火1分鐘(根據(jù) 標(biāo)記不同，退火溫度為551C-601C)和72tM申展60秒。最后的伸展持 續(xù)10分鐘。標(biāo)記的擴(kuò)增DM與等體積的甲酰胺加樣染料(95%甲酰 胺，20mM EDTA， 0.05%溴酚藍(lán)，和0. 05 % 二甲苯腈藍(lán))混合。
將變性5分鐘的樣品以95%裝樣到含有6%丙稀酰胺(丙稀酰胺 二丙稀酰胺49:1)的凝膠上，1800V時(shí)電泳90分鐘。電泳后，將凝 膠轉(zhuǎn)移到3mm的Whatman紙上，干燥.放射自顯影可用Kodak X-0MAT 股片(Eastman Kodak, Rochester, NY)進(jìn)行。
結(jié)果.顯示出與相同等位基因 一致純合性的分化畸形組織包括鱗狀 上皮，神經(jīng)膠質(zhì)，和軟骨的顯微解剖樣品(用標(biāo)記Ankl(頂部)和D1S1646 (底部)分析).正常的卵巢組織用作對(duì)照。
在畸胎瘤的亞型中，具有相異等位基因(用標(biāo)記Int-2， D9S303, D1S1646， D3S2452，和Ankl)的分化畸形組織包括表皮，皮脂腺，呼 吸上皮，和神經(jīng)膠質(zhì)的樣品，正常的卵巢組織用作對(duì)照.在這種腫瘤 中，據(jù)信等位基因雜合性是由于生殖細(xì)胞減數(shù)分裂I之前，引發(fā)腫瘤 發(fā)生而引起的。在引發(fā)致畸腫瘤細(xì)胞之后，隨機(jī)的獨(dú)立事件可產(chǎn)生具 有減數(shù)分裂后基因型的祖細(xì)胞.
還分析了 一系列含有分化和未分化組織的卵巢畸胎瘤和睪丸生殖 細(xì)胞瘤.在每種腫瘤中，均獲得了未分化和分化的組織元件。純合及 雜合成分是使用標(biāo)記D3S2452, D3S303， CYP2D，和D17S250檢測(cè)的。 正常的卵巢和睪丸組織用作對(duì)照.雜合等位基因是在包括未成熟鱗狀 上皮，神經(jīng)組織(有時(shí)來(lái)源于相同腫瘤內(nèi)神經(jīng)組織的分離區(qū)域)，軟 骨，腺結(jié)構(gòu)，和間質(zhì)的未分化組織元件中檢測(cè)的.通過(guò)顯微解剖從相 同腫瘤中分離出來(lái)的分化組織元件對(duì)于同一標(biāo)記是純合的.進(jìn)行試驗(yàn) 的成熟元件包括皮脂腺組織，毛嚢，和成熟的鱗狀上皮(有時(shí)來(lái)源 于相同腫瘤內(nèi)鱗狀上皮的分離區(qū)域).在某些腫瘤中，分化元件顯示 出相反的純合等位基因，表示重組，或暗示各種元件分別來(lái)源于不同 的減數(shù)分裂后細(xì)胞。
實(shí)施例1(g).從人HS細(xì)胞的初級(jí)分化衍生祖細(xì)胞用1. 5ml胰蛋白酶/EDTA (Invitrogen, #25300-050)將HS細(xì)胞胰 蛋白酶消化，其中HS細(xì)胞是在具初生胚成纖維細(xì)胞層的60mm培養(yǎng)亞
(Falcon, #353802 )和/或包被0.1 %明膠的培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的，然后 將它轉(zhuǎn)移到15ml圓錐形試管的1. 5ml ES-LIF培養(yǎng)基中。然后以1200rpm 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，除去上清液。將細(xì)胞顆粒狀物重懸浮在2ml ES-LIF培養(yǎng) 基的單細(xì)胞混懸液中，以l-3X106個(gè)細(xì)胞的密度，在懸浮培養(yǎng)基-35*10,-培養(yǎng)皿(NalgeNunc， #171099 )中作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)4-6天， 干細(xì)胞形成圓球形聚簇，被稱為胚狀體(EBs)。每2天通過(guò)將EBs轉(zhuǎn) 移到15ml圓錐形試管中，并沉淀在底部而洗滌形成的EBs.除去上清 液，加入新的ES-LIF.將Ebs放回懸浮培養(yǎng)皿中。作為胚狀體生長(zhǎng)的 HS細(xì)胞含有所有胚層，即外胚層，中胚層，和內(nèi)胚層。
外胚層的祖代.4-6天后，在lml胰蛋白酶/EDTA中胰蛋白酶消化 EBs，在4ml ES-LIF培養(yǎng)基中洗滌，并在DMEM/Knockout培養(yǎng)基
(Invitrogen， # 10829-018 )中的單細(xì)胞混懸液中重懸浮，其中所述 培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%血清替代物(Invitrogen， # 10828 )，和G5
(Invitrogen， # 17503 )， N2 (Invitrogen, # 17502-048 )或P NGF
(100ng/ml) (RftD Systems, # 256-GF),以3-5X105/3ml的密度在覆 蓋纖連蛋白的35咖培養(yǎng)皿(50ug/ml) (Sigma,并F-0895 )中培養(yǎng)這 些細(xì)胞10天，每2-3天替換一次培養(yǎng)基。
可選擇地，在覆蓋0.1%明膠的培養(yǎng)皿中的ES-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng) Ebs 1-2天，然后將培養(yǎng)基換為沒有血清的，補(bǔ)充有胰烏素(5ug/ml )， 氯化硒(O. 15nM)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(50ug/ml )，和纖連蛋白(5ug/ml)( Sigma ) 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天。胰蛋白酶消化所述細(xì)胞，在補(bǔ)充有N2
(Invitrogen, # 17502-048 )， B27 ( Invitrogen, # 17504-44 )，和 bFGF (10ng/ml) (Invitrogen, # 13256-029 )的N2培養(yǎng)基(沒有血 清的DMEM/F12)培養(yǎng)單細(xì)胞混懸液.計(jì)算細(xì)胞數(shù)，并以2-5乂104個(gè)細(xì) 胞/孔/400uL N2培養(yǎng)基的密度，將細(xì)胞接種在預(yù)先覆蓋了聚-L-鳥氨 酸(15ug/ml) (Sigma， # P36550 )的24-孔平板中，擴(kuò)展6天，
通過(guò)加入G5， RA， FGF， NGF， GNDF,或BNDF而使這些祖代進(jìn)一步 分化成不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型。它們?cè)跅l件培養(yǎng)基中保存，以便進(jìn)行 細(xì)胞擴(kuò)展。
中胚層祖代.對(duì)于中胚層祖代而言，如上所述，培養(yǎng)補(bǔ)充有10%血清替代物和P-NGF的DMEM/Knockout培養(yǎng)基中的單細(xì)胞混懸液10天， 每2/3天替換一次培養(yǎng)基。之后，細(xì)胞在補(bǔ)充了活化素A (20ng/ml) (Sigma, #A4941 )的條件培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)10天，用于形成心臟 祖細(xì)胞?？蛇x擇地，對(duì)于腎和苗勒氏管的祖細(xì)胞而言，細(xì)胞在補(bǔ)充有 活化素A (20ng/ml) (Sigma, #A4941 )的條件培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)， 之后向培養(yǎng)基中加入2ng/ml的TGF-P (R&D Systems, # )，細(xì)胞進(jìn) 一步培養(yǎng)4-6天。
內(nèi)胚層祖代.對(duì)于內(nèi)胚層祖代而言，如上所述，將補(bǔ)充有10%血清 替代物和G5或0-NGF的DMEM/Knockout培養(yǎng)基中的單細(xì)胞混懸液培 養(yǎng)10天，其中該培養(yǎng)基覆蓋有層粘連蛋白(10ug/ml ) ( Sigma, #L2020)，或膠原I (lOug/ml) (Sigma, #C-7661 ),將HGF (20ng/ml) 和/或TGF-a (2ng/ml)加入到培養(yǎng)基中，替換G5或P -NGF，細(xì)胞進(jìn) 一步培養(yǎng)6-8天.
可選擇地，將EBs平板接種在覆蓋膠原I的培養(yǎng)亞上，在ES-LIF 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。加入FGF (20ng/ml)，細(xì)胞再培養(yǎng)3天。之后， 加入HGF ( 20ng/ml)和/或TGF-a ( 2ng/ml )，再培養(yǎng)6天。
將EBs也轉(zhuǎn)移到覆蓋層粘連蛋白的粘連培養(yǎng)皿(10ng/ml) ( Sigma, #L2020)或覆蓋0.1%明膠的35*10mm粘連培養(yǎng)皿中，在ES-LIF培養(yǎng) 基中培養(yǎng)1-2天，除去培養(yǎng)基，用胰烏素(5ug/ml) (Invitrogen， #11882 )，氯化硒(0. 015nM) (Sigma ， #S5261 )，轉(zhuǎn)鐵蛋白(50ug/ml) (Sigma, #T2036 )，和纖連蛋白(5ug/ml) ( Sigma )補(bǔ)充沒有血清的 DMEM/F12 ( Invitrogen， # 11330-0321 )培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基被命名為 ITSFn培養(yǎng)基。細(xì)胞在ITSFn培養(yǎng)基中飼養(yǎng)6天，其中每2天替換一 次培養(yǎng)基。
實(shí)施例l(h):源于移植HS細(xì)胞的純合祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和分離
為了獲得純合祖細(xì)胞，把按照前述公開方法得到的多能HS細(xì)胞移
植到無(wú)免疫應(yīng)答的小鼠腎嚢中，使其在體內(nèi)生長(zhǎng)4-6周.然后將所得
細(xì)胞團(tuán)破碎成單一的細(xì)胞，并在祠養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)，以便進(jìn)一步繁殖，
并生長(zhǎng)為細(xì)胞系。
為了評(píng)估細(xì)胞系定型(祖細(xì)胞的類型)，可對(duì)已知的細(xì)胞系-特異
性標(biāo)記進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定，如RT-PCR， RNA印跡，免疫組織化學(xué)等，其中外胚層的親緣-特異性標(biāo)記為NF-H，角蛋白，D-P-H，中胚層的 細(xì)胞系-特異性標(biāo)記是烯醇化酶，CMP，凝乳酶，激肽釋放酶，WT1， 5-珠蛋白，p-珠蛋白，內(nèi)胚層祖細(xì)胞系的標(biāo)記是白蛋白，a-l-AT， 淀粉酶，PDX-1，胰島素，oc-FP。
實(shí)施例2:從來(lái)源于親屬(目標(biāo)受體的父母)所供材料的HS細(xì)胞群中 選擇具有靶免疫型的HS細(xì)胞
卵母細(xì)胞是利用上述實(shí)施例描述的方法，通過(guò)超數(shù)排卵從受體的 母親獲得的。在進(jìn)行了前面實(shí)施例所述的方法之后， 一旦HS細(xì)胞群 生長(zhǎng)，每個(gè)HS群的樣品都會(huì)經(jīng)歷體外分化，進(jìn)行HLA分子(例如， 造血系)的最佳表達(dá)，利用微量淋巴細(xì)胞毒測(cè)定法測(cè)試每個(gè)群HS衍 生的樣品細(xì)胞對(duì)HLA-A， -B，和-C的特異性。該試驗(yàn)是在60-或72孔 微量淋巴細(xì)胞毒平板中進(jìn)行的。選擇一組市售的抗血清，并將其預(yù)先 傾注在平板上，在-401C或-70"C的冰庫(kù)中冷卻。將0. 5-lpl的HS細(xì) 胞混懸液(使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)把HS細(xì)胞懸浮在RPMI中，或稀釋至 分型所需的1.5xl06HS-衍生的樣品細(xì)胞/ffll而制備)分散到平板的每 個(gè)孔中，20-22"培養(yǎng)30分鐘.然后在平板的每個(gè)孔中加入2-5pl補(bǔ) 體，20-22*€培養(yǎng)60分鐘。市售補(bǔ)體是冷凍干燥形式的混合兔血清. 然后在每個(gè)孔中加入lpl的5%曙紅溶液，再加入1^1甲窿.使用 合適的顯微鏡，通過(guò)測(cè)量固定在細(xì)胞上的染料量而確定每個(gè)孔中死亡 的細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估系統(tǒng)，從0到8，其中8是代表強(qiáng)陽(yáng)性的80-100 % ， 2是代表可疑陽(yáng)性的20-40% .
然后利用PCR-RFLP分析測(cè)試樣品細(xì)胞對(duì)HLA-DR， -DQ和-DB的特 異性。DNA是使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程從HS細(xì)胞提取的。然后用2. 5U Taq聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增200-300ng的提取DNA,用于擴(kuò)增II類HLA 的PCR引物在圖11列出。擴(kuò)增后，將4-7nl的反應(yīng)混合物加入到含 有圖5所列限制酶和適當(dāng)限制緩沖液的溶液中，培養(yǎng)3小時(shí)。29種不 同的酶用于全部II類分型。在小型設(shè)備(例如，從E-Y laboratories Inc., San Mateo， Ca獲得的Mupid-2 )中，使用12%聚丙稀酰胺水 平凝膠，使由限制性酶裂解的擴(kuò)增DM樣品經(jīng)過(guò)電泳.通過(guò)用溴化乙 錠染色而檢測(cè)RFLP片段。
受體的免疫型是利用上述血清學(xué)和分子方法測(cè)定的。在20ml受體(靶)的靜脈血中加入枸櫞酸鈉抗凝血?jiǎng)?lml 3. 3 4的枸櫞酸鈉/10ml 血液)中。然后用等體積的肝素化HBSS (lml 1000U/ml肝素對(duì)100ml HBSS )稀釋枸櫞酸鹽血。用移液管將10ml體積的稀釋血鋪在17-120, 螺旋蓋離心試管的4ml Ficoll-isopaque上。然后700xg離心試管15-20 分鐘。紅細(xì)胞及多形核細(xì)胞構(gòu)成試管末端的顆粒狀物，而淋巴細(xì)胞則 形成Ficoll-isopaque界面的不連續(xù)層.將'淋巴細(xì)胞層吸到另一個(gè)試 管中，用HBSS覆蓋，250xg離心5分鐘。然后將淋巴細(xì)胞顆粒狀物重 懸浮，用HBSS洗滌，120xg再次離心5分鐘。這個(gè)步驟可分離絕大多 數(shù)懸浮在上清液中的血小板，而在試管底部形成淋巴細(xì)胞的顆粒狀 物。棄去HBSS，將淋巴細(xì)胞顆粒狀物重懸浮在冊(cè)SS中，最后一次以 250xg旋轉(zhuǎn)5分鐘。然后棄去HBSS，并在RPMI或分型所需的稀釋劑 中重懸浮淋巴細(xì)胞顆粒狀物.重復(fù)上述樣品干細(xì)胞的HLA-A， B和C 分型過(guò)程，確定靶HLA-單倍型.
另20ml或更少的受體靜脈血用于II類HLA的分子分型。使用本 領(lǐng)域已知技術(shù)提取受體血細(xì)胞的基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增。然后進(jìn) 行上述的RFLP分析。
受體的HLA單倍型可能是純合的或雜合的，在任何一種情況下， 一個(gè)HLA單倍型(例如，母本II)與來(lái)源于母親卵母細(xì)胞的一個(gè)HS 細(xì)胞群匹配。 一旦確定HS群具有靶免疫型，那么可使用美國(guó)專利申 請(qǐng)系列第09/997, 240和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943中描述的技 術(shù)使它們體內(nèi)，或體外分化，然后移植到受體中，這兩篇文獻(xiàn)全部引 入此處作為參考。
實(shí)施例3:從泉源于目標(biāo)受體(自身供體)所供材料的HS細(xì)胞群中選 擇具有靶基因型的HS細(xì)胞
在預(yù)定的移植受體患有與突變基因序列表達(dá)有關(guān)的遺傳病的那些 例子中，必需選擇對(duì)于非-突變單倍型(例如，"靶"基因型)純合的 HS細(xì)胞群。選擇基因型的代表性方案如下
在這個(gè)實(shí)施例中，目標(biāo)受體是患有鐮狀細(xì)胞性貧血的婦女。多數(shù) 人類疾病都與遺傳突變有關(guān)，所迷遺傳突變可影響一個(gè)或多個(gè)編碼血 紅蛋白多肽鏈的基因，其中的疾病包括鐮狀細(xì)胞性貧血，它由血紅蛋 白P-鏈中的點(diǎn)突變引起。與鐮狀細(xì)胞性貧血有關(guān)的突變基因遺傳序列已經(jīng)公開，并被廣泛研究過(guò)。見，例如，Saiki等，1985， Science, 230， 1350-1354，引入此處作為參考.
一系列HS細(xì)胞群是按照實(shí)施例1所述的過(guò)程，從目標(biāo)受體的卵母 細(xì)胞得到的。然后測(cè)定群的基因型。只選擇均勻攜帶靶基因型(例如， 正?；蛞吧突颍皇峭蛔兓?的那些群進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
在這個(gè)實(shí)施例中，與鐮狀細(xì)胞性貧血有關(guān)的突變基因是通過(guò)等位 基因-特異性雜交，或"ASH"檢測(cè)的。該技術(shù)的基礎(chǔ)是，當(dāng)堿基對(duì)完 全互補(bǔ)時(shí)，短的單鏈寡核苷酸探針穩(wěn)定退火成單鏈靶核酸.然后根據(jù) 探針上的放射性或非-放射性標(biāo)記檢測(cè)雜交(標(biāo)記探針和其它核酸的 方法在下面詳細(xì)描述)。ASH標(biāo)記可被用作優(yōu)勢(shì)標(biāo)記，其中是否只存在 一個(gè)等位基因(或單倍型)可根據(jù)是否僅通過(guò)一個(gè)探針雜交而測(cè)定. 選擇性等位基因可根據(jù)缺少雜交而推斷。
已經(jīng)研究出ASH標(biāo)記可用于診斷對(duì)DM序列點(diǎn)突變引起的人類疾 病的敏感性。用于檢測(cè)與鐮狀細(xì)胞性貧血有關(guān)的ps-珠蛋白等位基因 的ASH標(biāo)記由Conner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278-282， 1983描述，其引入此處作為參考.
細(xì)胞樣品是從每種HS群采集的，基因組DM是使用常規(guī)方法提取 的。在進(jìn)行了 Conner等，supra,描述的過(guò)程之后，用限制性內(nèi)切核 酸酶消化基因組DM,利用PCR (見Mullis, K.B.等，Methods Enzymol. 155: 335-350 ( 1987 )，引入此處作為參考)擴(kuò)增所得核酸片 段，得到擴(kuò)增子.然后將擴(kuò)增子轉(zhuǎn)移到具有放射性-標(biāo)記寡核苷酸探 針的膜中，其中該探針對(duì)鐮狀細(xì)胞性白血病特異，并以斑點(diǎn)印跡方式 與膜結(jié)合.雜交斑點(diǎn)是通過(guò)放射自顯影法檢測(cè)的?？蛇x擇地，擴(kuò)增子 可被標(biāo)記，且探針是膜束綽的.
一旦確定樣品具有靶免疫型和基因型，那么可使用美國(guó)專利申請(qǐng) 系列第09/997, 240和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943中描述的技術(shù) 使它體內(nèi)，或體外分化，然后將它移植到受體中，這兩篇文獻(xiàn)全部引 入此處作為參考。
對(duì)于由于內(nèi)科疾病而不適于自身供體的男性受體和女性受體而 言，具有靶免疫型和基罔型的HS細(xì)胞可從女性家族成員的供體獲得。 一旦確定樣品群具有靶免疫型和基因型，那么可利用美國(guó)專利申請(qǐng)系 列第09/997, 240和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943中描述的技術(shù)使
48它體內(nèi)，或體外分化，然后將它移植到受體中，這兩篇文獻(xiàn)全部引入 此處作為參考。
實(shí)施例4:從來(lái)源于沒有親緣關(guān)系個(gè)體(非自身，沒有親緣關(guān)系的供 體)所供材料的HS細(xì)胞群選擇具有靶免疫型和耙基因型的HS細(xì)胞
在某些情況下，供體材料不能從目標(biāo)受體或近親獲得.在這種情 況下，必需相對(duì)于靶免疫型和靶基因型篩選HS群。選擇靶免疫型和 靶基因型的代表性方案如下。
HS細(xì)胞群是使用上面實(shí)施例1所述的方案從提取自供體的卵母細(xì) 胞得到的。 一旦HS細(xì)胞群生長(zhǎng)，則使用上面實(shí)施例2所述的微量淋 巴細(xì)胞毒法，相對(duì)于HLA-A， -B，和-C的特異性將樣品細(xì)胞分型。
利用PCR-SS0P過(guò)程將HS細(xì)胞進(jìn)一步分型為II類HLA抗原。然后 用2. 5U Taq聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增200-300ng的提取DNA,擴(kuò)增HLA-DRB/DQB/DPB的PCR引物，和用于寡核苷酸分型的所有引物組合的循 環(huán)條件在圖14列出.然后將2.5^1反應(yīng)混合物的等分試樣與50^1 NH4-醋酸鹽1M混合，使用Minifold II stot印跡裝置(Schleicher & Schuell)將它們?nèi)斯ね吭谶^(guò)濾器(Nytran， Schleicher & Schuell) 上.把它們放在0.4N的NaOH中10分鐘而使膜變性，在1M仰4-醋酸 鹽中中和10分鐘，室溫干燥。每個(gè)膜均含有雜交的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
然后在lO]iil反應(yīng)物中，用["Py-ATP和多核苷酸激酶標(biāo)記用于 雜交的寡核苷酸。所述反應(yīng)物含有6pmo1寡核苷酸，25jiCi ATP， ljil 激酶緩沖液(0.5M tris-HC1， pH7. 6， 0. lMMgCl2， 50mM 二硫蘇糖醇 (DTT )， lmM亞精胺，lmM EDTA )，和5UT4多核苷酸激酶(Pharmacia ). 37TC時(shí)，培養(yǎng)反應(yīng)物30分鐘，在DE52 (Whatman, Cat.No. 4057-050) 柱上純化標(biāo)記的寡核苷酸.裝柱后，用10ml洗滌緩沖液(150mMNaCl， 20mM Tris-HCl， pH7. 8， 10mM EDTA)洗滌寡核苷酸，然后用0.2ml洗 脫緩沖液UMNaCl， 20mM Tris-HCl， pH7.8， lmM EDTA)部分洗脫。
然后使各膜與放射性寡核苷酸雜交。首先，在54"C時(shí)，用氯化四 甲銨雜交(TMAC)緩沖液(50mMTris-HCl， pH8. 0， 3M TMAC ( Fluka )， 2mM EDTA, pH8. 0, 5x Denhardt，s， 0. 1%十二烷基硫酸鈉，100pg/ml 變性的鮭魚精子DNA，通過(guò)Whatman 3MM紙過(guò)濾)進(jìn)行30分鐘預(yù)雜交。 然后于54*€時(shí)，在含有0. 5xl06cpm/ml標(biāo)記寡核苷酸的TMAC雜交緩沖液中雜交該膜1-3小時(shí)。室溫在TMAC洗滌緩沖液中洗滌印跡2次， 每次10分鐘，然后于591C (19-mers)時(shí)，在相同的洗滌緩沖液中再 次洗滌兩次，每次15分鐘。該過(guò)程由Hui等，在Handbook, 119-123 詳細(xì)描述，其引入此處作為參考。
靶免疫型是使用上面實(shí)施例2所述的血清學(xué)和分子方法確定的. 靶單倍型可以是純合的或雜合的。在任何一種情況下，受體至少一個(gè) HLA單倍型與樣品HS群的HLA相匹配的可能性很高，其中樣品HS群 來(lái)源于與受體相同種族的，沒有親緣關(guān)系的卵母細(xì)胞供體的細(xì)胞群(見 上面)'
在本發(fā)明中，無(wú)需排除患有遺傳病的沒有親緣關(guān)系的婦女，這是 因?yàn)槿鄙偌膊』蛐偷腍S細(xì)胞可被衍生.例如，外源供體(例如， 沒有親緣關(guān)系的個(gè)體)是患有P-地中海貧血的婦女。p-地中海貧血 是血紅蛋白合成中的基因缺陷.不能制造足量的珠蛋白鏈.(x-和P-地中海貧血是血液疾病，由基因突變引起，所述基因突變?cè)诒硇蜕媳?現(xiàn)為一種類型珠蛋白鏈的缺陷合成，其可導(dǎo)致其它類型珠蛋白鏈過(guò)量 合成，通常見，Weatherall等，The thalassaemia Syndromes, 3rd ed.， Oxford, Blackwell Scientific, 1981和美國(guó)專利第5, 750, 345。與 P-地中海貧血有關(guān)的0°-地中海貧血等位基因由Pirastu等，New Englan J.Med. 309: 284-287， 1983描述，其引入此處作為參考.因此，
在本實(shí)施例中，"靶"基因型缺少P°-地中海貧血等位基因，突變單倍 型與病理學(xué)有關(guān).
在測(cè)定基因型時(shí)，只選擇均勻攜帶靶基因型(例如，正?；蛞吧?型基因，而不是突變基因)的那些群進(jìn)行進(jìn)一步的研究.靶基因型， 例如缺少與P-地中海貧血相應(yīng)的基因，是按照與上面實(shí)施例3所述 鐮狀細(xì)胞性貧血類似的方案檢測(cè)并選擇的，其中使用了對(duì)P-地中海 貧血特異的ASH探針(見，Weatherall等，和Piratsu等，supra.),
一旦確定樣品群具有靶免疫型和基因型，則可使用美國(guó)專利申請(qǐng) 系列第09/997, 240和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第60/253, 943中描述的技術(shù) 使它體內(nèi)，或體外分化，然后將它移植到目標(biāo)受體中，這兩篇文獻(xiàn)全 部引入此處作為參考。
權(quán)利要求
1.一種從未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞生產(chǎn)具有靶基因型的純合干(HS)細(xì)胞的方法，包括(a)確定靶基因型；(b)有絲分裂激活未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞，發(fā)育成多個(gè)胚泡樣團(tuán)，每個(gè)團(tuán)都含有一個(gè)對(duì)于靶基因型為純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)；(c)從ICM中分離HS細(xì)胞；(d)培養(yǎng)分離的HS細(xì)胞，獲得HS細(xì)胞系；(e)確定每個(gè)HS細(xì)胞系的基因型；并(f)選擇對(duì)于靶基因型為純合的細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶基因型不含與特定疾 病或紊亂有關(guān)的遺傳突變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶基因型含有與特定疾 病或紊亂有關(guān)的遺傳突變。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述未受精的，減數(shù)分 裂I后的二倍體生殖細(xì)胞是從雜合供體獲得的，所述雜合供體攜帶與 特定疾病或紊亂有關(guān)的突變等位基因及相應(yīng)的野生型等位基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述未受精的，減數(shù)分裂I 后的二倍體生殖細(xì)胞是由供體提供的，所得的HS細(xì)胞準(zhǔn)備用于有需要的受體.
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述供體和受體是同一個(gè)體， 其中所述供體和受體有親緣關(guān)系，或其中所述供體和受體沒有親緣關(guān) 系。
7. —種從未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞生產(chǎn)具有靶 免疫型的純合干(HS)細(xì)胞的方法，包括(a) 確定靶免疫型；(b) 有絲分裂激活未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞， 發(fā)育成胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)團(tuán)都含有一個(gè)對(duì)于靶免疫型為純合的內(nèi)細(xì) 胞團(tuán)(ICM);(c) 從ICM中分離HS細(xì)胞；(d) 培養(yǎng)分離的HS細(xì)胞，獲得HS細(xì)胞系；(e) 確定每個(gè)HS細(xì)胞系的免疫型；并(f) 選擇對(duì)于靶免疫型為純合的細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述靶免疫型不含與特定疾 病或紊亂有關(guān)的遺傳突變。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述靶免疫型含有與特定疾 病或紊亂有關(guān)的遺傳突變.
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述未受精的，減數(shù) 分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞是從雜合供體獲得的，所述雜合供體攜帶 與特定疾病或紊亂有關(guān)的突變等位基因及相應(yīng)的野生型等位基因。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述未受精的，減數(shù)分裂I 后的二倍體生殖細(xì)胞是由供體提供的，所得的HS細(xì)胞準(zhǔn)備用于有需要的受體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述供體和受體是同一個(gè) 體，其中所述供體和受體有親緣關(guān)系，或其中所述供體和受體沒有親 緣關(guān)系。
13. —種從未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞生產(chǎn)具有 靶免疫型和基因型的純合干(HS)細(xì)胞的方法，包括(a) 確定靶免疫型和基因型；(b) 有絲分裂激活未受精的，減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞， 發(fā)育成胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)團(tuán)都含有一個(gè)對(duì)于靶免疫型和基因型為純 合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM);(c) 從ICM中分離HS細(xì)胞；(d) 培養(yǎng)分離的HS細(xì)胞，獲得HS細(xì)胞系；(e) 確定每個(gè)HS細(xì)胞系的基因型；并(f) 選擇對(duì)于靶免疫型和基因型為純合的細(xì)胞.
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述靶基因型不含與特定 疾病或紊亂有關(guān)的遺傳突變.
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述靶基因型含有與特定 疾病或紊亂有關(guān)的遺傳突變。
16. 才艮據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所述未受精的，減 數(shù)分裂I后的二倍體生殖細(xì)胞是從雜合供體獲得的，所述雜合供體攜 帶與特定疾病或紊亂有關(guān)的突變等位基因及相應(yīng)的野生型等位基因。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述未受精的，減數(shù)分裂 I后的二倍體生殖細(xì)胞是由供體提供的，所得的HS細(xì)胞準(zhǔn)備用于有需 要的受體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述供體和受體是同一個(gè) 體，其中所述供體和受體有親緣關(guān)系，或其中所述供體和受體沒有親 緣關(guān)系。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1或13所述的方法，其中每個(gè)HS細(xì)胞系的基 因型是使用基于凝膠的檢測(cè)方法，使用非基于凝膠的檢測(cè)方法或用遺 傳標(biāo)記確定的.
20. 根據(jù)權(quán)利要求7或13所述的方法，其中所述靶免疫型是使用 血清學(xué)或分子方法確定的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述靶免疫型是通過(guò)HLA 組織分型確定的。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1, 7或13所述的方法，其中(d)進(jìn)一步包括使 分離的HS細(xì)胞分化，產(chǎn)生祖細(xì)胞和/或其它分化細(xì)胞及組織類型。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述分化是通過(guò)體外因子 指導(dǎo)的.
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述分化是通過(guò)體內(nèi)因子 指導(dǎo)的。
25. —個(gè)含有HLA分型的HS細(xì)胞系的多個(gè)群體的細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)，其 中每個(gè)HS細(xì)胞系來(lái)源于不同的供體，而且對(duì)于獨(dú)特的HLA單倍型是 純合的。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)，其中所述HS細(xì)胞系是 從不同種族的供體獲得的.
27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)，其中將儲(chǔ)存庫(kù)的內(nèi)容進(jìn)行了分類。
28. —種生產(chǎn)基因分型的純合干(HS)細(xì)胞的HS細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)的方 法，所述純合干細(xì)胞來(lái)源于多個(gè)供體，該方法包括(a)選擇供體；00確定每個(gè)供體的基因型；(c)有絲分裂激活得自每個(gè)供體的未受精的，減數(shù)分裂I后的二 倍體生殖細(xì)胞，發(fā)育成多個(gè)胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)團(tuán)都含有對(duì)于特定基因型為純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM);(d) 從得自每個(gè)供體的ICM中分離HS細(xì)胞；(e) 培養(yǎng)分離的HS細(xì)胞，獲得HS細(xì)胞系；(f) 確定每個(gè)HS細(xì)胞系的基因型；并(g) 將在(e)中獲得的每個(gè)HS細(xì)胞系的基因型分類.
29. —種生產(chǎn)免疫分型的純合干(HS)細(xì)胞的HS細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)的方 法，所述純合干細(xì)胞來(lái)源于多個(gè)供體，該方法包括(a) 選擇供體；(b) 確定每個(gè)供體的免疫型；(c) 有絲分裂激活得自每個(gè)供體的未受精的，減數(shù)分裂I后的二 倍體生殖細(xì)胞，發(fā)育成多個(gè)胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)團(tuán)都含有對(duì)于特定免 疫型為純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM);(d) 從得自每個(gè)供體的ICM中分離HS細(xì)胞；(e) 培養(yǎng)分離的HS細(xì)胞，獲得HS細(xì)胞系；(f) 確定每個(gè)HS細(xì)胞系的免疫型；并(g) 將在(e)中獲得的每個(gè)HS細(xì)胞系的免疫型分類.
30. —種生產(chǎn)基因分型和免疫分型的純合干(HS)細(xì)胞的HS細(xì)胞 儲(chǔ)存庫(kù)的方法，所述純合干細(xì)胞來(lái)源于多個(gè)供體，該方法包括(a) 選擇供體；(b) 確定每個(gè)供體的基因型和免疫型；(c) 有絲分裂激活得自每個(gè)供體的未受精的，減數(shù)分裂I后的二 倍體生殖細(xì)胞，發(fā)育成多個(gè)胚泡樣團(tuán)，其中每個(gè)團(tuán)都含有對(duì)于特定基 因型和免疫型為純合的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM);(d) 從得自每個(gè)供體的ICM中分離HS細(xì)胞；(e) 培養(yǎng)HS細(xì)胞，獲得HS細(xì)胞系；(f) 確定每個(gè)HS細(xì)胞系的基因型和免疫型；并(g) 將在(e)中獲得的每個(gè)HS細(xì)胞系的基因型和免疫型分類。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28， 29或30所述的方法，其中所述供體是哺 乳動(dòng)物。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述供體是人類。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述供體是非人類.
全文摘要
這里描述了一種生產(chǎn)純合干(HS)細(xì)胞同源群的方法，所述純合干細(xì)胞是針對(duì)免疫型和/或基因型從供體細(xì)胞預(yù)先選擇的。本發(fā)明涉及使用免疫組織相容性HS細(xì)胞進(jìn)行診斷，治療性和整容移植，并治療各種遺傳病，神經(jīng)變性疾病，創(chuàng)傷性損傷和癌癥的方法。本發(fā)明還涉及使用針對(duì)非疾病基因型預(yù)先選擇的組織相容性HS干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防性和治療性干預(yù)的方法，所述預(yù)防性和治療性干預(yù)包括但不限制于，治療性和整容移植，及各種遺傳病，神經(jīng)變性疾病和癌癥的治療。此外，本發(fā)明還涉及來(lái)源于多個(gè)供體的HS細(xì)胞的分類的移植物儲(chǔ)存庫(kù)，其中每個(gè)HS細(xì)胞對(duì)于獨(dú)特的HLA單倍型是純合的，目的是為診斷，治療和/或移植提供穩(wěn)定，可靠，廣泛的免疫組織相容性細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/073GK101310010SQ02805794
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2002年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月2日
發(fā)明者W·L·顏 申請(qǐng)人:斯坦姆榮公司