專(zhuān)利名稱(chēng)：可超分泌的肽及其制備方法和對(duì)一種或多種其他多肽的分泌形式的平行提高的制作方法
考慮到經(jīng)濟(jì)生存能力，生產(chǎn)藥物相關(guān)蛋白的方法必須使生物活性產(chǎn)物具有盡可能高的純度。在此廣泛使用酵母進(jìn)行這些相關(guān)蛋白的表達(dá)。蛋白質(zhì)如胰島素、GM-CSF(Leukine)和蛭素(Refludan)的生產(chǎn)就是基于在酵母中合成特定蛋白或其前體的基因工程方法的成功開(kāi)發(fā)實(shí)例。通常，酵母能夠直接顯著的合成蛭素，且產(chǎn)量很高，當(dāng)使用多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)(Weydemann等，Appl.Microbiol Biotechnol.44377-385，1995)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(Rosenfeld等，Protein Expr.Purif4，476-82，1996)時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到克級(jí)。
EP-A 0 324 712描述了蛭素衍生物(Refludan)，其N(xiāo)-端氨基酸為亮氨酸，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株Y79中組成型表達(dá)。EP-A0 347 781描述了一個(gè)小胰島素原(mini-proinsulin)及其在例如面包酵母中的表達(dá)。Refludan和胰島素是通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)的表達(dá)而生產(chǎn)的。
令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)如下方式蛭素衍生物和小胰島素原衍生物可以從共同的前體蛋白得到將前體蛋白通過(guò)一個(gè)堿性二肽，優(yōu)選Lys-Arg融合到一段可作為分泌信號(hào)被酵母識(shí)別的信號(hào)或引導(dǎo)序列上，并同樣地，在N-端的蛭素衍生物和小胰島素原衍生物之間引入一個(gè)能被酵母內(nèi)切蛋白酶所識(shí)別的切割位點(diǎn)。這里，也優(yōu)選堿性二肽，例如Lys-Arg。表達(dá)后，在上清液中發(fā)現(xiàn)延伸有Lys-Arg的蛭素衍生物和以胰島素B鏈的第一個(gè)氨基酸開(kāi)始的小胰島素原衍生物。令人驚訝的是，和直接的信號(hào)-小胰島素原表達(dá)相比，用該種方法得到的小胰島素原產(chǎn)量有了顯著的提高，而蛭素衍生物的產(chǎn)量基本保持不變。令人驚訝的是，這樣對(duì)于小胰島素原的生產(chǎn)，蛭素起到一種增強(qiáng)肽的作用。
能作為增強(qiáng)蛋白質(zhì)的肽通常相對(duì)較小且能在短期內(nèi)從例如腺組織中大量的、自然的分泌出來(lái)。這種類(lèi)型的肽，包括例如蛇毒或eglin C或TAP(扁虱抗凝肽)可通過(guò)極好的輸出相容性進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明也涉及這樣的蛋白。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是和已經(jīng)用于藥物的蛭素相比，此蛭素衍生物可具有相同的或更好的藥用性質(zhì)。對(duì)于這種情況，從一次相同的發(fā)酵中可能生產(chǎn)兩種或甚至更多種的藥物。這樣，所需發(fā)酵容量就減少了。這直接對(duì)生產(chǎn)成本有利。
然而，是否生產(chǎn)多種產(chǎn)品是可選擇的。例如，對(duì)Refludan的需求量比胰島素的小，這可導(dǎo)致將其中一種藥學(xué)上感興趣的物質(zhì)丟棄的方法。
為了提高產(chǎn)量，就像專(zhuān)利申請(qǐng)EP-A 0 200 655中所建議的那樣，可以通過(guò)Lys-Arg在蛭素衍生物N-端前放置一短肽序列作為信號(hào)或引導(dǎo)序列的銜接物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很明顯信號(hào)或引導(dǎo)序列的選擇也直接影響感興趣蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。這個(gè)序列的選擇是進(jìn)一步優(yōu)化的主題。位于表達(dá)盒3’末端的序列也通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定性而直接影響產(chǎn)量。這里，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也很明顯的是，可以針對(duì)每個(gè)待表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)優(yōu)化上述序列。對(duì)于合適啟動(dòng)子的選擇，這也是正確的，所述啟動(dòng)子可以具誘導(dǎo)活性或組成型活性。載體系統(tǒng)和宿主系統(tǒng)的選擇對(duì)產(chǎn)量也同樣重要。這樣，除了已經(jīng)舉例利用的面包酵母外，也可使用酵母菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)或乳克魯維酵母(K.lactis)以及載體或表達(dá)盒(在每種情況下其都針對(duì)不同的生理狀況進(jìn)行了優(yōu)化)。
允許分泌到培養(yǎng)基中的方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是感興趣蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-化學(xué)后處理較簡(jiǎn)單。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)膜過(guò)濾，可在蛭素存在時(shí)將小胰島素原濃縮，所用膜的排阻限是分子量大于10kDa的分子。這些分子被發(fā)現(xiàn)幾乎都在存留物(retentate)中。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很明顯開(kāi)發(fā)新的分離技術(shù)和新的方法步驟的組合總是可能達(dá)到對(duì)純化過(guò)程的改進(jìn)。這直接對(duì)產(chǎn)量并因此對(duì)生產(chǎn)成本有利。
本發(fā)明因此涉及下面形式的DNA分子(可替代的術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒)Px-Sx-Bn-(ZR)-轉(zhuǎn)運(yùn)肽-(Z1Z2)-蛋白(Y)-(Z1Z2)-蛋白(Ym)-T；其中表達(dá)盒編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽，該轉(zhuǎn)運(yùn)肽通過(guò)序列Z1Z2和第二蛋白相連，該蛋白又通過(guò)Z1Z2和蛋白Y1相連，Y1或者和Y相對(duì)應(yīng)或者和Y不同，且轉(zhuǎn)運(yùn)肽提高了Y和/或Ym的分泌速率，其中Px是以可得到感興趣蛋白的最優(yōu)產(chǎn)量的方式選擇的任何啟動(dòng)子DNA序列；Sx是可允許得到最優(yōu)產(chǎn)量的任何信號(hào)或引導(dǎo)序列的相應(yīng)編碼DNA；Bn是1-15個(gè)可遺傳編碼的氨基酸或是化學(xué)鍵；Z是選自L(fǎng)ys和Arg的氨基酸的密碼子；Z1是選自L(fǎng)ys和Arg的氨基酸的密碼子；Z2是選自L(fǎng)ys和Arg的氨基酸的密碼子；R是Arg密碼子；轉(zhuǎn)運(yùn)肽是編碼能有效運(yùn)輸并能夠穿過(guò)細(xì)胞膜的肽例如蛭素或蛭素衍生物的DNA序列；蛋白Y是編碼能夠被酵母菌生產(chǎn)和分泌的任何蛋白的DNA序列；蛋白Ym是編碼能夠被酵母菌生產(chǎn)和分泌的任何蛋白的DNA序列(m＝1-5)或者是化學(xué)鍵(m＝0)；T是對(duì)表達(dá)有利的非翻譯DNA序列。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是上述任何一個(gè)DNA分子所編碼的融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是含有上述DNA分子的多拷貝載體和質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是宿主細(xì)胞，其含有作為宿主細(xì)胞染色體的一部分、作為微型染色體的一部分或以染色體外方式存在的上述DNA分子或上述多拷貝載體或質(zhì)粒，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是酵母細(xì)胞，特別是選自釀酒酵母(S.cerevisiae)、乳克魯維酵母、多形漢遜氏酵母和巴斯德畢赤酵母的酵母細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是上述蛋白的發(fā)酵方法，其中
(a)使上述DNA分子、多拷貝載體或質(zhì)粒在上述宿主細(xì)胞中表達(dá)且(b)從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中分離表達(dá)的蛋白，其中特別是在發(fā)酵完成后，將pH調(diào)節(jié)到2.5-3.5以便使不需要的蛋白質(zhì)沉淀，然后將所表達(dá)的蛋白從沉淀物的上清液中分離出來(lái)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是上述方法，其中在將發(fā)酵上清液與宿主細(xì)胞分開(kāi)后，將宿主細(xì)胞重新在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將所釋放的融合蛋白從每次培養(yǎng)得到的上清液中分離出來(lái)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是上述方法，其中用于沉淀后濃縮上清液中的表達(dá)蛋白的步驟選自微量過(guò)濾、疏水作用層析和離子交換層析。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是制備胰島素的方法，其中(a)使胰島素原在上述方法中作為上述表達(dá)盒的蛋白質(zhì)(Y)表達(dá)；(b)分離步驟(a)的胰島素原并用胰蛋白酶和羧肽酶B處理；且(c)將胰島素從步驟(b)的反應(yīng)混合物中分離出來(lái)，特別地，其中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽是蛭素或蛭素衍生物，在步驟(a)或(b)后其被破壞或其生物活性喪失。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種蛋白，它是在C-末端有兩個(gè)堿性氨基酸殘基的蛭素衍生物。
蛭類(lèi)(Hirudo)中的水蛭已經(jīng)形成了例如各種凝血酶抑制劑蛭素同工型。已經(jīng)通過(guò)人工改造如改變N-末端的氨基酸對(duì)蛭素進(jìn)行了優(yōu)化以符合制藥要求(例如EP 0 324 712)。本發(fā)明包括蛭素和蛭素變體的使用。本發(fā)明特定的實(shí)施方案使用一種天然蛭素同工型(所有這些天然同工型總稱(chēng)作“蛭素”)。天然同工型有，例如Val-Val-蛭素或Ile-Thr-蛭素。本發(fā)明的其他實(shí)施方案使用天然蛭素同工型的變體。變體來(lái)自天然蛭素同工型但含有，例如，和天然同工型相比，額外的氨基酸和/或氨基酸缺失和/或氨基酸改變。蛭素變體可以含有交替的天然蛭素同工型肽片斷和新的氨基酸。蛭素變體是已知的并在例如DE 3 430 556中描述。蛭素變體可通過(guò)商業(yè)途徑以蛋白質(zhì)的形式得到(Calbiochem Biochemicals，cat.no.377-853，-950，-960)。術(shù)語(yǔ)“蛭素衍生物”指和天然蛭素至少40％同源的序列。
表達(dá)盒優(yōu)選導(dǎo)入酵母菌如釀酒酵母，乳克魯維酵母，多形漢遜氏酵母或巴斯德畢赤酵母中。上述表達(dá)盒可以以一個(gè)或多個(gè)拷貝穩(wěn)定整合到特定酵母基因組中或可以存在于染色體外的多拷貝載體中。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，很明顯該技術(shù)也可應(yīng)用于其他系統(tǒng)如動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物和植物細(xì)胞。這也是本發(fā)明的一個(gè)主題。
下面所述的表達(dá)系統(tǒng)用作例子。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，很明顯的是為了將表達(dá)盒導(dǎo)入上述所選的系統(tǒng)中，必須依據(jù)所選宿主系統(tǒng)的類(lèi)型，制作合適的重組DNA構(gòu)建體。因此，可根據(jù)所選的宿主/載體系統(tǒng)優(yōu)化工業(yè)發(fā)酵。因此，下面的實(shí)施例并非限定性的。
實(shí)施例1構(gòu)建編碼蛭素(Refludan)-Lys-Arg-小胰島素原的酵母表達(dá)質(zhì)粒起始材料為質(zhì)粒pK152(PCT/EP00/08537)、pSW3(EP-A 0 347 781)和編碼牛白介素2的重組酵母質(zhì)粒衍生物(Price等Gene 55，1987)。此酵母質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)它在酵母ADH2啟動(dòng)子控制下帶有α因子引導(dǎo)序列這一事實(shí)來(lái)分辨。該序列后面通過(guò)一KpnI限制酶識(shí)別位點(diǎn)連接牛白介素2 cDNA序列，該cDNA序列在操作后在非翻譯3’末端含有一個(gè)NcoI限制酶識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)在載體中是獨(dú)一無(wú)二的。這樣，可容易的通過(guò)KpnI/NcoI切割將此cDNA序列從質(zhì)粒中除去。由于報(bào)道的表達(dá)產(chǎn)量不錯(cuò)，可認(rèn)為剩余的3’白介素2序列(像T)具有使mRNA穩(wěn)定的作用，不需要被刪除或被酵母終止序列所代替。質(zhì)粒pK 152帶有編碼Leu-蛭素(Refludan)的DNA序列，質(zhì)粒pSW3帶有編碼小胰島素原的DNA序列。編碼蛭素-LysArg-小胰島素原的基因序列首先通過(guò)PCR技術(shù)制備。為此，用ExpediteTmDNA合成系統(tǒng)制備4個(gè)引物。
i.hir_insfkr(SEQ ID NO1，編碼的蛋白片斷SEQ ID NO2)I P E E Y L Q K R F V N Q H L C5′-ATCCCTGAGGAATACCTTCAGAAGCGATTTGTTAACCAACACTTGTGTGG-3′59 60 61 62 63 64 65 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7ii.hir_insrevkr(SEQ ID NO3)5′-CCTCACAAGTG TTGGTTAACA AATCGCTTCT GAAGGTATTC CTCAGGGAT-3′iii.hirf1(SEQ ID NO4，編碼的蛋白片斷SEQ ID NO5)L T Y T D C5′-TTTTTTTGGATCCTTTGGATAAAAGACTTACGTATACTGACTGCACiv.insncolrev(SEQ ID NO6)5′-TTTTTTCCAT GGGTCGACTATCAG引物hir_insfkr描述了蛭素末端氨基酸(59-65)密碼子和胰島素序列B1-B7之間通過(guò)Lys-Arg銜接物進(jìn)行的連接。引物hir_insrevkr是其100％互補(bǔ)物。引物hirf1編碼延伸到KpnI切割位點(diǎn)的蛭素基因起始部分(見(jiàn)EP-A 0 324 712中的描述)。
引物insncolrev顯示根據(jù)EP-A 0 347 781的合成小胰島素原的3’端。用引物對(duì)hirf1/hir_insrevkr及作為模板的質(zhì)粒pK 152的DNA和引物對(duì)hir_insfkr/insncolrev及作為模板的質(zhì)粒pSW3的DNA進(jìn)行兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)在100μl PCR緩沖液中進(jìn)行，在每種情況下緩沖液中含有200nmol引物，1μl聚合酶和100ng載體。步驟1是在95℃孵育2分鐘。然后接著進(jìn)行25輪每一輪為95℃30秒，55℃30秒和72℃30秒的循環(huán)。最后一次循環(huán)后在72℃孵育3分鐘，然后停止反應(yīng)。
由于引物hir_insrevkr和hir_insfkr 100％的互補(bǔ)，兩個(gè)DNA產(chǎn)物根據(jù)上述序列相重疊，以致在第三個(gè)反應(yīng)中，使用前兩個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板并使用引物hirf1和insncolrev所生成的DNA片斷編碼由Lys-Arg分開(kāi)的蛭素和小胰島素原。PCR片斷用酶KpnI和NcoI消化后用T4連接酶反應(yīng)將其插入用Kpn1/NcoI切開(kāi)的pαADH2載體中。和EP-A 0 347 781的實(shí)施例7相似，用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株MM294。然后從兩個(gè)克隆中分離質(zhì)粒DNA并通過(guò)DNA序列分析表征。確定了插入的DNA序列后，根據(jù)所述實(shí)施例，將質(zhì)粒DNA制備物用于轉(zhuǎn)化面包酵母菌株Y79細(xì)胞。然而，和所述實(shí)施例不同，當(dāng)使用pαADH2載體時(shí)，導(dǎo)入載體后進(jìn)行trp1-1突變互補(bǔ)的選擇。對(duì)于另一個(gè)對(duì)照，從酵母轉(zhuǎn)化體中重新分離質(zhì)粒DNA并通過(guò)限制性分析手段進(jìn)行分析。構(gòu)建的表達(dá)載體表示為pADH2Hir_KR_Ins。根據(jù)實(shí)施例4進(jìn)行表達(dá)。
實(shí)施例2編碼蛭素(Refludan)-Lys-Arg-胰島素B鏈-Lys-Arg-胰島素A鏈的酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建專(zhuān)利申請(qǐng)EP-A 0 195 691描述的胰島素原衍生物可以含有二肽XY，其中X和Y每一個(gè)各對(duì)應(yīng)于Lys或Arg，該二肽作為胰島素B和A鏈的銜接物。下面的實(shí)施例描述了用于這種胰島素原衍生物的表達(dá)載體的制備方法。例如，選擇編碼B鏈-Lys-Arg-A鏈形式的胰島素原衍生物的DNA序列并據(jù)此進(jìn)行合成。
根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行基因片斷的合成。所用寡核苷酸序列為hirf1和insncolrev。寡核苷酸B_KR_Af1和B_KR_Arev1從頭合成。
B_KR_Af1的序列為(SEQ ID NO7)5′CTTCTACACTCCAAAGACGAAACGCGGTATCG-3′B_KR_Arev1的序列為(SEQ ID NO8)5′CAACATTGTTCAACGATACCGCGTTTCGTCTTT-3′
兩個(gè)引物中用黑體表示的部分顯示了部分重疊的序列。除了6個(gè)帶下劃線(xiàn)的核苷酸外，兩個(gè)引物都和EP-A 0 347 781中的小胰島素原序列精確配對(duì)。帶下劃線(xiàn)的部分和Lys及Arg密碼子對(duì)應(yīng)。根據(jù)實(shí)施例1構(gòu)建的質(zhì)粒pADH2Hir_KR_Ins的DNA在PCR中用作模板。
如實(shí)施例1中所描述的，用引物對(duì)hirf1/B_KR_Arev和insncolrev/B_KR_Af1進(jìn)行兩個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。每個(gè)反應(yīng)中的模板都是實(shí)施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pADH2Hir_KR_Ins DNA。在第三PCR中，引物對(duì)為hirf1和insncol，前兩個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板。第三PCR的反應(yīng)產(chǎn)物用NcoI/Sall切割并插入到打開(kāi)的pαADH2載體中。序列和限制性分析后，將正確的質(zhì)粒稱(chēng)為pADHHirKR_B_KR_A。
實(shí)施例3編碼蛭素-Lys-Arg-猿胰島素原的酵母質(zhì)粒的構(gòu)建專(zhuān)利申請(qǐng)EP-A 489 780描述了一個(gè)質(zhì)粒pINT90d，它含有猿胰島素原的cDNA(Wetekam等，Gene 19，p.179-183，1982)。所述質(zhì)粒和質(zhì)粒pK152的DNA用作模板。使用實(shí)施例1中描述的引物hirf1，并合成另外三個(gè)引物。
引物insncorev與克隆在pINT90d中的胰島素基因的3’區(qū)反向結(jié)合，其序列為5′-TTTTTTCCATGGTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3′(SEQ ID NO9)有下劃線(xiàn)的序列表示限制性?xún)?nèi)切酶NcoI的識(shí)別位點(diǎn)。
引物hir_insfkr序列為5′-ATCCCTGAGG AATACCTTCA GAAGCGATTT GTGAACCAGC ACCTGTGCGG C-3′(SEQ ID NO10)這里用黑體所示的核苷酸表示蛭素和胰島素原之間的Lys-Arg銜接物。
引物hir_insrevkr和引物hir_inskr完全互補(bǔ)，其序列為5′-GCCGCACAGG TGCTGGTTCA CAAATCGCTT CTGAAGGTAT TCCTCAGGGA T-3′(SEQ ID NO11)類(lèi)似于實(shí)施例1，進(jìn)行兩個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物對(duì)hirf1/hir_insrevkr和質(zhì)粒pK152 DNA反應(yīng)，引物對(duì)hir_insfkr/insncorev和質(zhì)粒pINT90d DNA反應(yīng)。如實(shí)施例1所描述的，兩個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物用作第三PCR的模板，引物對(duì)為hirf1/insncorev。本反應(yīng)的DNA產(chǎn)物包括蛭素-Lys-Arg-胰島素原的序列。之后將其用酶NcoI和KpnI切割，并類(lèi)似于實(shí)施例1，將其插入質(zhì)粒pαADH2中。由此可以構(gòu)建任何天然胰島素原衍生物的表達(dá)載體。
實(shí)施例4重組產(chǎn)物的表達(dá)將表達(dá)分為兩個(gè)階段。首先，在酵母基本培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。每升培養(yǎng)基中含有下面的成分6.7g -酵母氮源(yeast nitrogen base)(無(wú)氨基酸)5.0g -酪蛋白氨基酸(無(wú)維生素)0.008％-腺嘌呤0.008％-尿嘧啶2％-葡萄糖主要培養(yǎng)基或表達(dá)培養(yǎng)基用預(yù)培養(yǎng)物試樣接種。
主要培養(yǎng)基每升含有10g-酵母抽提物20g-蛋白胨0.008％-腺嘌呤0.008％-尿嘧啶4％-葡萄糖使用上述培養(yǎng)基在搖瓶中用下面的方法進(jìn)行表達(dá)將過(guò)夜培養(yǎng)的預(yù)培養(yǎng)物0.3ml用80ml預(yù)熱的培養(yǎng)基稀釋并在30℃劇烈搖動(dòng)下孵育約24小時(shí)。在每種情況下，測(cè)定光密度后將用這種方法所產(chǎn)生的1毫升培養(yǎng)物離心，除去細(xì)胞后，將上清液凍干并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。具生物活性的蛭素的含量通過(guò)凝血酶抑制分析進(jìn)行測(cè)定。
一個(gè)備選的發(fā)酵方案用于通過(guò)過(guò)濾或小心離心而移出的細(xì)胞。在從培養(yǎng)基中分離感興趣蛋白的同時(shí)，將移出的細(xì)胞放入含有醇和不超過(guò)0.5％的葡萄糖作為碳源的新鮮預(yù)熱主要培養(yǎng)基中，這樣發(fā)酵可以繼續(xù)進(jìn)行而不中斷。這一步可以重復(fù)多達(dá)5次。
實(shí)施例5凝血酶抑制試驗(yàn)按照Grieβbach等的方法測(cè)定蛭素的濃度(Thrombosis Research 37，pp.347-350，1985)。為此，在測(cè)定時(shí)包括特定量的Refludan標(biāo)準(zhǔn)以建立校準(zhǔn)曲線(xiàn)，以mg/l表示的產(chǎn)量可直接由該曲線(xiàn)確定。
實(shí)施例6巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中蛭素-Lys-Arg-小胰島素原融合蛋白的克隆和表達(dá)Invitrogen出售用巴斯德畢赤酵母作為宿主系統(tǒng)制備重組蛋白的克隆和表達(dá)試劑盒。為此，提供了關(guān)于制備和隨后表達(dá)巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)以生產(chǎn)所需重組蛋白的詳細(xì)技術(shù)方案，因此在使用所述方案時(shí)，只需對(duì)編碼所需蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建進(jìn)行描述即可。使用了EasySelectTMPichia表達(dá)試劑盒(目錄號(hào)K1740-01)。
pPICZαA載體是試劑盒的一部分。通過(guò)限制性酶XhoI和SacII將載體打開(kāi)使得可以與實(shí)施例1類(lèi)似地將感興趣蛋白添加到α因子引導(dǎo)序列上并檢測(cè)蛋白分泌到上清液中的情況。克隆需要兩個(gè)引物。引物pichia_H_If1(SEQ ID NO12)序列為5′-TTTTTTTCTCGAGAAAAGA CTTACGTATACTGAC-3′XhoI Hir1Hir2等引物pichia_H_Irev2(SEQ ID NO13)序列為5′-TTTTTGGCGCCGAATTCACTATTAGTTACAGTAGTTTTCC-3′SacII EcoRI A21所用模板是質(zhì)粒pADH2Hir_KR_Ins的DNA。用這兩個(gè)引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR，所得DNA產(chǎn)物含有被XhoI和SacII整合位點(diǎn)延長(zhǎng)的蛭素-Lys-Arg-小胰島素原序列。適當(dāng)?shù)厍懈頓NA產(chǎn)物及分離片斷后，所述片斷可以通過(guò)T4 DNA連接酶反應(yīng)插入到打開(kāi)的載體DNA中。和廠(chǎng)家方案稍有不同，實(shí)施例1中所描述的大腸桿菌株MM294通過(guò)連接混合物轉(zhuǎn)化，重組菌落通過(guò)zeocine選擇平板進(jìn)行篩選。從克隆中重新分離質(zhì)粒DNA，然后通過(guò)限制性和DNA序列分析進(jìn)行鑒定。按照廠(chǎng)家的方案，用以此方式構(gòu)建的質(zhì)粒制備用于生產(chǎn)所述肽的巴斯德畢赤酵母表達(dá)克隆。
實(shí)施例7小胰島素原和蛭素的純化純化需要在早期分離這兩個(gè)蛋白質(zhì)。表達(dá)完成后，通過(guò)分析性RP-HPLC對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行分析。和大多數(shù)其他因?yàn)榻湍讣?xì)胞的自發(fā)溶解或者分泌而在上清液中出現(xiàn)的多肽不同，這兩個(gè)蛋白，蛭素和小胰島素原在pH2.5-3時(shí)并不發(fā)生沉淀。因此將培養(yǎng)基適度酸化，然后在沉淀完成后通過(guò)離心除去沉淀物和細(xì)胞。離心后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基到pH3.5-7，通過(guò)疏水作用層析，例如通過(guò)利用裝有Diaion HP20材料的層析柱將蛭素和小胰島素原這兩個(gè)級(jí)分互相分開(kāi)。然后可根據(jù)EP-A 0 549 915將蛭素從含蛭素的級(jí)分中分離出來(lái)，根據(jù)EP-A 0 347 781將胰島素從含小胰島素原的級(jí)分中分離出來(lái)。
實(shí)施例8從小胰島素原制備胰島素在表達(dá)期結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH6.8，攪拌下加入胰蛋白酶使其終濃度為4-8mg/l孵育約4小時(shí)后，將用這種方法處理的發(fā)酵培養(yǎng)液調(diào)節(jié)至pH2.5-3。沉淀1-6小時(shí)后，除去沉淀物。然后通過(guò)離子交換層析，例如通過(guò)在含有50mM乳酸和30％異丙醇的緩沖液(pH3.5)中在S-Sepharose上進(jìn)行層析，分離所形成的單-Arg-胰島素。洗脫使用的NaCl梯度為0.05-0.5M。將含有產(chǎn)物的級(jí)分用水進(jìn)行1∶1稀釋后加入ZnCl2以形成0.1％強(qiáng)度的ZnCl2溶液。單-Arg-胰島素在pH6.8沉淀，然后例如可以根據(jù)EP-A 0 324 712將其轉(zhuǎn)化為胰島素。
實(shí)施例9過(guò)濾后從小胰島素原制備胰島素在表達(dá)期結(jié)束時(shí)，通過(guò)在pH2.5到3沉淀，移出細(xì)胞和上清液組分。然后用排阻限為10kDa的膜進(jìn)行過(guò)濾以濃縮培養(yǎng)基。和蛭素衍生物相似，小-胰島素原大量出現(xiàn)在存留物中，然后可根據(jù)實(shí)施例8將其加工成胰島素。
序列表序列表<110>安萬(wàn)特醫(yī)藥德國(guó)有限公司<120>可超分泌的肽及其制備方法和對(duì)一種或多種其他多肽的分泌形式的平行提高<130>DEAV2001/0007<140>10108100.6<141>2001-02-20<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述hir_insfkr<400>1atccctgagg aataccttca gaagcgattt gttaaccaac acttgtgtgg50<210>2<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述蛋白hir_insfkr<400>2Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys1 5 10 15<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述hir_insrevkr<400>3cctcacaagt gttggttaac aaatcgcttc tgaaggtatt cctcagggat50<210>4<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述hirf1<400>4tttttttgga tcctttggat aaaagactta cgtatactga ctgcac46<210>5<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述蛋白hirf1<400>5Leu Thr Tyr Thr Asp Cys1 5<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述B_KR_Af1<400>7cttctacact ccaaagacga aacgcggtat cg 32<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述B_KR_Arevl<400>8caacattgtt caacgatacc gcgtttcgtc ttt 33<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述hir_insfkr
<400>10atccctgagg aataccttca gaagcgattt gtgaaccagc acctgtgcgg c 51<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述hir_insrevkr<400>11gccgcacagg tgctggttca caaatcgctt ctgaaggtat tcctcaggga t 51<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述pichia_H_1f1<400>12tttttttctc gagaaaagac ttacgtatac tgac 34<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述pichia_H_1rev2<400>13tttttggcgc cgaattcact attagttaca gtagttttcc 40
權(quán)利要求
1.如下形式的DNA分子Px-Sx-Bn-(ZR)-轉(zhuǎn)運(yùn)肽-(Z1Z2)-蛋白(Y)-(Z1Z2)-蛋白(Ym)-T；其中該DNA分子編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽，該轉(zhuǎn)運(yùn)肽通過(guò)序列Z1Z2和第二蛋白相連，該蛋白又通過(guò)Z1Z2和蛋白Y1相連，Y1或者和Y相對(duì)應(yīng)或者可以和Y不同，且轉(zhuǎn)運(yùn)肽提高了Y和/或Ym的分泌速率，其中Px是以能得到感興趣蛋白的最優(yōu)產(chǎn)量的方式所選出的任何啟動(dòng)子DNA序列；Sx是能允許得到最優(yōu)產(chǎn)量的任何信號(hào)或引導(dǎo)序列的相應(yīng)編碼DNA；Bn是1-15個(gè)可遺傳編碼的氨基酸或是化學(xué)鍵；Z是選自L(fǎng)ys和Arg的氨基酸的密碼子；Z1是選自L(fǎng)ys和Arg的氨基酸的密碼子；Z2是選自L(fǎng)ys和Arg的氨基酸的密碼子；蛋白Ym是編碼能夠被酵母菌生產(chǎn)和分泌的任何蛋白的DNA序列(m＝1-5)或者是化學(xué)鍵(m＝0)；R是精氨酸密碼子；轉(zhuǎn)運(yùn)肽是編碼能有效運(yùn)輸并能夠穿過(guò)細(xì)胞膜的肽的DNA序列；蛋白Y是編碼能夠被酵母菌生產(chǎn)和分泌的任何蛋白的DNA序列，并且當(dāng)Ym不是化學(xué)鍵時(shí)，蛋白Y的生物活性不會(huì)由于堿性二肽延伸而受損，或者其允許通過(guò)羧肽酶降解此延伸部分；T是對(duì)表達(dá)有利的非翻譯DNA序列。
2.權(quán)利要求1的DNA分子，其中轉(zhuǎn)運(yùn)肽是蛭素或者蛭素衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA分子，其中(Y)是藥物相關(guān)蛋白，選自胰島素原及其衍生物、白介素、淋巴因子、干擾素和來(lái)自凝血系統(tǒng)的因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。
5.含有權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的DNA分子的多拷貝載體。
6.含有權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的DNA分子的質(zhì)粒。
7.宿主細(xì)胞，其含有作為染色體的一部分、作為微型染色體的一部分或以染色體外形式存在的權(quán)利要求1到3的DNA分子、權(quán)利要求5的多拷貝載體和/或權(quán)利要求6的質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其選自釀酒酵母、乳克魯維酵母、多形漢遜氏酵母和巴斯德畢赤酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的蛋白的發(fā)酵方法，其中(a)使權(quán)利要求1到3之任一項(xiàng)的DNA分子、權(quán)利要求5的多拷貝載體或權(quán)利要求6的質(zhì)粒在根據(jù)權(quán)利要求7到9之任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞中表達(dá)；且(b)將表達(dá)的蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中分離出來(lái)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中發(fā)酵完成后，調(diào)節(jié)pH到2.5-3.5以沉淀不想要的蛋白質(zhì)并且從沉淀后的上清液中分離表達(dá)的蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其從宿主細(xì)胞中分離出發(fā)酵上清液后，將宿主細(xì)胞反復(fù)用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，從每次培養(yǎng)過(guò)程得到的上清液中分離所釋放的融合蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求10到12之任一項(xiàng)的方法，其中用于在沉淀后濃縮上清液中的表達(dá)蛋白的步驟選自微量過(guò)濾、疏水作用層析和離子交換層析。
14.制備胰島素的方法，其中(a)用根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法以權(quán)利要求1的表達(dá)盒的蛋白(Y)的形式表達(dá)胰島素原，(b)將步驟(a)中的胰島素原分離并用胰蛋白酶和羧肽酶B處理，且(c)從步驟(b)的反應(yīng)混合物中分離胰島素。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中轉(zhuǎn)運(yùn)肽是蛭素或者蛭素衍生物，其在步驟(a)或(b)后被破壞或者生物活性喪失。
16.根據(jù)權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白是C-末端有兩個(gè)堿性氨基酸殘基的蛭素衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及形式為P
文檔編號(hào)C12R1/645GK1527882SQ02806848
公開(kāi)日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2002年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月20日
發(fā)明者P·哈伯曼, P 哈伯曼 申請(qǐng)人:安萬(wàn)特醫(yī)藥德國(guó)有限公司